معلومة

لماذا نستخدم الحمض النووي الريبي (cRNA) بدلاً من الحمض النووي الريبي (RNA) المستخرج الأولي في تقنية ميكروأري؟

لماذا نستخدم الحمض النووي الريبي (cRNA) بدلاً من الحمض النووي الريبي (RNA) المستخرج الأولي في تقنية ميكروأري؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أعيد تلخيص الامتحان في الترانسكريبتوميكس وتعثرت في سؤال حول ميكروأري. لذلك ، سير العمل العادي لدينا هو

  1. استخراج الحمض النووي الريبي من الخلايا
  2. توليد (كدنا) من الحمض النووي الريبي الأولي باستخدام النسخ العكسي
  3. نسخ كرنا من [كدنا]
  4. تسمية الحمض النووي الريبي مع البيوتين
  5. البيوتين المسمى cRNA
  6. تهجين إلى لوحة ، والمسح والكمي

لذا فإن السؤال هو - بما أننا نستخدم RNA لخطوات التحويل الإضافية ، فلماذا يجب إجراء النسخ العكسي + النسخ لإنتاج الحمض النووي الريبي (cRNA) بينما يمكننا فقط استخدام الحمض النووي الريبي الأولي؟

هل الـ cRNA أكثر استقرارًا من الـ RNA؟ أم أننا بالفعل نصنع الحمض الريبي النووي النقال المسمى باستخدام النيوكليوتيدات المسمى؟


بعد التوضيح عبر التعليقات على سؤال OPs:

1) الإجراء الذي تصفه هو ليس لتجارب ميكروأري RNA القياسية ، من أجل olgionucleotide ميكروأري. هذا النوع من الشرائح خاص لأنه يحتوي على مجسات متعددة لكل جين للسماح باكتشاف الميزات الخاصة (مثل الطفرات ، التضفير البديل ، ...).

2) لم يتم ذكر سبب توليد (كدنا) مع النسخ العكسي اللاحق والترابط الحيوي في مصدر البروتوكول الاختياري ، ولكن هناك بعض المزايا المحتملة:

  • تضخيم المادة: يمكن تضخيم (كدنا) بسهولة ، مما يجعل من السهل تحليل العينات ذات العائد المنخفض من الحمض النووي الريبي ، أو الجينات ذات مستويات التعبير المنخفضة أو تحليل العينة نفسها على شرائح متعددة.

  • الحساسية: قد تستخدم مصفوفات قليل النوكليوتيدات مجسات قصيرة جدًا (10-25 قاعدة) ، والتي قد لا تكون قراءات التألق لها حساسة بدرجة كافية. يمكن أن يؤدي التضمين الحيوي لقاعدة RNA معينة (عن طريق استخدام NTPs مسبقة المعالجة بالبيوتين أثناء النسخ العكسي) إلى إعطاء "علامات" متعددة على كل جزء ، والتي يمكن قراءتها باستخدام إشارات مقترنة بالستربتافيدين. بالإضافة إلى ذلك ، سيسمح هذا لقوة الإشارة بالتغير في الاستجابة لبعض تغيرات النيوكلوتايد / الطفرات.


بقلمWYSIWYG

تخميني هو أن cDNA النهائي بعد إجراء RT-PCR (وليس الخيط الأول) الذي تقطعت به السبل مزدوجة يتم نسخه لصنع ssRNA والذي يمكن استخدامه بعد ذلك كمسبار. ستعمل ssDNA أيضًا ولكن تخليق cDNA متبوعًا بـ PCR لن ينتج ssDNA. يمكنك ببساطة استخدام الخصلة الأولى بعد العلاج الإشعاعي لكن التركيز سيكون أقل. باستخدام مكتبة cDNA ، يمكنك إنتاج الكثير من الحمض النووي الريبي باستخدام IVT.


النسخ العكسي لتفاعل البوليميراز المتسلسل

النسخ العكسي لتفاعل البوليميراز المتسلسل (RT-PCR) هي تقنية معملية تجمع بين النسخ العكسي للحمض النووي الريبي إلى الحمض النووي (يسمى في هذا السياق DNA التكميلي أو cDNA) وتضخيم أهداف معينة من الحمض النووي باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). [1] وهي تستخدم في المقام الأول لقياس كمية معينة من الحمض النووي الريبي. يتم تحقيق ذلك من خلال مراقبة تفاعل التضخيم باستخدام الفلورة ، وهي تقنية تسمى PCR في الوقت الحقيقي أو PCR الكمي (qPCR). يتم استخدام RT-PCR و qPCR معًا بشكل روتيني لتحليل التعبير الجيني والقياس الكمي للحمض النووي الريبي الفيروسي في الأبحاث والإعدادات السريرية.

أدى الارتباط الوثيق بين RT-PCR و qPCR إلى استخدام مجازي لمصطلح qPCR ليعني RT-PCR. قد يكون هذا الاستخدام محيرًا ، [2] حيث يمكن استخدام RT-PCR بدون qPCR ، على سبيل المثال لتمكين الاستنساخ الجزيئي أو التسلسل أو الاكتشاف البسيط لـ RNA. على العكس من ذلك ، يمكن استخدام qPCR بدون RT-PCR ، على سبيل المثال لتحديد رقم نسخة قطعة معينة من DNA.


Bowtell ، D.D. الخيارات المتاحة - من البداية إلى النهاية - للحصول على بيانات التعبير بواسطة ميكروأري. طبيعة الجينات. 21, 25–32 (1999).

سينغ جاسون ، إس وآخرون. التصنيع بدون قناع لمصفوفات قليلة النوكليوتيد الدقيقة الموجهة بالضوء باستخدام مصفوفة المرآة الدقيقة الرقمية. Nature Biotechnol. 17, 974–978 (1999).

ليبشوتز ، آر جيه ، فودور ، إس بي ، جينجيراس ، تي آر. & amp Lockhart ، D.J. عالية الكثافة صفائف قليل النوكليوتيد الاصطناعية. طبيعة الجينات. 21, 20–24 (1999).

هيوز ، T.R. وآخرون. تنميط التعبير باستخدام مصفوفات ميكروية ملفقة بواسطة مركب قليل النوكليوتيد بالحبر النفاث. Nature Biotechnol. 19, 342–347 (2001).

بولاك ، جي آر وآخرون. التحليل على مستوى الجينوم لتغييرات رقم نسخ الحمض النووي باستخدام المصفوفات الدقيقة (كدنا). طبيعة الجينات. 23, 41–46 (1999).

ألبرتسون ، د. وآخرون. يحدد التعيين الكمي لهيكل amplicon بواسطة مصفوفة CGH CYP24 كمرشح للجين الورمي. طبيعة الجينات. 25, 144–146 (2000).

Snijders ، A.M. وآخرون. تجميع المصفوفات الدقيقة لقياس الجينوم على مستوى عدد نسخ الحمض النووي. طبيعة الجينات. 29, 263–264 (2001).

بينكل ، د. وآخرون. تحليل عالي الدقة لتباين عدد نسخ الحمض النووي باستخدام التهجين الجيني المقارن إلى المصفوفات الدقيقة. طبيعة الجينات. 20, 207–211 (1998).

هايوارد ، ري. وآخرون. المصفوفات الدقيقة للحمض النووي بالبندقية والتعبير الجيني الخاص بالمرحلة في المتصورة المنجلية ملاريا. مول. ميكروبيول. 35, 6–14 (2000).

السيد ، N.M. ، Hegde ، P. ، Quackenbush ، J. ، Melville ، S.E. & amp Donelson ، J.E. جينوم المثقبيات الأفريقي. كثافة العمليات J. باراسيتول. 30, 329–345 (2000).

لي ، جي إم ، ويليامز ، إم إي ، تينجي ، إس. & amp Rafalski، J.A. يتغير تحديد صفيف الحمض النووي للتعبير الجيني أثناء تطور جنين الذرة. Funct. تكامل. علم الجينوم 2, 13–27 (2002).

Osoegawa ، K. et al. مكتبة للكروموسوم الاصطناعي البكتيري لتسلسل الجينوم البشري الكامل. الدقة الجينوم. 11, 483–496 (2001).

Halgren ، R.G. ، Fielden ، M.R. ، Fong ، CJ & amp Zacharewski ، T.R. تقييم هوية الاستنساخ وإخلاص التسلسل لـ 1189 من استنساخ IMAGE (كدنا). الدقة الأحماض النووية. 29, 582–588 (2001).

نايت ، ج. عندما تكون الرقائق معطلة. طبيعة سجية 410, 860–861 (2001).

Bowtell ، D.D. & أمبير سامبروك ، ج. المصفوفات الدقيقة للحمض النووي: دليل الاستنساخ الجزيئي (مطبعة مختبر كولد سبرينغ هاربور ، كولد سبرينغ هاربور ، نيويورك ، 2002).

Relogio، A.، Schwager، C.، Richter، A.، Ansorge، W. & amp Valcarcel، J. الدقة الأحماض النووية. 30، e51 (2002).

Rouillard ، J.M. ، Herbert ، CJ & amp Zuker ، M. OligoArray: تصميم oligonucleotide على نطاق الجينوم للمصفوفات الدقيقة. المعلوماتية الحيوية 18, 486–487 (2002).

ديريسي ، جيه إل ، آير ، ف.ر. & أمبير براون ، ص. استكشاف التحكم الأيضي والجيني للتعبير الجيني على نطاق الجينوم. علم 278, 680–686 (1997).

وي ، واي وآخرون. التنميط التعبير الجيني بوساطة ميكروأري عالي الكثافة الإشريكية القولونية. J. باكتيريول. 183, 545–556 (2001).

هيغده ، ب وآخرون. دليل موجز لتحليل ميكروأري (كدنا). التقنيات الحيوية 29, 548–556 (2000).

شينا ، إم وآخرون. تحليل الجينوم البشري الموازي: رصد التعبير القائم على ميكروأري لـ 1000 جين. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 93, 10614–10619 (1996).

Schena، M.، Shalon، D.، Davis، R.W. & amp Brown، P.O. المراقبة الكمية لأنماط التعبير الجيني باستخدام مصفوفة ميكروأري للحمض النووي التكميلية. علم 270, 467–470 (1995).

بيرتوتشي ، ف. وآخرون. قضايا الحساسية في قياسات التعبير القائمة على صفيف الحمض النووي وأداء المصفوفات الدقيقة من النايلون للعينات الصغيرة. همم. مول. جينيه. 8, 1715–1722 (1999).

يو ، هـ وآخرون. تقييم لأداء المصفوفات الدقيقة (كدنا) للكشف عن التغيرات في تعبير الرنا المرسال العالمي. الدقة الأحماض النووية. 29، E41 (2001).

وانغ ، إكس. ، غوش ، إس ، أمبير جو ، إس دبليو. مراقبة الجودة الكمية في معالجة الصور ميكروأري والحصول على البيانات. الدقة الأحماض النووية 29، E75 (2001).

لوك ، سي وآخرون. تحليل الجينات الدقيقة لآفات التصلب المتعدد ينتج أهدافًا جديدة تم التحقق من صحتها في التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي. نيتشر ميد. 8, 500–508 (2002).

علي زاده ، أ. وآخرون. أنواع مميزة من ورم الغدد الليمفاوية للخلايا البائية الكبيرة المنتشرة التي تم تحديدها من خلال التنميط التعبير الجيني. طبيعة سجية 403, 503–511 (2000).

بيتنر ، إم وآخرون. التصنيف الجزيئي للورم الميلانيني الخبيث الجلدي عن طريق التنميط الجيني للتعبير. طبيعة سجية 406, 536–540 (2000).

Dhanasekaran ، S.M. وآخرون. ترسيم المؤشرات الحيوية النذير في سرطان البروستاتا. طبيعة سجية 412, 822–826 (2001).

غولوب ، ت. وآخرون. التصنيف الجزيئي للسرطان: اكتشاف الصنف والتنبؤ بالفئة عن طريق مراقبة التعبير الجيني. علم 286, 531–537 (1999).

هيدنفالك ، آي وآخرون. ملامح التعبير الجيني في سرطان الثدي الوراثي. إنجل. جيه ميد. 344, 539–548 (2001).

شيب ، ماجستير وآخرون. انتشر التنبؤ بنتيجة سرطان الغدد الليمفاوية للخلايا البائية من خلال التنميط الجيني للتعبير والتعلم الآلي الخاضع للإشراف. نيتشر ميد. 8, 68–74 (2002).

سورلي ، تي وآخرون. تميز أنماط التعبير الجيني لسرطان الثدي الفئات الفرعية للورم مع الآثار السريرية. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 98, 10869–10874 (2001).

فانت فير ، إل جيه وآخرون. تنميط التعبير الجيني يتنبأ بالنتائج السريرية لسرطان الثدي. طبيعة سجية 415, 530–536 (2002).

Volm ، M. ، Koomagi ، R. ، Mattern ، J. & amp Efferth ، T. ملف تعريف التعبير عن الجينات في سرطانات الرئة ذات الخلايا غير الصغيرة من المرضى الباقين على قيد الحياة على المدى الطويل. كلين. الدقة السرطان. 8, 1843–1848 (2002).

ميكي ، آر وآخرون. تحديد مسارات النمو والتمثيل الغذائي في الجسم الحي عن طريق التنميط باستخدام مجموعة RIKEN المكونة من 18،816 صفيفات (كدنا) للماوس مخصب بطول كامل. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 98, 2199–2204 (2001).

آير ، ف. وآخرون. برنامج النسخ في استجابة الخلايا الليفية البشرية للمصل. علم 283, 83–87 (1999).

لو ، أ. وآخرون. يحدد تحليل جديد للترسيب المناعي للكروماتين والمصفوفة (CIA) الحمض النووي نيوسنترومير المرتبط بـ 460 كيلو بايت CENP-A. الدقة الجينوم. 11, 448–457 (2001).

شانون ، م. وأمبير راو ، س النسخ. من الرقائق والرقائق. علم 296, 666–669 (2002).

Ahrendt، S.A et al. تحليل تسلسل p53 السريع في سرطان الرئة الأولي باستخدام مجموعة مسبار قليل النوكليوتيد. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 96, 7382–7387 (1999).

Lindblad-Toh ، K. et al. تحليل فقدان الزيجوت غير المتجانسة لسرطان الرئة صغير الخلايا باستخدام مصفوفات تعدد الأشكال أحادية النوكليوتيدات. Nature Biotechnol. 18, 1001–1005 (2000).

Lindblad-Toh ، K. et al. اكتشاف وتنميط جيني واسع النطاق لتعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة في الفأر. طبيعة الجينات. 24, 381–386 (2000).

Ziauddin، J. & amp Sabatini، D.M. المصفوفات الدقيقة للخلايا التي تعبر عن cDNAs المحددة. طبيعة سجية 411, 107–110 (2001).

كير ، عضو الكنيست & amp تشرشل ، ج. التصميم الإحصائي وتحليل بيانات ميكروأري للتعبير الجيني. جينيت الدقة. 77, 123–128 (2001).

دودلي ، إيه إم ، آخ ، جيه ، ستيفن ، ماجستير وأمبير تشيرش ، جي إم. قياس التعبير المطلق باستخدام المصفوفات الدقيقة مع عينة مرجعية معايرة ونطاق شدة إشارة ممتد. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 99, 7554–7559 (2002).

هيل ، أ. وآخرون. تقييم إجراءات التطبيع لبيانات صفيف قليل النوكليوتيد بناءً على عناصر تحكم الحمض الريبي النووي النقال المسننة. جينوم بيول. 2، Research0055 (2001).

يانغ ، ي. وآخرون. التطبيع لبيانات ميكروأري (كدنا): طريقة مركبة قوية تعالج التباين المنهجي لشريحة واحدة ومتعددة. الدقة الأحماض النووية. 30، e15 (2002).

فان جيلدر ، ر. وآخرون. تم تصنيع الحمض النووي الريبي المضخم من كميات محدودة من (كدنا) غير المتجانسة. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 87, 1663–1667 (1990).

Karsten ، S.L. ، Van Deerlin ، V.M. ، Sabatti ، C. ، Gill ، L.H. & amp Geschwind ، D.H. تقييم لتضخيم إشارة التيراميد وأرشفة الأنسجة الثابتة والمجمدة في تحليل التعبير الجيني ميكروأري. الدقة الأحماض النووية. 30، E4 (2002).

Colantuoni ، C. ، Henry ، G. ، Zeger ، S. & amp Pevsner ، J. يعني التطبيع المحلي لشدة إشارة عنصر ميكروأري عبر سطح مصفوفة: مراقبة الجودة وتصحيح القطع الأثرية المكانية المنتظمة. التقنيات الحيوية 32, 1316–1320 (2002).

ستويكرت ، سي جيه ، كاوستن ، إتش سي. & أمبير الكرة ، C.A. قواعد بيانات ميكروأري: المعايير والأنطولوجيا. طبيعة الجينات. 32, 469–473 (2002).

سال ، إل إتش وآخرون. بيئة برمجيات BioArray: منصة لإدارة وتحليل شامل لبيانات ميكروأري. جينوم بيول. 3، البرنامج 0003.1–0003.6 (2002).

Fielden ، M.R. ، Halgren ، R.G. ، Dere ، E. & amp Zacharewski ، T.R. GP3: برنامج المعالجة اللاحقة GenePix للتحليل الآلي لبيانات ميكروأري الخام. المعلوماتية الحيوية 18, 771–773 (2002).

Geschwind، D.H. مشاركة بيانات التعبير الجيني: مجموعة من الخيارات. نات. القس نيوروسسي. 2, 435–438 (2001).

قاعدة بيانات التعبير الجيني Kellam ، P. Microarray: التقدم نحو مستودع دولي لبيانات التعبير الجيني. جينوم بيول. 2، تقارير 4011 (2001).

معايير المصفوفات الدقيقة أخيرًا. طبيعة سجية 419, 323 (2002).

التعامل مع المصفوفات الدقيقة. طبيعة الجينات. 32, 333–334 (2002).

Gardiner-Garden، M. & amp Littlejohn، T.G. مقارنة بين قواعد بيانات ميكروأري. نبذة. بيوينفورم. 2, 143–158 (2001).

Bilban، M.، Buehler، L.K.، Head، S.، Desoye، G. & amp Quaranta، V. تطبيع بيانات DNA microarray. بالعملة. قضايا مول. بيول. 4, 57–64 (2002).

Quackenbush ، J. تطبيع وتحويل بيانات Microarray. طبيعة الجينات. 32, 496–501 (2002).

ريبلي ، ب. ال مشروع في الحوسبة الإحصائية. اتصالات MSOR. النشرة الإخبارية للرياضيات والإحصائيات وشبكة أو LTSN (جامعة برمنجهام ، إدجباستون ، المملكة المتحدة) 1, 23–25 (2001).

سلونيم ، د. من الأنماط إلى المسارات: تحليل بيانات التعبير الجيني يأتي مع تقدم العمر. طبيعة الجينات. 32, 502–508 (2002).

آيزن ، إم بي ، سبيلمان ، بي تي ، براون ، ص. & amp Botstein، D. تحليل الكتلة وعرض أنماط التعبير على مستوى الجينوم. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 95, 14863–14868 (1998).

براون ، م. وآخرون. التحليل القائم على المعرفة لبيانات التعبير الجيني ميكروأري باستخدام آلات ناقلات الدعم. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 97, 262–267 (2000).

بوميروي ، S.L. وآخرون. التنبؤ بنتيجة ورم الجهاز العصبي المركزي على أساس التعبير الجيني. طبيعة سجية 415, 436–442 (2002).

خان ، ج وآخرون. تصنيف وتشخيص أمراض السرطان باستخدام التنميط الجيني للتعبير والشبكات العصبية الاصطناعية. نيتشر ميد. 7, 673–679 (2001).

شو ، واي وآخرون. تميز الشبكات العصبية الاصطناعية والترشيح الجيني بين ملامح التعبير الجيني العالمي لمريء باريت وسرطان المريء. الدقة السرطان. 62, 3493–3497 (2002).

راماسوامي ، إس وآخرون. تشخيص السرطان متعدد الطبقات باستخدام بصمات التعبير الجيني للورم. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 98, 15149–15154 (2001).

Holmes، G. & amp Hall، M.A بيئة تطوير للنمذجة التنبؤية في الأطعمة. كثافة العمليات J. الغذاء ميكروبيول. 73, 351–362 (2002).

اتحاد علم الوجود الجيني. إنشاء مورد الأنطولوجيا الجينية: التصميم والتنفيذ. الدقة الجينوم. 11, 1425–1433 (2001).

أشبورنر ، م وآخرون. علم الجينات: أداة لتوحيد علم الأحياء. طبيعة الجينات. 25, 25–29 (2000).

ديلوزير ، إ. & amp Lingle ، V.A. MEDLINE و MeSH: تحديات للمستخدمين النهائيين. ميد. المرجع. سيرف. س 11, 29–46 (1992).

Lowe، H.J. & amp Barnett، G.O. فهم واستخدام مفردات عناوين الموضوعات الطبية (MeSH) لإجراء عمليات البحث في الأدبيات. جيه. ميد. مساعد. 271, 1103–1108 (1994).


نتائج ومناقشة

التعامل والمعالجة الأولية لعينات خلايا اللوكيميا

عادة ما يتم الحصول على مادة اللوكيميا من الدم المحيطي أو نخاع العظام. بين رسم العينة والتقييم المختبري ، مع مزيد من المعالجة (التجميد أو التنقية أو استخراج الحمض النووي الريبي لتحليلات المصفوفات الدقيقة) ، قد توجد فترة زمنية متغيرة ، خاصة في إطار الدراسات متعددة المراكز. 40 كما هو موضح مؤخرًا ، يجب معالجة الدم أو النخاع العظمي المسحوب في أنابيب معقمة بمضادات التخثر المناسبة خلال 24 ساعة. 41 المواد المخزنة في درجة حرارة الغرفة لفترات زمنية أطول ، خاصة إذا تم إرسالها في صناديق البوليسترين في حالة الدراسات متعددة المراكز ، لا يزال بإمكانها تقديم بيانات مفيدة إذا تم استخدامها في سلسلة تصنيف كبيرة. يجب شرح عينات المرضى هذه والوقت المستغرق حتى المعالجة. يمكن أن يؤثر خلاب الكاتيونات ثنائية التكافؤ عن طريق التخزين الطويل في حمض إيثيلين أمينوتتراسيتيك سلبًا على سلامة الخلايا الليمفاوية. 42 ، 43 ومع ذلك ، لا توجد بيانات حول دور مضادات التخثر المختلفة في دراسات التعبير الجيني. لذلك ، لم يتم التوصل إلى توافق في الآراء بشأن استخدام بعض مضادات التخثر. الأهم من ذلك ، يجب استخدام نفس مضادات التخثر طوال فترة الدراسة.

في معظم الدراسات ، يتم استخدام الطرد المركزي بكثافة Ficoll لعزل جزء الخلية أحادي النواة الذي يحتوي على خلايا اللوكيميا. الميزة الرئيسية للطرد المركزي بكثافة Ficoll هي عزل الخلايا أحادية النواة بينما تتم إزالة الخلايا المحببة وكريات الدم الحمراء والخلايا الشبكية والصفائح الدموية. على وجه الخصوص ، يعد استبعاد الخلايا المحببة ميزة مقارنة بجميع الطرق الأخرى ، فيما يتعلق بـ "نقاء" الملامح الجينية ونوعية الحمض النووي الريبي ، حيث من المعروف أنه من الصعب الحصول على الحمض النووي الريبي الجيد من الخلايا الحبيبية (U Lehmann ، التواصل الشخصي) . يقلل استبعاد الخلايا الشبكية من مساهمة globin mRNA في ملف تعريف التعبير. ومع ذلك ، يمكن أيضًا تقليل غلوبين مرنا باستخدام تحلل كرات الدم الحمراء. 41 ميزة إضافية لـ Ficoll هي أنه يمكن استخدامه بسهولة على المواد المذابة لإزالة الخلايا الميتة ، مما يؤدي إلى جودة أفضل للحمض النووي الريبي.

يوفر استخدام نظام PAXgene blood RNA (PreAnalytiX GmbH ، Hembrechtikon ، سويسرا) ككاشف تثبيت ميزة على شحن العينات غير المستقرة عن طريق الحفظ المباشر لـ RNA. ومع ذلك ، بالنسبة لعينات نخاع العظم ، فقد تبين أن كاشف PAXgene يوفر فقط حماية غير كافية من التعديلات التحليلية السابقة لعدد من النصوص. بالإضافة إلى ذلك ، فإن عيب هذا النهج هو التلوث ، على سبيل المثال ، بكميات كبيرة من الجلوبين وغيرها من mRNAs الخاصة بكريات الدم الحمراء ، والتي تؤثر بشكل كبير على ملف تعريف التعبير الجيني بأكمله بسبب وفرتها. 44 على الرغم من أن Affymetrix ، على سبيل المثال ، قد طورت بروتوكولات لتقليل الغلوبين ، إلا أنها تستغرق وقتًا طويلاً ويصعب تنفيذها في الدراسات السريرية واسعة النطاق. ومع ذلك ، توفر بروتوكولات تقليل الغلوبين ميزة كبيرة للأورام الصلبة ، حيث يصعب تطبيق Ficoll أو طرق التنقية الأخرى (على سبيل المثال التي تعتمد على الجسم المضاد بواسطة فارز الخلايا المنشطة المغناطيسية (MACS)).

إذا لم يتم تحضير الحمض النووي الريبي بشكل مباشر (انظر أدناه) ، يمكن بعد ذلك تجميد الخلايا ، بشكل تفضيلي تدريجي بكثافة أقل من 20 × 10 6 خلية / مل لضمان الشفاء الجيد عند الذوبان. في تجربتنا ، ينتج عن الذوبان السريع عند 37 درجة مئوية أفضل النتائج من حيث استرداد إجمالي الحمض النووي الريبي من خلايا سرطان الدم. وذلك لأن الذوبان السريع (حتى تبقى كتلة صغيرة في الأمبولة ، متبوعًا بالتخفيف السريع في وسط خالٍ من ثنائي ميثيل سلفوكسيد) يؤدي إلى أفضل انتعاش لخلايا اللوكيميا.

للتطهير أو عدم التطهير

قبل الشروع في استخراج الحمض النووي الريبي ، من المهم النظر في ما إذا كان ينبغي تنقية سكان خلايا سرطان الدم. في بعض الأحيان تقترب أحمال الورم من 100٪ ومن الواضح أنه ليست هناك حاجة للتنقية. ومع ذلك ، في معظم الحالات ، تتراوح حمولات الورم بين 30 و 95٪. يعتمد ذلك على السؤال المراد الإجابة عليه ما إذا كانت التنقية مطلبًا مطلقًا. لفهم مسارات الإشارات ، غالبًا ما يكون تحليل مجموعة الخلايا النقية مطلوبًا. وبالتالي ، إذا كانت أحمال الورم أقل من 90 ٪ وإذا كان المرء يرغب في الإدلاء ببيانات حول ملف تعريف التعبير الجيني للخلايا السرطانية بثقة إحصائية تبلغ 95 ٪ ، وهو حد قياسي في معظم الدراسات ، فإن التنقية ضرورية. ومع ذلك ، فإن تأثير إجراءات التنقية على التعبير الجيني لم يتم التحقيق فيه على نطاق واسع للغاية في الإعدادات التجريبية. علاوة على ذلك ، قد تعطي السمات الجزيئية للخلايا المناعية غير الخبيثة الموجودة في عينة الورم أو سرطان الدم عند التشخيص معلومات مهمة. 46 إذا كان هناك شك فيما يتعلق بخصوصية الجينات المكتشفة ، على سبيل المثال ، التوقيع المرتبط بالخلايا التائية في ابيضاض الدم الليمفاوي الحاد (ALL) السلائف B ، فإن الطريقة البديلة هي مقارنة توقيعات التعبير الجيني للخلايا غير النقية والمنقاة في مجموعة فرعية من العينات. لأغراض التصنيف ، غالبًا ما تكون التنقية غير إلزامية ، ولكنها ستؤدي بالتأكيد إلى تحسين جودة البيانات. يحتاج المرء إلى إدراك أنه حتى في دراسات التصنيف ، فإن التوقيع ، أي قائمة الجينات التي تميز بين الفئات الفرعية المختلفة لسرطان الدم ، هو عرضة للخطأ وأحمال الورم المنخفضة تؤدي إلى نسبة أكبر من الجينات التي تم تحديدها بشكل خاطئ ، خاصة إذا كان عدد العينات لكل الدرجة منخفضة جدًا. يعد الاستخدام السليم لأدوات الإحصاء الحيوي والتحقق الكافي مهمين في هذا الصدد. ربما يعتمد الحد الأدنى من حمل الورم الذي سيظل يؤدي إلى التصنيف الصحيح على عدة متغيرات ، أي النوع الفرعي لسرطان الدم المعني ويجب استكشاف هذه المشكلة بشكل أكبر من خلال التجارب المستقبلية. نحن نشجع بشدة مثل هذه الدراسات.في الوقت الحالي ، نوصي ، بالنسبة لدراسات التصنيف ، بالإبلاغ عن حمل الورم في العينات.

بالنسبة لمعظم أغراض المصفوفات الدقيقة ، فإن تنقية MACS القائمة على العلامات المعبر عنها في الخلايا السرطانية ، مثل CD34 أو CD19 أو (B-precursor ALL) أو CD7 (T-ALL) ، هي الطريقة الأنسب لتنقية خلايا سرطان الدم. بدلاً من ذلك ، يمكن إجراء تنقية MACS عبر الاختيار السلبي بمزيج من الأجسام المضادة التي يمكن أن تستنفد جميع الخلايا غير المصابة بسرطان الدم (مثل ابيضاض الدم النخاعي الحاد (AML)). من الصعب أحيانًا الوصول إلى درجة نقاء عالية بما يكفي (& gt90٪) مطلوبة لتحليلات المصفوفات. 45 نظرًا لأن التنقية بالاختيار الإيجابي قد تحفز التعبير عن مستقبل سطح الخلية وتغير بشكل متزامن ملف تعريف التعبير الجيني ، يجب تنفيذ إجراء التنقية في البرد لتقليل هذا التأثير.

استخراج الحمض النووي الريبي

يعتبر استخراج الحمض النووي الريبي مهمًا جدًا ، حيث تتأثر نتائج المصفوفات الدقيقة بشكل مباشر بجودة الحمض النووي الريبي المستخدم. يستخدم معظم الباحثين حاليًا تقنيتين رئيسيتين: TRIzol ® (Invitrogen Corp. ، Carlsbad ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) و RNeasy (Qiagen ، Hilden ، ألمانيا) وأحيانًا TRIzol متبوعًا بتنقية العمود من مجموعة RNeasy. استخدم بعض الباحثين طرق استخراج TRIzol المكيفة ، مع تحسين الجودة مقارنة بطرق TRIzol الأصلية. يفضل البعض الآخر RNeasy ، لأنه سريع وقابل للتكرار وسهل الاستخدام. أظهرت نتائج جولة الجودة متعددة المراكز ضمن مشروع علم الجينوم / البروتينات التابع لشبكة الكفاءة الألمانية "اللوكيميا الحادة والمزمنة" أن كلا الطريقتين تعملان لاستخراج الحمض النووي الريبي عالي الجودة بكميات كافية (الشكل 1). ومع ذلك ، نظرًا لأن الطرق مختلفة تقنيًا ، فمن الحكمة استخدام طريقة واحدة فقط ضمن سلسلة تجريبية. يتضح هذا من خلال سلسلة من عينات T-ALL التي تم استخراج الحمض النووي الريبي منها إما بواسطة RNeasy أو بواسطة TRIzol. باستخدام التجميع الهرمي ، تم تجميع جميع عينات TRIzol معًا بدلاً من عينات RNeasy المستخرجة لنفس المرضى (انظر البيانات التكميلية). يوضح هذا أن طريقة استخراج الحمض النووي الريبي المستخدمة يمكن أن يكون لها تأثير كبير على ملف تعريف التعبير الجيني الذي تم إنشاؤه. أي من الطرق العديدة لعزل الحمض النووي الريبي هي الأنسب لتحليلات المصفوفات الدقيقة ، خاصة على أعداد كبيرة من الدراسات السريرية ، تستدعي الدراسة المستقبلية.

نتائج جولة الجودة متعددة المراكز ضمن مشروع الجينوميات / البروتينات الخاصة بشبكة الكفاءة الألمانية "اللوكيميا الحادة والمزمنة". تم إرسال خلايا نخاع العظام وحيدة النواة (BM MNC) المجمدة الأولية إلى مختبرات مختلفة. استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام TRIzol (أ) ، RNeasy (ب) أو TRIzol متبوعًا بتنقية العمود من مجموعة RNeasy (ج) يؤدي إلى RNA عالي الجودة كما تم قياسه بواسطة Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). يُظهر الحمض النووي الريبي المتدهور قممًا إضافية على يسار ذروة 18 ثانية ولا يجب أخذها في الاعتبار للتحليل (د).

يجب قياس كمية الحمض النووي الريبي المستخرج عن طريق القياس الطيفي. أصبح مقياس الطيف الضوئي NanoDrop (NanoDrop Technologies ، Wilmington ، DE ، الولايات المتحدة الأمريكية) شائعًا ، حيث إنه قادر على قياس الأحماض النووية بأحجام صغيرة جدًا ، مما يسمح بتقدير دقيق لكميات صغيرة من المواد. نسبة الأطياف المقاسة عند 260 و 280 نانومتر مفيدة جدًا في تقييم نقاء الحمض النووي الريبي وغالبًا ما تستخدم كمؤشر على جودة الحمض النووي الريبي. ومع ذلك ، من المهم مراعاة أن نسبة الامتصاص تعتمد على الأس الهيدروجيني والقوة الأيونية ويجب قياسها في ظل ظروف مماثلة. 47 يجب أن تكون نسبة RNA 260/280 بشكل مثالي 2.0 ، ولكن أي شيء أعلى من 1.8 مقبول أيضًا.

من أجل مراقبة الجودة (QC) ، أثبت Agilent Bioanalyzer 2100 نفسه كقطعة مهمة من معدات المختبرات. باستخدام تقنية "Lab-on-a-chip" ، يمكن تقدير جودة الحمض النووي الريبي بدقة شديدة ، مرة أخرى على كميات صغيرة من المادة الثمينة. أدوات البرمجيات المتاحة بحرية مثل أنظمة Degradometer و RNA Integrity Number (RIN) تنتج مقاييس جودة RNA مستقلة عن المستخدم وموضوعية. 48 ، 49 ومع ذلك ، لا ينبغي استخدام هذا الصك لأغراض القياس الكمي حيث لا يمكن الحصول على دقة مقبولة للتقدير الكمي إلا في نطاق صغير من التركيز.

في معظم الدراسات ، لا يتم استخدام عينات RNA الفقيرة لمزيد من تحليل ميكروأري. لم تُظهر دراستنا المكثفة حول جودة الحمض النووي الريبي مقابل نتائج ميكروأري على منصة Affymetrix وجود علاقة بين نسبة 260/280 ونتائج المصفوفة من حيث نسبة نازعة الهيدروجين glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 3/5 أو النسبة المئوية للجينات الحاضر ، إلى حد كبير لأن عينات الحمض النووي الريبي الفقيرة لم تتم معالجتها بشكل أكبر ، وبالتالي لم تسفر عن نتيجة GAPDH من الصفيف (الشكل 2). نسبة GAPDH 3/5 هي معلمة جودة شائعة الاستخدام تقيس الإشارة في منطقتي 3 و 5 من جابد mRNA ، والتي ، بدون تحلل الحمض النووي الريبي ، يجب أن تكون مثالياً 1.0. مقبول بشكل عام جابد النسبة هي & lt3.0 (الشكل 2). يجب إجراء بيان مماثل لـ 28S: 18S نسب الرنا الريباسي المقاسة باستخدام Agilent Bioanalyzer وعدد النقاط التي تم قياسها جيدًا على المصفوفات المرقطة. من وجهة نظرنا ، من المهم النظر في كل من قمم الرنا الريباسي 28S و 18S وعلامات التدهور أو استخدام مقاييس موضوعية مثل مقياس الانحطاط أو RIN. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لمعالجة الارتباط بشكل منهجي ، على سبيل المثال ، أرقام RIN ونتائج ميكروأري. ومع ذلك ، يجب الإبلاغ عن مقاييس جودة الحمض النووي الريبي الموضوعية كجزء من معايير MIAME. 35

العلاقة بين جودة الحمض النووي الريبي ونتائج المصفوفات الدقيقة Affymetrix كما تم قياسها بواسطة 3/5 ′ جابد نسبة ونسبة الجينات الموجودة. تم تحليل البيانات المأخوذة من 421 من المصفوفات الدقيقة Affymetrix المختلفة من أربعة مراكز مختلفة من أجل جودة RNA كما تم قياسها بنسبة 260/280 ونتائج المصفوفة كما تم قياسها بواسطة جابد نسبة إشارة 5 ′ و 3 مضان. بشكل عام ، لا تتم معالجة العينات ذات الجودة المنخفضة للـ cRNA بواسطة المحققين المعنيين. ومع ذلك ، هناك ارتباط ضعيف بين نسبة 260/280 والنسبة المئوية للجينات الموجودة ، فضلا عن ارتباط عكسي متوقع بين جابد 3/5 نسب ونسبة الجينات الموجودة.

وسم الحمض النووي الريبي والتضخيم المحتمل

بالنسبة لمعظم أنظمة ميكروأري ، توجد بروتوكولات قياسية لوضع العلامات على الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي الريبي الذي سيتم تهجينه على المصفوفة. تتضمن الطريقة الأولى عادةً تفاعل cDNA لإنتاج قالب مناسب يمكن استخدامه بواسطة بوليميراز RNA (غالبًا T7 RNA polymerase) لدمج النيوكليوتيدات المسمى. تستخدم معظم المصفوفات المرقطة التسميات Cy3 و Cy5 ، بينما تستخدم Affymetrix النيوكليوتيدات الحيوية ، والتي يتم تلطيخها لاحقًا بواسطة الستربتافيدين المترافق مع Phycoerythrin بعد التهجين. في بعض التطبيقات ، يتم استخدام RNA المسمى مباشرة. هذا يتجنب أي قطع أثرية يمكن أن تنشأ من التضخيم (الخطي إلى حد ما) بواسطة بوليميراز T7. العيب هو أن هناك حاجة إلى ما لا يقل عن خمسة إلى 10 أضعاف إدخال RNA ، مما قد يعني أن العديد من العينات السريرية تنتج RNA غير كافٍ لتحليل المصفوفات الدقيقة. علاوة على ذلك ، يمكن أن يتسبب وضع العلامات المباشر في حدوث تشوهات ، بغض النظر عما إذا كان يتم تطبيق التضخيم أم لا. مرة أخرى ، يجب استخدام نفس طريقة وضع العلامات خلال الدراسة.

لدى معظم الموردين الآن بروتوكولات تتطلب 1-5 ميكرومترg من إجمالي الحمض النووي الريبي كمواد أولية. من واقع خبرتنا ، نبدأ بمبالغ أقل بكثير من 1 ميكرومتريمكن أن تعطي g لمصفوفات Affymetrix نتائج جيدة ، لكن هذا لا يمكن التنبؤ به. مقادير متساوية من 1-2 ميكرومترلا ينتج عن g دائمًا ما يكفي من الحمض الريبي النووي الريبي للتهجين على مجموعة.

عند إجراء دراسات التعبير الجيني على عينات سرطان الدم ، في معظم الحالات أكثر من 2 ميكرومتريمكن عزل g RNA ، ويمكن بسهولة تجنب جداول التضخيم ، التي تستغرق وقتًا أطول وتكلفة أعلى ، خاصة عند استخدام نظام Affymetrix (ضع في اعتبارك أن بروتوكول Affymetrix القياسي يتضمن بالفعل خطوة واحدة من التضخيم). تتطلب العديد من المصفوفات المرقطة مدخلات RNA أكثر من مصفوفات Affymetrix لذلك ، غالبًا ما يكون التضخيم مطلوبًا. تم تطوير بروتوكولات تضخيم مختلفة باستخدام خطوة تضخيم إضافية والتي تنتج ما يكفي من الحمض النووي الريبي للتهجين. استخدام ، على سبيل المثال ، مجموعات التضخيم المتاحة تجاريًا استنادًا إلى بروتوكول التضخيم الخطي الذي طوره Van Gelder وآخرون.، يمكن تأكيد 50 ملفًا شخصيًا للتعبير الجيني باستخدام RNA المضخم بدقة عالية عند إعادة تحليل التعبير عن هذه الجينات باستخدام RNA غير المضخم عن طريق تفاعل سلسلة البوليميراز العكسي الكمي (RT-PCR). 18 إذا تم تطبيق التضخيم ، فيجب إجراؤه في جميع العينات باستخدام نفس البروتوكول والكيمياء. يجب إجراء التحقق الكمي من RT-PCR من RNA غير المضخم لاختبار تحيز التضخيم.

أخيرًا ، يجب ذكر توصية عامة هنا: باستخدام المصفوفات الدقيقة ، يتم قياس التعبير الجيني التفاضلي بين العينات وليس قيم التعبير المطلق للعينة الفردية بشكل أساسي ، يجب التعامل مع العينات داخل الدراسة بشكل متطابق قدر الإمكان لتجنب الاختلاف التقني في تجاوز التنوع البيولوجي للتعبير التفاضلي. يجب الحفاظ على الاختلافات الفنية في الحد الأدنى وتوثيقها بالتفصيل.

الجوانب الفنية للتهجين والغسيل والمسح

على غرار وضع العلامات ، غالبًا ما يتم إجراء التهجين وفقًا للبروتوكولات التي توفرها الشركات المصنعة لتلك المصفوفات المستخدمة بالفعل (Agilent و Affymetrix وما إلى ذلك). نظرًا لأن هذه البروتوكولات يمكن أن تتغير وبالتالي لا توجد بروتوكولات قياسية حقيقية ، فمن المهم توثيق البروتوكول المستخدم. بالنسبة للصفائف المرقطة ، غالبًا ما يتم إجراء تهجين مقارن لعينتين موسمتين بأصباغ فلورية مختلفة. نوصي باستخدام معيار RNA مشترك لجميع المصفوفات في دراسة واحدة ، على سبيل المثال ، RNA المرجع البشري العالمي (Stratagene ، هايدلبرغ ، ألمانيا) ، خاصةً إذا كان المقصود تكبير حجم العينة. بالنسبة إلى المصفوفات الدقيقة Affymetrix ، توجد أيضًا إجراءات ثابتة للغسيل والمسح الضوئي. بالنسبة للصفائف المرقطة ، يمكن إجراء الغسيل يدويًا أو باستخدام نظام آلي. بعد المسح ، يجب على المرء أن يفحص المصفوفة بحثًا عن الخدوش والفقاعات والتحف الأخرى.

استخراج البيانات

كل مورد لديه برامجه الخاصة لترجمة إشارة التألق إلى قيمة تقابل تعبير الجين الذي استجوبه المسبار. في مصفوفات Affymetrix ، يجب التحقق من العديد من معلمات الجودة: نسبة 3/5 المذكورة أعلاه لجينات التدبير المنزلي مثل جابد و ACTB، تم اكتشاف الضوضاء والخلفية وعامل القياس والنسبة المئوية للجينات على أنها موجودة. لا تخبر هذه المعلمات المحقق بشيء عن العينة المعنية فحسب ، بل تخبر أيضًا ما إذا كان يمكن مقارنتها بأمان مع العينات الأخرى في سلسلة معينة من التجارب. يجب ألا يختلف عامل التحجيم أكثر من ثلاثة أضعاف بين المصفوفات من أجل مقارنتها. أيضًا ، في تجربتنا ، يجب أن تحتوي عينات اللوكيميا على 25 ٪ على الأقل من الجينات الموجودة في أحدث صفائف Affymetrix HG-U133 Plus 2.0 ، وكذلك على صفائف U133A. في مصفوفات U95A ، تميل المكالمات الحالية إلى أن تكون أعلى (35-50٪). لتقييم جودة المصفوفات المرقطة ، من المهم التحقق من تجانس التهجين ، ولضمان خلفية تهجين منخفضة بشكل موحد. بالإضافة إلى ذلك ، يتعين على المرء التحقق بعناية من محاذاة الشبكة وتحسينها وتحديد معلمات المواقع التي تم قياسها جيدًا ، والتي يمكن تضمينها في التحليلات اللاحقة. تم وصف الأمثلة في الدراسات المنشورة مؤخرًا. 8 ، 18 ، 50 ، 51 يعتمد إجراء مراقبة الجودة على المنصة المستخدمة. بالنسبة للمصفوفات المرقطة ، من الصعب التوصل إلى إرشادات صارمة. بالنسبة لمصفوفات Affymetrix ، إلى جانب الجوانب المرئية ، يمكن التحقق من العديد من المعلمات ، كما تم اقتراحه مؤخرًا من قبل "مجموعة عمل أفضل ممارسات تحليل الورم". 34

يجب أن تتضمن جميع تحليلات المصفوفات الدقيقة بعض التكرارات التقنية التي تؤدي إلى قياس القابلية للتكرار التقني حتى يتمكن الباحثون من تحديد ما إذا كانت القياسات الفردية قابلة للتكرار بدرجة كافية. ومع ذلك ، فإن النسخ المكررة لسلسلة العينات بأكملها ، كما تم إجراؤها في الأوقات المبكرة لتحليلات المصفوفات الدقيقة ، ليست ضرورية بشكل عام بسبب التوافق الكبير للبيانات التي حصل عليها الباحثون ذوو الخبرة. بدلاً من زيادة عدد التكرارات التقنية ، يجب على المرء زيادة عدد العينات البيولوجية في ، على سبيل المثال ، مجموعتين سيتم مقارنتهما. من خلال تضمين العديد من العينات البيولوجية ، يتم النظر في تأثيرات الاختلافات البيولوجية والاختلافات التقنية ، على الرغم من أنه سيكون من غير الواضح مقدار التباين الذي يرجع إلى التقنية ومقدار التباين البيولوجي (انظر الشكل 3). ومع ذلك ، إذا رغب المرء في مقارنة ملف تعريف التعبير ، على سبيل المثال ، عينة واحدة من مريض مصاب بمرض غير معروف بمجموعة من الضوابط العادية ، فيجب عمل نسخ تقنية مكررة أو ثلاث نسخ من عينة المريض ، من الناحية المثالية تبدأ بمعالجة عينة. في هذا الصدد ، يمكن أن يكون استخدام عناصر تحكم spike-in-RNA (المقابلة للكميات المعروفة من RNA) مفيدًا أيضًا ، وكذلك الأدوات التي تم إنشاؤها بواسطة اتحاد ضوابط RNA الخارجي (ERCC) ، أي توفير RNA خارجي. 52

أمثلة على التكرارات البيولوجية والتقنية وتأثيرها على التعبير التفاضلي بواسطة تحليلات ميكروأري. تم إجراء التجارب باستخدام المصفوفات الدقيقة (كدنا) المرقطة كما هو موضح مؤخرًا. 18 تم عرض الارتباط بين قيم التعبير الجيني النسبية لتجربتين ميكروأري ، على التوالي ، لـ (أ) نسختان بيولوجيتان (خلايا نخاع العظم وحيدة النواة (BM MNC) لاثنين من عناصر التحكم السليمة) (ب) نسختان بيولوجيتان لخط خلية واحد تم تقسيمهما ، ثم تم تربيتهما في نفس الظروف حتى نقطتين زمنيتين مختلفتين ومعالجتين لاحقًا بالتوازي و (ج) مكررات تقنيتان (تم تقسيم الحمض النووي الريبي المضخم لعينة واحدة وتم تنفيذ الخطوات اللاحقة بالتوازي). معاملات الارتباط ص 2 معروضة. لوحظت معاملات ارتباط مماثلة باستخدام نظام Affymetrix. 57

بشكل عام ، وخاصة بالنسبة لتحليلات المسار ، يجب التحقق من صحة الجينات ذات الأهمية باستخدام تقنية بديلة ، على سبيل المثال ، RT-PCR الكمي.

الإحصاء الحيوي لتحليل البيانات

توجد حزم برامج مختلفة لمساعدة المحققين على استخراج الكمية الهائلة من المعلومات الناتجة عن تجارب المصفوفات الدقيقة. التقنيات المستخدمة بشكل شائع هي تحليل الأهمية الإحصائية مع الاختبارات البارامترية واللامحدارية (على سبيل المثال ر-اختبار ، تحليل التباين (ANOVA) ، تحليل أهمية المصفوفات الدقيقة (SAM) 53 ، 54) ، مع تصحيح للاختبار المتعدد ، مجموعة متنوعة من طرق التصنيف الإضافية (مثل تحليل المكون الرئيسي) وأنواع مختلفة من التحليل العنقودي (مثل التجميع الهرمي ، K- يعني). 55 قد تساعد أدوات التصور المختلفة في الحصول على نظرة عامة أفضل لنتائج التحليل ، وسيساعد تعيين الجينات للمسارات الجزيئية والتمثيل الغذائي على تحديد النتائج ذات الصلة بيولوجيًا. من خارج نطاق هذه المقالة مناقشة أدوات المعلومات الحيوية هذه بالتفصيل (يتم تقديم نظرة عامة بواسطة أليسون وآخرون. 56). لقد قمنا بإدراج العديد من الحزم ، التجارية والمتاحة مجانًا في الجدول 1. نوصي بشدة الباحثين السريريين والبيولوجيين للتشاور مع خبير الإحصاء الحيوي حتى قبل إجراء تجربة المصفوفة لصياغة أسئلة محددة للدراسة ، لتحديد المتطلبات ومعالجة العديد من القضايا المتعلقة استراتيجيات تحليل البيانات. وتجدر الإشارة إلى أن نفس بيانات المصفوفة الدقيقة الأولية التي تم تحليلها بواسطة طرق المعلومات الحيوية المختلفة يمكن أن تسفر عن نتائج مختلفة للغاية ، خاصة بالنسبة للجينات المعبر عنها منخفضة. نظرًا لاختلاف هذه الأساليب في الخوارزميات الإحصائية المستخدمة لتحليل البيانات ، فإن هذا ليس مفاجئًا ، ولكنه جانب مهم يجب مراعاته. وغني عن البيان أيضًا أنه يجب استخدام طريقة التحليل نفسها في جميع أنحاء الدراسة لمقارنة مجموعات البيانات المختلفة.

تعتبر الإحصائيات الحيوية ضرورية لفهم نتائج تجارب المصفوفة ويجب استخدامها بأكبر قدر ممكن من الشفافية لتجنب تضليل القراء الذين ليسوا خبراء في هذا المجال. على سبيل المثال ، يجب أن تكون قائمة الجينات المعبر عنها تفاضليًا والتي تشكل ملف تعريف توقيع مصحوبة بمعدل اكتشاف خاطئ (FDR) 58 أو ص- القيمة المصححة للاختبارات المتعددة لإعطاء فكرة عن مدى أهمية النتائج في الواقع. لتوضيح ذلك بشكل أكبر ، فإن ملف تعريف التوقيع مع FDR ، على سبيل المثال ، 50 ٪ يعني أن حوالي نصف الجينات في التوقيع يتم اختيارها بالصدفة ، ولا يمكن معرفة الجينات بدون دراسات التحقق المستقلة. قد يؤدي هذا في بعض الحالات إلى تقديم معلومات مهمة ، ولكن في معظم الحالات يكون هذا معدل خطأ مرتفع للغاية ويجب أن يكون FDR أقل بكثير (على سبيل المثال في نطاق 10٪). فيما يتعلق بالجينات الفردية ، سيدرك القارئ أن المزيد من التجارب ضرورية لتحديد الإيجابية الحقيقية.

يجب تضمين جميع المعلومات ذات الصلة اللازمة للتفسير الصحيح للتجربة وتحليل المعلومات الحيوية في المنشورات. يجب أن تكون بيانات المصفوفة التي يتم تحميلها في قواعد البيانات العامة بيانات أولية بقدر الإمكان. يجب أن يكون تحميل تقديرات تعبير برنامج التشغيل Affymetrix GeneChip ® (GCOS) ، على سبيل المثال ، مصحوبًا بملفات كثافة الخلية (CEL) للسماح بتحليل البيانات المستقلة للبيانات الأولية. كما أشير أعلاه ، يجب تقديم البيانات وفقًا لإرشادات MIAME وتتضمن معلومات حول عامل القياس. علاوة على ذلك ، يجب أن يوثق وصف تحليل المعلومات الحيوية حزم البرامج والخوارزميات المستخدمة ، والإشارة إلى الأهمية الإحصائية مثل ص-قيم أو FDR لقوائم الجينات والتعامل مع القيم المتطرفة والقيم المفقودة. إذا كان ذلك ممكنًا ، يجب اختبار متانة النتائج عن طريق اختبارات التمهيد أو اختبارات التحقق من الصحة.


المقدمة

لا تقوم الحمض النووي الريبي غير المشفر للبروتين (ncRNAs) بتشفير البروتينات ولكنها تعمل مباشرة على مستوى الحمض النووي الريبي في الخلية. على مدى السنوات القليلة الماضية ، تم الاعتراف على نطاق واسع بأهمية هذه الفئة المتنوعة بشكل مدهش من الجزيئات (1-5). تم التعرف على NcRNAs بأعداد كبيرة بشكل غير متوقع ، مع التقديرات الحالية - بناءً على مناهج المعلومات الحيوية - في نطاق الآلاف لكل حقيقية النواة ومئات لكل جينوم بكتيري (6 - 9). يلعبون أدوارًا رئيسية في مجموعة متنوعة من العمليات الأساسية في جميع مجالات الحياة الثلاثة ، مثل Eukarya والبكتيريا والعتائق. تشمل وظائفهم تكرار الحمض النووي والحفاظ على الكروموسوم ، وتنظيم النسخ ، ومعالجة الحمض النووي الريبي (ليس فقط انقسام الحمض النووي الريبي والربط ، ولكن أيضًا تعديل الحمض النووي الريبي وتحريره) ، وترجمة الحمض النووي الريبي واستقراره ، وحتى تنظيم الاستقرار وانتقال البروتينات (4 ، 5) ، 10-13). تم اكتشاف العديد منهم بالصدفة ، مما يشير إلى أنهم يمثلون مجرد قمة جبل الجليد. العديد من ncRNAs المعروفة صغيرة ، أي 500 lt500 عادةً ، وبالتالي فهي أقصر بكثير من غالبية الرنا المرسال. ومع ذلك ، فإن حقيقيات النوى تعبر أيضًا عن عدد من ncRNAs الكبيرة ، على سبيل المثال Xist أو Air RNAs ، والتي يبلغ طولها 1000 نانومتر (14-16). تعكس الأدوار المحددة للغاية للـ ncRNAs في معظم الحالات قدرتها على الارتباط الانتقائي لمجموعة صغيرة من البروتينات بالإضافة إلى قدرتها على التعرف على أهداف محددة من الحمض النووي الريبي عبر مناطق تكامل التسلسل.

في السنوات الأخيرة ، تم اتخاذ استراتيجيات معلوماتية حيوية وتجريبية جديدة لتحديد عدد كبير من المرشحين الجدد لـ ncRNA في كائنات نموذجية مختلفة من الإشريكية القولونية إلى الانسان العاقل (5-7 ، 17-31). أظهرت هذه النتائج أن عدد ncRNAs في جينومات الكائنات الحية النموذجية أعلى بكثير مما كان متوقعًا.

في ما يلي ، سنراجع الاستراتيجيات التجريبية المختلفة التي تم استخدامها لتحديد ncRNAs الجديدة في جينومات الكائنات الحية النموذجية. لهذه الأساليب ، تمت صياغة مصطلح "التجريبية RNomics" (3). سيتم تقديم أربع طرق مختلفة وستتم مناقشة مزاياها بالإضافة إلى عقباتها في تحديد جزيئات ncRNA الجديدة: (1) تسلسل الحمض النووي الريبي (إنزيميًا أو كيميائيًا) باعتباره الطريقة الأكثر تقليدية للكشف عن أنواع جديدة من الحمض النووي الريبي (2) الموازية استنساخ العديد من ncRNA عن طريق إنشاء مكتبات cDNA متخصصة (3) استخدام المصفوفات الدقيقة للتنبؤ بـ ncRNAs التي يتم التعبير عنها في ظل حالة تجريبية معينة (4) `` SELEX الجيني '' وتطبيقه المحتمل لاختيار مرشحين ncRNA من مساحة التسلسل التي يمثلها الجينوم كائن حي محل الاهتمام.

بدلاً من الطرق الكيميائية الحيوية ، يمكن أيضًا استخدام الأدوات الجينية والمعلوماتية الحيوية لتحديد ncRNAs في الكائنات الحية النموذجية. في الواقع ، بعض من ncRNAs التنظيمية الأولى المشفرة بالكروموسومات ، على سبيل المثال MicF و DsrA و RprA لـ بكتريا قولونية ، تم اكتشافها أثناء الفحص الجيني (32 - 34). وبالمثل ، اكتشف علم الوراثة أيضًا العضو المؤسس ، lin-4 RNA ، للفئة المتنامية باستمرار من miRNAs حقيقية النواة (35). ومع ذلك ، نظرًا لقيود المساحة ، نود إحالة القارئ إلى (6 ، 36 ، 37) للحصول على مراجعة أكثر تفصيلاً للطرق الجينية والحوسبية الحيوية لاكتشاف ncRNA.

تحديد ncRNAs عن طريق التسلسل الكيميائي أو الأنزيمي

في الأيام الأولى لأبحاث ncRNA ، على سبيل المثال منذ حوالي 35-40 عامًا ، تم اختيار أنواع الحمض النووي الريبي المنفردة (في ذلك الوقت RNAs الريبوزومي أو الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي الريبي الفيروسي) عن طريق الفصل الحجمي للحمض النووي الريبي الكلي على المواد الهلامية التي تغير طبيعة المواد الهلامية ، متبوعًا بالتخيل واستئصال نطاقات معينة ، تمثل بشكل مثالي أنواع الحمض النووي الريبي المفردة. وبالتالي ، لتحديدها ، يجب أن تكون ncRNA ذات الأهمية موجودة بكميات كبيرة ، على سبيل المثال مرئي كفرقة متميزة في هلام بولي أكريلاميد ملطخ ببروميد الإيثيديوم ، ويتعرض للأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) (الشكل 1 أ).

بعد ذلك (وقبل تحديدها عن طريق تحليل التسلسل) ، يتم تصنيف ncRNAs إما في نهاية 5 أو في نهايتها 3: (1) لوضع العلامات على RNAs في نهايتها 5 ، المجموعة أحادية أو ثلاثي الفوسفات الموجودة عادة في تتم إزالة 5 ′ نهاية ncRNAs أولاً. يتم تحقيق ذلك عن طريق إضافة الفوسفاتيز القلوي المعوي في العجل عند درجة حرارة مرتفعة يتم تعطيل نشاط الإنزيم عن طريق الاستخراج المتكرر بالفينول / الكلوروفورم أو عن طريق تنقية الهلام (38). يتم بعد ذلك وضع العلامات على الحمض النووي الريبي عن طريق إضافة كيناز متعدد النوكليوتيد في وجود [γ- 32 P] ATP (38). (2) لوضع العلامات في نهايتها 3 ، يمكن تمييز ncRNAs من خلال الإجراء الموصوف بواسطة Bruce و Uhlenbeck باستخدام 5′ - 32 PpCp كجزيء مانح في وجود T4 RNA ligase (39). بعد ذلك ، يتم تنقية ncRNAs بالهلام على تغيير طبيعة المواد الهلامية بولي أكريلاميد.

يمكن أيضًا تسمية RNAs في الجسم الحي قبل الاستخراج من كائن حي. في بعض الدراسات المبكرة ، بكتريا قولونية تم تصنيف الحمض النووي الريبي الكلي بشكل استقلابي مع أورثوفوسفات ،

بعد الاستخراج من خلية أو كائن حي ، وفصل الحجم عن طريق PAGE والشطف من الجل ، يتم تحديد ncRNAs عن طريق تحليل التسلسل. يتم تحقيق ذلك إما عن طريق بصمات 2D RNA أو عن طريق التسلسل الأنزيمي أو الكيميائي لـ ncRNAs.

هناك العديد من الإصدارات لتقنيات البصمة ثنائية الأبعاد RNA لتسلسل الحمض النووي الريبي الصغير (أو قليل النوكليوتيدات) أو إعداد كتالوجات قليلة النوكليوتيد المهضوم بالنيوكليوتيدات RNase. الاختلافات هي استخدام الحمض النووي الريبي بشكل موحد أو نهاية المسمى ، والهضم الجزئي أو الكامل مع RNases المختلفة ، والرحلان الكهربائي على شرائح أسيتات السليلوز أو في المواد الهلامية من مادة الأكريلاميد للبعد الأول ، والرحلان الكهربائي على ورق السليلوز DEAE ، أو تجانس كروماتوجرافي على ألواح السليلوز DEAE ، أو كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة المتدرجة على ألواح السليلوز DEAE (44-47).

لتحليل التسلسل الأنزيمي ، تخضع ncRNAs المسمى (عند 5 أو 3) للهضم الجزئي باستخدام ريبونوكلياز خاص بالقاعدة في درجات حرارة مرتفعة (50-55 درجة مئوية) وفي وجود 7 M يوريا لتجنب تداخل المادة الثانوية / الهيكل الثالث للـ RNA بخطوات التحلل المائي الأنزيمي. بالنسبة للانقسام الخاص بالقاعدة ، يمكن استخدام عدد كبير من RNases (RNase T1 أو T2 أو U2 أو PHY1 أو PHY M أو CL3 أو A أو M1) والتي تنقسم بشكل تفضيلي 3 ′ إلى قواعد G أو C أو U أو A (48 - 50). لحل شظايا الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها حسب الحجم ، يتم إجراء الفصل الكهربائي للهلام 1D على تغيير طبيعة المواد الهلامية بولي أكريلاميد (انظر أدناه).

لتحليل التسلسل الكيميائي لـ ncRNAs ، تولد أربعة تفاعلات كيميائية مختلفة خاصة بالقاعدة وسيلة لتسلسل الحمض النووي الريبي المباشر الذي تم تسميته نهائيًا بـ 32 P (51). بعد تعديل جزئي محدد لكل نوع من أنواع قواعد الحمض النووي الريبي ، يُولِّد فصل حبلا محفز بالأمين شظايا مُصنَّفة يحدد طولها مواقع كل نوكليوتيد في تسلسل. يعدل ثنائي ميثيل الكبريتات الجوانوزين ، ويهاجم ثنائي إيثيل بيروكربونات بشكل أساسي الأدينوزين ، ويهاجم الهيدرازين اليوريدين والسيتيدين ، لكن الملح يثبط التفاعل مع اليوريدين. في جميع الحالات ، يؤدي الأنيلين إلى انفصال حبلا لاحقًا (51).

بعد التسلسل الأنزيمي أو الكيميائي ، يتم تحقيق التجزئة الكهربي للشظايا المسمى على تغيير طبيعة المواد الهلامية بولي أكريلاميد ، متبوعًا بالتصوير الشعاعي الذاتي ، والذي يسمح بتحديد تسلسل الحمض النووي الريبي ذي الأهمية.

أجريت الدراسات الأولى لتحديد جزيئات الحمض النووي الريبي عن طريق التسلسل المباشر على الحمض النووي الريبي وكذلك على الحمض النووي الريبوزي (48 ، 52-54). في حالة RNA الريبوسوم 16S ، التي تظهر حجمًا 1500 nt ، تم إنشاء شظايا أصغر أولاً بواسطة انشقاق RNase T1 ثم تم تحليلها لاحقًا بواسطة تقنيات بصمات RNase (54). إن تسلسل الحمض النووي الريبي المباشر لتحديد أنواع الحمض النووي الريبي الجديد بعيد كل البعد عن كونه قديمًا ، كما هو موضح في دراسات أحدث: من خلال وضع العلامات وتسلسل الحمض النووي الريبي المباشر ، يمكن لفئة جديدة من الحمض النووي الريبي ، المعينة على أنها رنا نووية صغيرة ، تشارك في تعديل الرنا الريباسي (55) يتم التعرف عليها في حقيقيات النوى. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام هذه التقنية أيضًا لتصور وتسلسل الحمض النووي الريبي الوفير من البكتيريا موجبة الجرام (56 ، 57).

معوقات ومزايا الطريقة

يواجه تحديد أنواع ncRNA الجديدة عن طريق تسلسل الحمض النووي الريبي أربعة عقبات رئيسية. أولاً ، لتحديد الهوية ، يجب أن تكون الحمض النووي الريبي (ncRNAs) بكثرة حتى تكون مرئية كأشرطة مفردة في المواد الهلامية الملطخة ببروميد الإيثيديوم للتحايل على هذه المشكلة ، ووضع العلامات على إجمالي الحمض النووي الريبي ، متبوعًا بفصل الحجم على نظام الهلام (على سبيل المثال) والعكس صحيح كما هو موضح أعلاه) ، يسمح بتحديد الأنواع الأقل وفرة من الحمض النووي الريبي.

ثانيًا ، لا ينبغي أن توجد أي جزيئات أخرى من الحمض النووي الريبي في نفس نطاق الحجم في إجمالي عدد الحمض النووي الريبي ، لأنها ستعيق عزل نوع واحد من أنواع الحمض النووي الريبي ، وبالتالي ستؤدي إلى بيانات تسلسل غامضة. إذا تم العثور على نطاق أو بقعة تحتوي على أنواع متعددة من الحمض النووي الريبي ، فيمكن حلها عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد ، مما يسمح بفصل أنواع الحمض النووي الريبي ذات الأحجام المتشابهة أو المتطابقة.

ثالثًا ، ينتج عن التسلسل الكيميائي أو الأنزيمي للـ ncRNAs أحيانًا تسلسل البيانات التي يصعب تفسيرها. السبب هو أنه بالنسبة للتسلسل الإنزيمي ، فإن RNases ليست محددة بشكل صارم لقاعدة مميزة ولكنها تمتلك نشاط انشقاق متبقي لقواعد أخرى بالمثل ، لا يؤدي التسلسل الكيميائي دائمًا إلى تعديل وانقسام لا لبس فيه للنيوكليوتيدات ، وبالتالي حجب قراءة بيانات التسلسل التي تم الحصول عليها .

أخيرًا ، نظرًا لطرق التسلسل وقدرة تحليل المواد الهلامية بولي أكريلاميد ، فإن التسلسل يقتصر على RNAs بحجم - على الأكثر - بضع مئات من النيوكليوتيدات. وبالتالي ، لا يمكن تحليل أنواع ncRNA ، التي تتجاوز نطاق الحجم هذا ، مباشرة بهذه الطريقة ، ولكن يجب تقسيمها إلى أجزاء أصغر (على سبيل المثال عن طريق هضم نوكلياز T1) قبل إجراء مزيد من التحليل.

تتمثل ميزة تسلسل الحمض النووي الريبي المباشر ، مقارنةً بتسلسل استنساخ cDNA المتولدة من ncRNAs (انظر أدناه) ، في حقيقة أن ncRNAs لا يلزم نسخها عكسيًا للتحليل. وبالتالي ، فإن الهياكل الثانوية / الثالثة للحمض النووي الريبي التي قد تعيق النسخ العكسي إلى (كدنا) لا تتداخل مع تحديد الحمض النووي الريبي باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي المباشر.

تحديد ncRNAs من قبل مكتبات cDNA المتخصصة

تتضمن الطريقة الثانية لتحديد أنواع ncRNA الجديدة إنشاء مكتبات (كدنا) ، على غرار مكتبات علامات التسلسل المعبر عنها (مكتبات EST) لتحديد mRNAs (58 ، 59). تعتمد طريقة استنساخ mRNA الأصلية على النسخ العكسي للـ mRNAs من كائن حي عن طريق تمهيدي oligo (dT) وتخليق خيط ثانٍ ، مما أدى إلى إنشاء مكتبة cDNA تمثل بشكل مثالي جميع نسخ ترميز البروتين في الجينوم. بالمقارنة مع مكتبات EST التقليدية ، فإن الاختلاف الرئيسي في مناهج مكتبة ncRNA هو مصدر وعلاج الحمض النووي الريبي المستنسخ.

نظرًا لأن معظم mRNAs يبلغ طولها & gt500 nt ولكن العديد من ncRNAs أصغر بكثير ، يتم عزل RNAs الأولى في نطاق الحجم -20-500 nt. عادة ما يتم استنفاد هذا الجزء في مكتبات EST لأنه لن يكون موجودًا في poly (A) + mRNA. يتم عزل الحمض النووي الريبي صغير الحجم عن طريق فصل الحجم عن إجمالي الحمض النووي الريبي (إما من الكائن الحي بأكمله في مراحل تنموية مختلفة أو من عضو فردي) عن طريق تغيير طبيعة الصفحة (الشكل 1 ب).

بدلاً من ذلك ، من خلال استخدام جسم مضاد ضد بروتين مرتبط بـ RNA ، يمكن عزل مجموعات كاملة من ncRNAs عن طريق الترسيب المناعي. وبالتالي ، لا يتم اختيار الحمض النووي الريبي حسب حجمها بل بناءً على وظيفتها لأنها ترتبط ببروتين ربط الحمض النووي الريبي الشائع ، على سبيل المثال. مكتبة تم إنشاؤها عن طريق الترسيب المناعي مع جسم مضاد ضد بروتين رنا نووي صغير شائع سيساعد في تحديد ncRNAs من فئة snoRNAs (26).

في كثير من الحالات ، تفتقر هذه الحمض النووي الريبي المختار بالحجم أو الجسم المضاد إلى ذيول بولي أدينيلاتيد. بشكل عام ، هناك ثلاث طرق مختلفة لعكس نسخ ncRNAs إلى [كدنا] كشرط مسبق للاستنساخ والتسلسل (الشكل 1 ب).

أولاً ، لتوليد cDNA من جزء ncRNA هذا ، تتم إضافة ذيل oligo (C) أو oligo (A) إلى RNA في وجود بولي (A) polymerase ، والذي يستخدم ATP ، ولكن أيضًا - بدرجة أقل CTP - كركيزة (60). في وقت لاحق ، يتم نسخ الحمض النووي الريبي الذيل باستخدام التمهيدي oligo (dG) أو oligo (dT) ، على التوالي. بعد تخليق الخيط الثاني عن طريق استخدام DNA polymerase I وكميات محدودة من RNase H والربط اللاحق لروابط DNA مزدوجة الشريطة ، يتم استنساخ cDNAs المزدوجة التي تقطعت بها السبل في نظام ناقل قياسي (على سبيل المثال pSPORT1 / GibcoBRL) ، وبالتالي إنشاء مكتبة cDNA [للحصول على وصف تفصيلي للطريقة ، انظر (61)].

كنهج ثانٍ بعد ذيل C في الطرف 3 (انظر أعلاه) ، يتم ربط رابط قليل النوكليوتيد بنهاية 5 من ncRNAs بواسطة T4 RNA ligase. يمكن صنع قليل النوكليوتيد من الحمض النووي الريبي (RNA) أو تقريبًا من الحمض النووي (DNA) [للحصول على وصف أكثر تفصيلاً للطريقة ، انظر (62)]. لتجنب تعدد سلاسل الروابط ، يحمل 5′-oligonucleotide مجموعة 5′-hydroxyl. نظرًا لأن T4 RNA ligase يستخدم RNA كقالب ، فيجب أن تكون آخر 3 nt في نهاية 3 من oligonucleotide عبارة عن ribonucleotides لزيادة كفاءة الربط. لإضافة رابط إلى RNAs بنهايات 5 معدلة ، مثل بنية الغطاء أو مجموعة ثلاثي الفوسفات ، يتم معالجة RNA أولاً باستخدام بيروفوسفاتاز حمض التبغ (TAP) الذي ينشق بين مجموعة α و الفوسفات ، وبالتالي يترك 5 ′ - مونوفوسفات (62). بالنسبة لـ RT-PCR لـ RNAs ، يتم استخدام أوليجو (dC) أو d (T) في تركيبة مع 5′-primer الذي يكمل تسلسل رابط 5.

في طريقة ثالثة ، يتم ربط روابط أليغنوكليوتيد الحمض النووي الريبي بالتسلسل إلى كل من 3 ′ و 5 نهاية بواسطة T4 RNA ligase. لتجنب تعدد النكليوتيد في متواليات الرابط ، يفتقر قليل النوكليوتيد في نهاية 5 من الحمض النووي الريبي إلى نهاية 5 فسفرة ، بينما يحتوي قليل النوكليوتيد المرتبط بنهاية 3 من الحمض النووي الريبي على نهاية 3 مسدودة. عادة ، يخضع تجمع الحمض النووي الريبي بأكمله لجولة أخرى من استخراج الهلام بعد خطوة ربط الوصلة الأولى لإزالة الرابط الزائد الذي قد يشكل ثنائيات مع المحول الثاني أوليجو. كما هو موضح أعلاه ، قد تحتوي المحطة الطرفية 3 nt للرابط 5′-oligonucleotide والأولى من رابط 3′-oligonucleotide على قواعد RNA لزيادة كفاءة الربط بواسطة T4 RNA ligase. يتم تحقيق تفاعل البوليميراز المتسلسل RT-PCR لجزء الحمض النووي الريبي المربوط بواسطة بادئات الحمض النووي التكميلية للنيوكليوتيد ذي الصلة 5′- أو 3′- [للحصول على وصف أكثر تفصيلاً للطريقة ، انظر (61)].

بعد تخليق (كدنا) ، يتم استنساخ شظايا (كدنا) في أنظمة ناقلات قياسية ومتسلسلة من خلال تسلسل الدورة. اعتمادًا على التعقيد المتوقع للمكتبة ، يجب تسلسل ما يصل إلى 10000 نسخة من cDNA (على سبيل المثال في حالة جينومات حقيقية النواة الكبيرة). عادة ما يتبع التسلسل تحليلات المعلومات الحيوية ، على سبيل المثال رسم خرائط لجين ncRNA إلى موضع معين على الجينوم وتحديد أشكال الهيكل أو التسلسل ، مما قد يساهم في تحديد وظيفة أنواع ncRNA محل الاهتمام.

في الماضي القريب ، تم إجراء العديد من الدراسات لتحديد ncRNAs في جينومات الكائنات الحية النموذجية من خلال إنشاء مكتبات cDNA متخصصة. بدأت الدراسة الأولى في الماوس موس العضلات ، حيث تم تحديد 201 مرشحًا لـ ncRNAs من خلال مكتبة cDNA المشتقة من RNAs المختار بالحجم (50-500 nt) من استنساخ 5000 cDNA ، ينتمي نصفها تقريبًا إلى فئة snoRNAs (19). تبع هذه الدراسة باستخدام نهج مماثل للنبات نبات الأرابيدوبسيس thaliana (20) ذبابة الفاكهة ، ذبابة الفاكهة سوداء البطن (23) ، النوعان البدائيان Archaeoglobus fulgidus و Sulfolobus solfataricus (21 ، 22) و eubacteria بكتريا قولونية (63 ، 64) و Aquifex aeolicus ( 65 ).

تم أيضًا تطبيق استنساخ مكتبة cDNA المتخصصة لتحديد فئات فرعية معينة من ncRNAs ، على سبيل المثال miRNAs ، في كائنات نموذجية مختلفة. هنا ، ncRNAs ذات نطاق حجم ضيق للغاية من حوالي 18-25 nt ، أي تتمحور حول الأحجام المعروفة من miRNAs ، تم اختيار حجمها واستنساخها وتسلسلها (10 ، 66-72).

أصبح تحديد ncRNAs الصغيرة عن طريق إنشاء مكتبات cDNA المتخصصة واسع الانتشار الآن ويتضمن تحليل الأميبوزوا مثل العفن الوحل قرص ديكتيوستيليوم (62). لتحديد فئات معينة من ncRNAs (مثل snoRNAs) ، تم استخدام طريقة إنشاء مكتبة cDNA عن طريق الترسيب المناعي باستخدام بروتين رابط لـ snoRNA مثل fibrillarin متبوعًا باستنساخ ncRNAs بنجاح في C / D و H / ACA snoRNAs (26 ، 73 ).

معوقات ومزايا الطريقة

الطريقة المذكورة أعلاه لاستنساخ ncRNAs لها عيوبها من خلال حقيقة أنه قد لا يكون من الممكن دائمًا عكس نسخ ncRNA إلى cDNA بسبب هيكلها أو تعديلها (مثل تعديلات القاعدة أو العمود الفقري). وبالتالي ، من غير المحتمل أن تعكس مكتبة cDNA جميع ncRNAs في الخلية ، كما أنها لن تعكس بالضرورة - بعدد النسخ الفردية (cDNA) - وفرة ncRNA ذات الصلة. الأساس المنطقي وراء ذلك هو أن ncRNAs الأقل تنظيماً / المعدلة يتم نسخها عكسيًا بسهولة أكبر من غيرها وسيتم تمثيلها بشكل كبير داخل مكتبة cDNA بشكل مشابه ، وستكون ncRNAs الأصغر أكثر وفرة من تلك الأطول ، نظرًا لأنه من المرجح أن يتم نسخها بشكل عكسي بالكامل .

بالنسبة لمكتبات cDNA المختارة بالحجم ، بشكل عام ، لن يكون من الممكن تحديد جميع ncRNAs لنوع خلية أو كائن حي ، لأن القطع حسب الحجم (على سبيل المثال 20-500 nt) سيحظر تحديد ncRNAs الأطول (مثل ncRNAs مثل Xist و Air RNA ، والتي تعرض أحجامًا في نطاق العديد من كيلو بايت). بالإضافة إلى ذلك ، نظرًا لطبيعة مكتبة تعبير cDNA ، سيتم اكتشاف أنواع ncRNA فقط ، والتي يتم نسخها من الجينوم. ومع ذلك ، قد يعتمد هذا على حالة نمو معينة للكائن الحي أو على التعبير في نسيج معين. وبالتالي ، لتكون قادرًا على استنساخ جميع متواليات الحمض النووي الريبي المعبر عنها من كائن حي ، من الناحية المثالية ، يجب تحليل جميع مراحل النمو ، في جميع الأنسجة في ظل جميع ظروف النمو والمغذيات الممكنة ، واستخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من هذه الحالات المختلفة. قد لا يكون هذا ممكنًا دائمًا ، وبالتالي لن يتم استنساخ بعض أنواع الحمض النووي الريبي ، التي يتم التعبير عنها في ظل ظروف معينة ، فقط.

بالنسبة لاستراتيجيات الاستنساخ ، فإن استخدام الطريقة الأولى لتحويل ncRNAs إلى cDNAs ، على سبيل المثال طريقة النسخ العكسي ، وتوليف الخيط الثاني وإضافة روابط DNA (انظر أعلاه) لن تؤدي إلى استنساخ cDNA كامل الطول ، وفقًا لتجربتنا ، ولكن في 5-termini مقطوعة تفتقر إلى حوالي 10-15 nt من كامل- طول الحمض النووي الريبي.

على العكس من ذلك ، فإن عيب الطريقتين الثاني والثالث اللذان يشتملان على رابط قليل النوكليوتيد (انظر أعلاه) هو خطوة الربط غير الفعالة إلى حد ما للروابط إلى ncRNA المحتمل محل الاهتمام ، وفشل ارتباط الرابط بالمحطة المعدلة. ومع ذلك ، فإن ميزة هذه الطريقة هي أنه غالبًا ما يمكن الحصول على استنساخ كامل الطول (كدنا) ، مقارنة بالطريقة الأولى.

بشكل عام ، سيؤدي استنساخ (كدنا) إلى تحديد أنواع الحمض النووي الريبي المعروفة الوفيرة للغاية ، مثل الحمض الريبي النووي النقال أو الحمض النووي الريبي الصغير (مثل 5S أو 5.8S rRNAs). للتحايل على التسلسل المتكرر لجينات ncRNA المعروفة بالفعل ، يمكن للمرء محاولة استئصال هذه الأنواع من ncRNA من الهلام بعد PAGE. ومع ذلك ، قد يؤدي هذا إلى فقدان أنواع الحمض النووي الريبي التي تظهر نفس الأحجام أو أحجام مماثلة مثل هذه الأنواع المعروفة من الحمض النووي الريبي. بدلاً من ذلك ، يمكن للمرء أن يكتشف cDNAs على المرشحات (كصمة نقطية) وتهجين المرشحات باستخدام oligonucleotides الموسومة إشعاعيًا الموجهة ضد أنواع ncRNAs المعروفة الأكثر وفرة. بعد ذلك ، يتم تسلسل تلك المستنسخات (كدنا) فقط ، والتي لا تظهر أي إشارة تهجين على التصوير الشعاعي التلقائي للمرشحات.

تحليل ميكروأري

أصبحت المصفوفات الدقيقة هي الطريقة المفضلة لرصد مستويات العديد من النصوص بالتوازي وغالبًا على مستوى الجينوم الكامل (الشكل 1 ج). المصفوفات الدقيقة ، المعروفة أيضًا باسم رقائق الحمض النووي أو مصفوفات التعبير ، عبارة عن شرائح زجاجية (أو سيليكون) تم طباعة مجسات الحمض النووي على سطحها بترتيب يشبه الشبكة. حتى الآن ، فإن أوليغنوكليوتيدات DNA أحادية الشريطة بطول 25-70 هي النوع السائد لمسبار DNA على المصفوفات الدقيقة التجارية ، على الرغم من أن منتجات PCR مزدوجة الشريطة قد تعمل أيضًا كمجسات.

لتحليل المستوى الكامل للنصوص الخلوية ، يتم تحضير العينات من إجمالي الحمض النووي الريبي للكائن الحي. يمكن أن تكون العينات المستخدمة في تهجين المصفوفات الدقيقة هي الحمض النووي الريبي المستخرج ، أو الحمض النووي الريبي المحول أو الحمض النووي الريبي في أي حال ، سيتم تسمية هذه المجسات عمومًا بأصباغ الفلورسنت ، مثل Cy3 أو Cy5. لمزيد من التفاصيل حول بروتوكولات الوسم المختلفة التي يتم استخدامها حاليًا ، انظر المراجع في (74) والعمل المذكور أدناه. يتم بعد ذلك خلط العينة المحضرة بمخزن التهجين وتطبيقها على الشريحة الزجاجية بحيث يتم تهجينها إلى بقعة على المصفوفة الدقيقة.

تألق البقع التي يتم قراءة العينة المهجنة عليها بواسطة ماسح ضوئي ويتم عرض النتائج كنمط ملون ، على سبيل المثال نقاط حمراء أو خضراء ، مع كثافة اللون التي تعكس كمية النصوص التي كانت موجودة في الخلية. إذا تم تهجين عينتين معنون بصبغات مختلفة بالتوازي على نفس المصفوفة الدقيقة ، فإن الألوان الإضافية مثل الأصفر أو البرتقالي ستشير إلى الكميات النسبية للنصوص الفردية في مجموعتي RNA.

تُستخدم المصفوفات الدقيقة في الغالب لتنميط تعبير الرنا المرسال ولكنها يمكن أن تكون أيضًا وسيلة لدراسة تعبير ncRNA أو حتى لاكتشاف ncRNA (الشكل 2). كان التحذير الرئيسي لاستخدامها مع ncRNAs - ولا يزال في بعض الحالات - تصميم المصفوفات الدقيقة المتاحة تجاريًا. نظرًا لأنها مصممة لتنميط mRNA ، فإن معظم هذه المصفوفات تحمل مجسات فقط لمناطق الترميز ، وبالتالي لن يتم اكتشاف النصوص من مناطق الجينوم غير المشفرة. ومع ذلك ، شهدت السنوات القليلة الماضية تحسنًا كبيرًا في هذا الوضع.

في البكتيريا ، يتم ترميز معظم ncRNAs الوظيفية في المناطق الجينية (IGRs). تم تقديم أول مصفوفة ميكروأري تشتمل على IGRs بالإضافة إلى مناطق الترميز للبكتيريا النموذجية بكتريا قولونية عن طريق (75). تحمل صفيفها عالي الكثافة (صفيف التبليط) ∼ 300000 تحقيقات أوليغنوكليوتيد 25 ميكرًا خاصة بالحبال لجميع مناطق mRNA و tRNA و rRNA بدقة 30 نقطة أساس وكذلك لجميع IGRs لـ & gt40 bp بدقة 6 نقاط أساس.

بينما ركزت هذه الدراسة الأولية في المقام الأول على القضايا التقنية لتحديد مستوى mRNA ، واسرمان وآخرون . (2001) استخدم لاحقًا هذا النوع من المصفوفات الدقيقة لتحليل المخرجات النصية من IGRs على وجه التحديد. ووجدوا أن تهجين الصفيف باستخدام الحمض النووي الريبي المستخرج من ثلاث حالات نمو مختلفة أسفر عن إشارات لثلث الحمض النووي الريبي على الأقل التي تم اكتشافها عن طريق التحقيق المتوازي في البقع الشمالية.

هذه التحليلات العالمية ل بكتريا قولونية تم تمديد النسخ لاحقًا بمقدار (76). من خلال تضمين مجموعة أوسع بكثير من ظروف النمو ، تم اكتشاف نسخ إضافية من IGRs التي قد تكون مرشحة جديدة لـ ncRNA. والجدير بالذكر أن كثافة المسبار العالية للغاية هنا سهلت الكشف عن شظايا 3′- أو 5′- UTR RNA التي تتراكم بشكل مستقل بعد معالجة نسخ mRNA.

في دراسة ثالثة مع هذا النوع من المصفوفات الدقيقة ، تم ربط الحمض النووي الريبي الخلوي بـ بكتريا قولونية تم تحليل بروتين Hfq (77). ظهر هذا البروتين الشبيه بالبكتيريا Sm ، على مدى السنوات السابقة ، كلاعب رئيسي في التنظيم بواسطة ncRNAs التنظيمية الصغيرة (78) وكان معروفًا بربط عدد من ncRNAs البكتيرية (أي بالإضافة إلى mRNAs). بحلول وقت دراسة تشانغ وآخرون . (2003) ، كانت 46 ncRNAs معروفة في بكتريا قولونية ، منها 30٪ تم اكتشافها عن طريق تهجين مصفوفة من الحمض النووي الريبي (RNA) الذي شارك في المناعة مع Hfq. للبكتيريا بخلاف بكتريا قولونية ، تم تطبيق microarrys لدعم التنبؤ الحوسبي الحيوي لـ ncRNAs لـ المكورات العنقودية الذهبية (56). على عكس ما سبق ذكره بكتريا قولونية صفيف التبليط قليل النوكليوتيد ، المحدد بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية تم تضخيم IGRs PCR لإنتاج تحقيقات DNA مزدوجة الشريطة التي تم رصدها بعد ذلك على شرائح زجاجية.

على غرار البكتيريا ، تم استخدام المصفوفات الدقيقة بشكل متزايد لتأكيد التنبؤات العالمية لفئات معينة من ncRNAs حقيقية النواة وكذلك لدراسة ملف تعريف تعبيرها في الأنسجة المختلفة. إحدى هذه الفئات ، ∼22 nt microRNAs ، تنضج من 60 إلى 110 nt من نصوص دبوس الشعر pre-miRNA التي يُعتقد أنها مشتقة من منتجات pri-miRNA الأطول. المصفوفات الدقيقة مع 40 أو 60 مللي نيوكليوتيدات للكشف عنها معروف تم تقديم microRNAs أو سلائفها القاسية مؤخرًا (79 ، 80). براد وآخرون . قام (80) بتقييم عدة جوانب من المنهجية من أجل توحيدها وتحديد المعلمات اللازمة لتحقيق تهجين فعال ونتائج موثوقة ، بما في ذلك تحليل عدم التطابق لتحديد خصوصية تحقيقات microRNA. وقد لوحظ أن شدة الإشارة ترتبط بموقع تسلسل الرنا الميكروي داخل مجسات 60mer ، مما يدل على أن الموقع في المنطقة 5 يعطي أعلى الإشارات ، في حين أن الموقع 3 النهاية ينتج عنه إشارات ضعيفة. تم استخدام هذه النتائج لاحقًا لتطوير نهج تكاملي لاكتشاف الرنا الميكروي الجديد ، حيث تم التنبؤ بمناطق سلائف الرنا الميكروي المحتملة في الجينوم البشري وتم اختبار 5300 من هؤلاء المرشحين بطريقة عالية الإنتاجية على المصفوفات الدقيقة المذكورة أعلاه (81).

استخدمت عدة مجموعات مؤخرًا المصفوفات الدقيقة لدراسة ncRNAs للخميرة خميرة الخميرة . بعد العمل في وقت سابق مع المصفوفات الدقيقة التي تحمل مجسات فردية لمجموعة تمثيلية من ncRNAs معينة ، على سبيل المثال snoRNAs (82) ، صمم مختبر هيوز ميكروأري للتبليط لتغطية جميع الخميرة المعروفة والمتوقعة ncRNAs (83). هنا ، تتم تغطية كل نسخة ncRNA بواسطة تحقيقات قليلة النوكليوتيد على فترات ∼5 nt بما في ذلك 100 nt من التسلسل المرافقة على طرفي 5 ′ و 3. حتى الآن ، ومع ذلك ، فقد تم استخدام هذه المصفوفات بشكل أساسي لمراقبة توليف ومعالجة وتعديل ncRNAs المعروفة (84 ، 85).

تم تحديد ncRNAs الخميرة الجديدة عن طريق ميكروأري كامل الجينوم يحتوي على 6700 جزء من PCR لتغطية جميع إطارات القراءة المفتوحة للخميرة ، والحمض النووي الريبي الصغير المشروح وجميع المناطق الجينية (86 ، 87). هنا ، سعى Inada و Guthrie (87) إلى تحديد شركاء RNA الملزمين لخميرة La protein (Lhp1) على نطاق عالمي. La هو بروتين ملزم للـ RNA موجود في كل مكان ويتم حفظه بين حقيقيات النوى. بصرف النظر عن mRNAs الملزمة ، من المعروف أنه يرتبط بالنصوص الأولية لـ RNA polymerase III ، بما في ذلك جميع tRNAs و RNAs الصغيرة الأخرى. لتحديد الحمض النووي الريبي الملزم بشكل انتقائي في الخميرة ، تم تحصين بروتين Lhp1 الموسوم Myc مع الحمض النووي الريبي المرتبط به واستخدمت سلالة غير معلمة كعينة مرجعية في تهجين ميكروأري لاحق (الشكل 2). تضمنت أهداف La المحددة في هذا العمل 20 snoRNAs مشروحة. علاوة على ذلك ، تم اكتشاف ما لا يقل عن ثلاثة جزيئات H / ACA snoRNA جديدة لم يتم شرحها من قبل على هذا النحو حديثًا في المناطق الجينية. تشير الإشارات الإضافية عالية التخصيب من المناطق الجينية الأخرى إلى أنها تمثل أيضًا نسخًا جديدة غير مشروحة قد تكون غير معروفة من الحمض النووي الريبي.

تم الآن أيضًا تطبيق مصفوفات التبليط المخصصة للبحث بشكل منهجي عن ncRNAs الوظيفية في حقيقيات النوى الأعلى. على سبيل المثال ، تم اتباع نهج الحوسبة الحيوية لاستخراج 3478 متوالية جينية وداخلية محفوظة بين جينومات الإنسان والفأر والجرذان ، والتي أظهرت خصائص ncRNAs من خلال عدد من المعايير الأخرى (88). ثم تم استخدام هذه المعلومات لتصميم مصفوفات تبليط تحتوي على مجسات لهذه المجموعة المرشحة ، وتم فحص هذه المصفوفات باستخدام الحمض النووي الريبي المعزول من 16 أنسجة من الفئران من النوع البري. بعد ذلك ، تم اختبار 55 مرشحًا لـ ncRNAs الجديدة المعبر عنها بشكل كبير على البقع الشمالية ، مما يؤكد أن ثمانية منها على أنها RNAs صغيرة وعالية وشاملة في الفئران. ومن المثير للاهتمام ، أنه يمكن أيضًا اكتشاف خمسة فقط من هذه ncRNAs في أنسجة الفئران ، ولكن لم يتم اكتشاف أي منها في الأنسجة البشرية أو الخلايا المستنبتة. قد يشير التعبير المحفوظ عن هذه ncRNAs الخمسة في الفئران والجرذان إلى أن هذه الجزيئات تعمل في هذين الكائنات الحية وإن لم تكن في الإنسان.

معوقات ومزايا الطريقة

قدمت الدراسات المذكورة أعلاه أدلة قيمة لإمكانية هذه التقنية لاكتشاف ncRNA وكذلك المشاكل المرتبطة بالمصفوفات الدقيقة عند فحص ncRNAs الصغيرة وذات التنظيم العالي. تحليل إشارات التهجين من بكتريا قولونية صفائف التبليط لوحظ أنه في كثير من الأحيان فقط مجموعة فرعية من تحقيقات قليل النوكليوتيد ضمن نطاق منطقة نسخ معينة من الرنا النووي الريبي أسفرت عن ذروة إشارة ، على الرغم من أن نفس موقع الرنا الريباسي أعطى نطاقًا قويًا ومتميزًا على البقع الشمالية [راجع. الشكلان 2 و 3 في (18)]. تجادن وآخرون . (76) لوحظ أحيانًا وجود نصوص على الشريط المقابل لـ ncRNA تم التحقق من صحته تجريبياً ، والذي قد يفسر إما نصوص غير معروفة لـ ncRNA أو لمجرد ضوضاء تجريبية.

على الرغم من أنه حتى الآن لم يتم تقييم تقنيات الكشف الدقيق عن الرنا البكتيرية الصغيرة ، والتي عادة ما تكون عالية التنظيم ، بدقة ، فإن تحضير العينة قد يبدو مشكلة كبيرة. حتى الآن ، تتضمن معظم مناهج ميكروأري وضع العلامات الفلورية للحمض النووي الريبي لاستخدامها كعينة. في كثير من الأحيان ، يتم تحويل الحمض النووي الريبي إلى (كدنا) في وجود النيوكليوتيدات المعدلة التي تحمل الأصباغ الفلورية. تتجمع معظم ncRNAs البكتيرية في نطاق حجم 100-150 نانومتر (8 ، 9) ، وبالتالي قد لا يكون النسخ العكسي فعالًا ويمكن أن يعوقه هيكل ثانوي محكم.

سواء نهج وضع العلامات المباشرة ، على سبيل المثال الوسم الكيميائي للحمض النووي الريبي المجزأ كما هو مستخدم بدلاً من ذلك في (18) ، من شأنه أن يحل هذه المشاكل بشكل كامل غير معروف حاليًا. ومع ذلك ، تشانغ وآخرون . (2003) تحسنت بشكل كبير حساسية الكشف عن طريق التهجين المباشر للحمض النووي الريبي إلى صفائف قليل النوكليوتيد دون وضع العلامات أو تخليق (كدنا) (الشكل 2). بدلاً من ذلك ، تم اختبار التهجين باستخدام جسم مضاد يرى الحمض النووي الريبي: هجين الحمض النووي. يتم إثبات الحساسية المحسنة للغاية لهذه الطريقة من خلال الكشف عن OxyS RNA الناجم عن الإجهاد التأكسدي ، والذي يوجد بتركيزات منخفضة جدًا في ظل ظروف النمو المستخدمة في هذه الدراسة.

ومن ثم ، فإن المصفوفات الدقيقة تحمل إمكانات كبيرة ليس فقط لاكتشاف العديد من الرناوات بالتوازي ولكن أيضًا للإشارة إلى النصوص الموجودة عند مستويات منخفضة. كملاحظة تحذيرية ، تؤكد حقيقة أن الغالبية العظمى من مرشحي الفئران ncRNA الذين اقترحهم تحليل ميكروأري فشل في التحليل الشمالي المصب (88) بوضوح على الحاجة إلى التحقق من صحة نتائج تهجين ميكروأري بطرق مستقلة.

يشير هؤلاء المؤلفون أيضًا إلى أن تهجين إجمالي الحمض النووي الريبي المسمى تساهميًا كما هو مطبق في دراستهم ، على عكس الحمض النووي الريبي المنسوخ العكسي المشتق من الحمض النووي الريبي متعدد الأدينات ، سيكون مهمًا في تحليلات صفيف التبليط ، نظرًا لأن أي خطوات تضخيم أو تخصيب من المرجح أن تحرف تمثيل المناطق الكبيرة غير المشفرة للجينومات حقيقية النواة ، وبالتالي قد يجعل من الصعب تمييز هذه الإشارات عن "ضوضاء النسخ" العالمية. يبدو أن تطبيق المعايير الصارمة عند استخدام المصفوفات الدقيقة لاكتشاف الحمض النووي الريبي النووي (ncRNA) أمرًا ضروريًا نظرًا لأن المزيد من البيانات من المصفوفات الدقيقة المبنية على الجينوم الكامل أصبحت متوفرة (89 - 91) وستعمل هذه البيانات بشكل متزايد كمدخلات لتوقعات الحوسبة الحيوية للـ ncRNA من قبل الآخرين [على سبيل المثال. (7)].

سيليكس الجينومية

العديد من ncRNAs تشكل جزيئات البروتين النووي الريبي (RNPs) في نقاط زمنية مختلفة في دورة حياتها. قد تساعد بروتينات ربط الحمض النووي الريبي (RNA) هذه الحمض النووي الريبي (ncRNA) على الانطواء في شكلها النشط ، أو حمايتها من نوكليازات قبل ممارسة وظيفتها أو تعزيز التلدين باستخدام RNAs المستهدفة حتى توجيه البروتين إلى هدفه الصحيح. تتفاعل ncRNAs الأخرى مع البروتينات لتنظيم نشاطها مباشرة.

تسمح التقنيات التي تمت مناقشتها حتى الآن بتحديد ncRNAs من مجموعة RNA الخلوية المعبر عنها بعد التنقية المشتركة مع البروتينات ، أي عن طريق الاستنساخ أو التسلسل المباشر أو تحليل المصفوفة الدقيقة. بالنظر إلى أن العديد من هذه البروتينات تربط روابط الحمض النووي الريبي الخاصة بها في نطاق نانومولار ، ينبغي أيضًا أن يكون من الممكن تحديد روابط الحمض النووي الريبي من مجموعة الحمض النووي الريبي (ncRNAs) التي يمكن للكائن التعبير عنها حتى دون عزلها. في الجسم الحي النصوص.

هذا النهج ، المسمى جينومي SELEX (92) ، يعتمد على في المختبر توليد أنواع الحمض النووي الريبي المستمدة من مكتبة الحمض النووي الجينومي الكامل للكائن الحي (الشكل 1 د). سيخضع تجمع الحمض النووي الريبي المتولد إلى جولات متتالية من الارتباط مع بروتين معين مرتبط بالـ RNA ، وتقسيمه وإعادة تضخيمه. نتيجة لذلك ، سيتم إثراء تسلسلات الحمض النووي الريبي التي ترتبط ارتباطًا صارمًا بشريك البروتين. بمجرد تحديد تسلسل الحمض النووي الريبي المرتبط ، يمكن استخدام هذه المعلومات للبحث عن التطابقات في الجينوم ، وبالتالي يمكن اختبار المناطق الجينومية المتوقعة للتعبير عن ncRNAs غير المعروفة. تم تطبيق Genomic SELEX بنجاح لتحديد شركاء ربط mRNA للبروتينات [على سبيل المثال (93 ، 94)] ، ولكن على حد علمنا ، فإن الدراسات التي ركزت على ncRNAs لم يتم نشرها لأي كائن حي ، حتى الآن.

حاليًا ، اتخذ مختبر شرودر هذا النهج لتحديد RNAs الجديدة المرتبطة Hfq من بكتريا قولونية (C. Lorenz و R. Schroeder ، اتصال شخصي). مكتبة تمثيلية لـ بكتريا قولونية تم إنشاء الجينوم من شظايا DNA الجينومية العشوائية 50-500 زوج قاعدي والتي تم إرفاق روابط محددة بها ، أحدها يحتوي على محفز بوليميريز T7 RNA ، في سياق خطوة إنشاء المكتبة الأولية (92). كانت هذه الشظايا في المختبر نسخ مع بوليميراز T7 RNA ، المحتضن بـ Hfq واختياره لربط Hfq على المرشحات. أخذ مسار SELEX القياسي (95) ، تم تحويل الحمض النووي الريبي المحتفظ به إلى (كدنا) وخضع لجولات إعادة تضخيم واختيار إضافية (ثمانية) ، مما أدى في النهاية إلى مجموعة من الحمض النووي الريبي التي تربط Hfq بـ كد قيم 5-50 نانومتر. بعد ذلك ، تم تحديد تفاعل Hfq النوعي للـ RNAs المخصب في الجسم الحي باستخدام غربال الخميرة ثلاثي الهجين (96). تشير النتائج الأولية إلى أن هذه التجارب حددت عددًا من RNAs الجديدة المرتبطة بـ Hfq ، بما في ذلك الحمض النووي الريبي المضاد للتردد و ncRNAs المرشحة من المناطق الجينية.

معوقات ومزايا الطريقة

من الواضح أن جينوم سيليكس سيكون لها قوتها في العثور على ncRNAs التي يتم تجاهلها من خلال الطرق التي تتطلب التعبير عن جين ncRNA عند مستوى معين. مع أحجام الجينوم الصغيرة ، يجب أن تكون بدائيات النوى قابلة بشكل خاص لهذا النوع من النهج. نظرًا لأن ncRNAs الوظيفية للبكتيريا يتم ترميزها في الغالب بواسطة مناطق جينية ، يمكن تحميل المجموعة الأصلية لشظايا الحمض النووي عن طريق تضخيم هذا الجزء من الجينوم على وجه التحديد ، والذي يشكل في البكتيريا عادةً & lt10 ٪ من الجينوم بأكمله. كميزة إضافية لـ SELEX الجينومي ، يمكن أن يشير الارتباط الوثيق بين ncRNA مع بروتين معين والذي يعد شرطًا أساسيًا لاختياره الناجح إلى الدور البيولوجي لهذا ncRNA ، على سبيل المثال وظيفته كمضاد أو عامل مساعد لنشاط البروتين.

في الوقت الحاضر ، يُعرف عدد قليل جدًا من البروتينات العامة المرتبطة بـ RNA والتي تشكل على وجه التحديد معقدات مع ncRNAs. اثنان من البروتينات التي تمت مناقشتها أعلاه ، Hfq و La (Lhp1p) ، يرتبطان أيضًا بـ mRNAs [المراجع في (78 ، 87)]. وهكذا ، على غرار استنساخ cDNA وتحليل ميكروأري ، من المتوقع أن ينتج عن نهج SELEX الجيني مع بروتينات ربط الحمض النووي الريبي العامة العديد من مرشحات الحمض النووي الريبي الإضافية التي لن يعتبرها المرء بسهولة باعتبارها ncRNAs. علاوة على ذلك ، تشير هذه الطريقة فقط إلى أن موضعًا جينيًا معينًا يمكن أن يكون له وظيفة عند نسخه إلى RNA. ومع ذلك ، فإن الحالة الدقيقة التي يتم فيها التعبير عن مثل هذا الحمض النووي الريبي - إذا كان الأمر كذلك - لا يزال يتعين تحديدها.

الميزة الرئيسية لطريقة SELEX الجينومية ، مقارنة باستراتيجية استنساخ cDNA (انظر أعلاه) ، هي أن الأخيرة تتطلب عزل ncRNAs من كائن حي أو خلية في ظل جميع ظروف النمو والنمو الممكنة ، والتي قد لا تكون دائمًا ممكنة. . في المقابل ، يولد SELEX الجينومي أنواعًا من الحمض النووي الريبي من جميع مناطق الجينوم وبالتالي لا يعتمد على عزل الحمض النووي الريبي من جميع هذه الحالات المختلفة.

مناهج RNomics الوظيفية: التقنيات التي تتبع تحديد الحمض النووي الريبي

لا يمكن اعتبار تحديد ncRNAs إلا خطوة أولى نحو توضيح وظائفها. يجب استخدام المصطلح "مرشح" كلاحقة لـ ncRNA ، طالما لم يتم توضيح وظيفة ncRNA. عندها فقط ، يجب تصنيف أنواع الحمض النووي الريبي على أنها ncRNA حسن النية.

للحصول على تلميحات حول وظيفة مرشح ncRNA ، يمكن إجراء عدة طرق:

نظرًا لأن معظم ncRNAs الوظيفية هي جزء من جسيم البروتين النووي (RNP) ، يمكن البحث عن مكونات البروتين في ncRNAs. يتم تحقيق ذلك ، على سبيل المثال ، باستخدام الحمض النووي الريبي "كطعم" لصيد هذه البروتينات الرابطة في مستخلصات الخلايا. يمكن تصنيع الحمض النووي الريبي باستخدام "علامة تقارب" مثل البيوتين بواسطة T7 RNA polymerase في المختبر النسخ في وجود البيوتين- UTP. ثم تقترن الحمض النووي الريبي المعالج بالبيوتين مع عمود الستربتافيدين. بدلاً من ذلك ، يمكن استنساخ تسلسل الحمض النووي الريبي المرتبط ببروتين معروف 5′- أو 3′- إلى جين ncRNA. من خلال ربط بروتين ربط الحمض النووي الريبي المعروف بدعامة صلبة ، يمكن عزل ncRNP باستخدام علامة RNA المعروفة كطعم (97). يمكن أن يشير توضيح مكونات البروتين لـ RNP إلى وظائفه ، نظرًا لأن البروتينات قد تظهر مجالات ذات نشاط تحفيزي معروف. ل في الجسم الحي التحليل ، تم توسيع نظام الخميرة ثنائي الهجين إلى نظام ثلاثي الهجين ، حيث يتم استخدام ncRNA كطعم في الجسم الحي لصيد البروتينات التي ترتبط به (98).

العديد من ncRNAs التي تم العثور عليها حتى الآن تظهر أهدافًا محددة من الحمض النووي الريبي ، والتي تتعرف عليها من خلال آلية مضادة للحساسية ، على سبيل المثال قاعدة الاقتران Watson – Crick (99). تشمل RNAs الهدف mRNAs أو ncRNAs الأخرى مثل RNAs الريبوسوم أو snRNAs أو الحمض الريبي النووي النقال. لتوضيح أهداف ncRNA ، يمكن استخدام طرق المعلوماتية الحيوية أو التجريبية. بالنسبة لأساليب المعلوماتية الحيوية ، يمكن إجراء البحث عن التكامل. تم تحقيق ذلك بنجاح ، على سبيل المثال ، في حالة أهداف miRNAs (100 ، 101). يمكن أن تشمل الطرق التجريبية أنه من خلال صيد الحمض النووي الريبي ذي الأهمية من خلال بروتين مرتبط بالـ RNA (انظر أعلاه) ، يمكن عزل الحمض النووي الريبي المستهدف ، المكمل لـ ncRNA ، أيضًا. قد يتطلب هذا ارتباطًا متصالبًا قبل عزل مضاعف الحمض النووي الريبي ، اعتمادًا على استقرار تفاعل الحمض النووي الريبي مع الحمض النووي الريبي. بدلاً من ذلك ، من خلال التعبير / الإفراط في التعبير عن ncRNA ذي الأهمية وتحليل ميكروأري اللاحق ، يمكن تحديد أهداف mRNA المحتملة ، إذا كان ncRNAs يؤثر على وفرة هدف (أهداف) mRNA الخاص به في الخلية (102).

تحليل أنماط التعبير من ncRNA ذي الأهمية: على سبيل المثال ، قد يُلقي التوطين الخلوي / دون الخلوي لجسيم RNA / RNP بعض الضوء الإضافي على وظيفته ، على سبيل المثال قد يشير التوطين في النواة أو النواة أو السيتوبلازم إلى مشاركة ncRNA في الوظائف التي تمارس في هذه الأجزاء الخلوية. تحقيقا لهذه الغاية ، الفلورسنت فى الموقع يمكن استخدام تقنيات التهجين لتوطين الحمض النووي الريبي ذي الأهمية (103). بالإضافة إلى توطين الخلايا الفرعية للـ ncRNAs ، يمكن تحليل التعبير الخاص بالأنسجة أو التعبير التطوري لـ ncRNAs عن طريق النشاف الشمالي ، باستخدام الحمض النووي الريبي الكلي من الأنسجة المختلفة أو الحالات التنموية. وبالتالي ، إذا تم التعبير عن ncRNA في الدماغ فقط ، في مرحلة نمو معينة ، على سبيل المثال ، يمكن البحث عن وظيفة ncRNA ضمن نافذة التعبير الزماني والمكاني للكائن الحي.

في النهاية ، لمعالجة وظيفة ncRNAs ، يجب القضاء على جيناتها في جينومات الكائنات الحية المعنية. في حالات أخرى ، كان الإفراط في التعبير عن جينات ncRNA مفيدًا للحصول على نمط ظاهري أكثر بروزًا [انظر مناقشة مناهج البلازميد متعدد النسخ في (36)].

لبعض أنواع البكتيريا مثل بكتريا قولونية عادة ما يتم حذف الجينات في غضون أيام قليلة (104 ، 105).بالنسبة لمعظم الكائنات الحية الأخرى ، تتوفر فقط تقنية الضربة القاضية التقليدية التي تستغرق وقتًا طويلاً لهذا الغرض. في الآونة الأخيرة ، تم إثبات أن استراتيجيات التدمير الأكثر أناقة عن طريق تداخل الحمض النووي الريبي ، والتي تم تطبيقها حتى الآن فقط على mRNAs المشفرة للبروتين ، - في بعض الحالات - مناسبة أيضًا لاستنفاد ncRNA السريع (106 ، 107) ومع ذلك ، فإن الآلية من خلال أي RNAi يستهدف ncRNAs غير معروف تمامًا. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت دراسة أنيقة جدًا مؤخرًا إمكانات جزيئات الرنا المرسال المعدلة كيميائيًا (ما يسمى بـ "antagomirs") لتدمير أنواع معينة من جزيئات الرنا المرسال (108).


أهداب ، الجزء ب

ليس جاكوبسن و. Jens S. Andersen، in Methods in Enzymology، 2013

2.2 وضع العلامات الأيضية

من أجل وضع العلامات على النظائر المستقرة بواسطة الأحماض الأمينية في زراعة الخلايا (SILAC) (Ong et al. ، 2002) ، قم بتنمية الخلايا في وسط استزراع مخصص RPMI بدون أرجينين ولايسين مع 10٪ مصل بقري جنيني مُحلل ، 100 وحدة U بنسلين / مل ، 100 ميكروغرام الستربتومايسين / مل ، و 2 مم L- الجلوتامين في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2. استكمل الوسط إما بـ l -lysine 1 H (Lys0) و l -arginine 12 C.6، 14 شمال4 (Arg0) أو أحماض أمينية "متوسطة" ذات نظائر مستقرة L -lysine 2 H4 (Lys4) و ارجينين 13 سي6، 14 شمال4 (Arg6) للتجارب التي تستند إلى مجموعتين من الخلايا. ثقافة الخلايا لستة انقسامات خلوية على الأقل لدمج الأحماض الأمينية SILAC بشكل كامل. يمكن أيضًا استكمال الوسيط بنظير مستقر يسمى L -lysine 13 C "ثقيل"6، 15 شمال2 (Lys8) و ارجينين 13 سي6، 15 شمال4 (Arg10) للتجربة على أساس ثلاث مجموعات من الخلايا مثل تجربة PCP-SILAC المزدوجة (الشكل 18.2). لتقليل كمية الأحماض الأمينية ذات العلامات النظيرية باهظة الثمن ، يمكن حذف الأرجينين أو إضافته عند 1/3 التركيز الطبيعي في وسط RPMI. إذا تم حذف الأرجينين ، فقم بهضم البروتينات إلى الببتيدات باستخدام endoprotease Lys-C فقط وليس التربسين.

الشكل 18.2. عزل الجسيمات المركزية وتحديد البروتينات المركزية بواسطة PCP-SILAC. (أ) مخطط تخطيطي لبروتوكولات عزل الجسيم المركزي وإعداد العينة للبروتيوميات القائمة على قياس الطيف الكتلي. يتم فصل الجسيمات المركزية عن شبكة الهيكل الخلوي ، والنواة ، والخيوط الوسيطة عن طريق معالجة الخلية بالنوكودازول والخلوي الخلوي D وتحلل الخلية في المخزن المؤقت ذو القوة الأيونية المنخفضة. تتم إزالة الكروماتين عن طريق التجميع والطرد المركزي. يتم ترسيب الجسيمات المركزية على وسادة السكروز وإثرائها عن طريق الطرد المركزي المتدرج للسكروز. يتم هضم البروتينات في كل جزء من الأجزاء المجمعة مع التربسين ، ويتم تحليل الببتيدات الناتجة بواسطة LC-MS. (ب) تنميط ارتباط البروتين (PCP) للبروتينات المركزية. يتم الحصول على ملفات تعريف وفرة البروتين من بيانات LC-MS من خلال دمج إشارة كثافة أيون الببتيد لكل بروتين في كل جزء. يعرض الجدول الموجود في أقصى اليسار ملف تعريف الوفرة لبروتينات العلامة المركزية المحددة ويعرض الجدول الأيمن القيم النسبية بعد التطبيع. تكشف الحبكة عن الكسور التي تحتوي على الجسيم المركزي ويمكن استخدامها لتمييز البروتينات المركزية الأصلية عن البروتينات غير المحددة المشتركة من خلال مقارنة ملفات التعريف لجميع البروتينات مع ملفات تعريف البروتينات المركزية المعروفة. (A ، C) PCP للبروتينات المركزية من الخلايا التي تحمل علامة SILAC (PCP-SILAC). يمكن استخدام Centrosomes المعزولة من مجموعات خلايا مختلفة تحمل علامات النظائر لتشكيل البروتينات بشكل أكثر دقة وبالتالي زيادة الثقة في تخصيص البروتينات المركزية. يتم دمج الكسور المحتوية على الجسيم المركزي من الخلايا ذات العلامات الضوئية لتوليد معيار داخلي ، والذي يتم توزيعه بعد ذلك على الكسور المقابلة المحضرة من الخلايا ذات العلامات المتوسطة والثقيلة. يتم تحضير الببتيدات من العينات المختلطة وتحليلها بواسطة LC-MS. (ج) يتم اشتقاق ملفات التخصيب النسبية لكل بروتين في المستحضرات ذات العلامات المتوسطة والثقيلة من بيانات LC-MS عن طريق حساب نسب البروتين المتوسطة / الخفيفة والثقيلة / الخفيفة لجميع البروتينات في كل جزء. تمثل الملامح الموضحة البروتينات المركزية المعروفة والمرشحة وبروتين واحد غير محدد (RPL6).


ما هي لقاحات mRNA ، وهل يمكن أن تعمل ضد COVID-19؟

في وقت سابق اليوم ، أعلنت شركة تصنيع الأدوية Moderna أن لقاح فيروس كورونا الذي ابتكرته فعال بنسبة 94.5٪ في تجربة كبرى. جاءت هذه الأخبار بعد أسبوع من إعلان شركتي Pfizer و bioNTech أن لقاح فيروس كورونا الخاص بهما فعال بنسبة تزيد عن 90٪. جاءت النتائج من كلا الشركتين ، والتي فاقت التوقعات ، من دراسات كبيرة ومستمرة ولم يتم نشرها في المجلات المحكمة. ومع ذلك ، فإن النتائج هي علامة على الأمل & # 8212 قد تسعى الشركات للحصول على إذن للاستخدام في حالات الطوارئ في الولايات المتحدة في غضون أسابيع & # 8212 على الرغم من أن الخبراء يحذرون من أن اللقاحات لن تكون متاحة على نطاق واسع على الأرجح لعدة أشهر.

في يوليو الماضي ، حفزت الحكومة الأمريكية السباق لتطوير لقاح عندما وافقت على دفع 4 مليارات دولار إلى ست شركات أدوية مقابل وعد بتقديم 100 مليون جرعة من لقاح جديد ضد فيروس كورونا الجديد بحلول أوائل عام 2021. هذا الجدول الزمني هو سريع بشكل مذهل ، حيث يتطلب تطوير لقاح جديد عادةً عدة سنوات ، لكنه أظهر الإلحاح الذي يحاول العلماء حول العالم إبطاء Covid-19 به.

يجلب العدو السريع للقاح تقنية جديدة إلى الواجهة: استخدام الرنا المرسال (mRNA). إذا نجحت ، فإن ابتكارات Moderna و Pfizer & # 8217s / bioNTech & # 8217s ستكون أول لقاحات mRNA متوفرة تجارياً على الإطلاق لأي فيروس.

ما هو لقاح mRNA؟

داخل جسم الإنسان ، يوفر الحمض النووي الريبي الرسول المعلومات التي يستخدمها الحمض النووي لصنع البروتينات التي تنظم خلايانا وأنسجتنا. تستخدم الفيروسات الحمض النووي الريبي (RNA) لغرض أكثر شيطانية. إنهم يفتقرون إلى الآلية الخلوية لتكرار نفسها ، لذا فهي تغزو الخلايا السليمة وتنتشر داخلها ، مما يتسبب في بعض الأحيان في المرض أو الموت. على سبيل المثال ، يمكّن mRNA الموجود في الفيروس التاجي الجديد وراء Covid-19 بروتين & # 8220 spike & # 8221 الذي يخترق الخلايا في جميع أنحاء الجسم. هذا ضار بشكل خاص عندما يغزو الفيروس الرئتين ، مما يجعل عملية التنفس البسيطة صعبة.

يحتوي لقاح mRNA على نسخة اصطناعية من الحمض النووي الريبي الذي يستخدمه الفيروس لتكوين البروتينات. لا يحتوي اللقاح & # 8217t على معلومات وراثية كافية لإنتاج بروتينات فيروسية كافية فقط لخداع جهاز المناعة ليعتقد أن الفيروس موجود حتى ينطلق في العمل لصنع الأجسام المضادة ، وهي بروتينات مصممة خصيصًا لمحاربة الفيروس.

تعمل اللقاحات التقليدية ، مثل لقاحات الأنفلونزا أو الحصبة ، على تنشيط جهاز المناعة عن طريق حقن الأشخاص بكميات صغيرة من الفيروس. قد تشمل اللقاحات أشكالًا أضعف من الفيروس # 8220 & # 8221 ، أو فيروس قتله العلماء ولكن لا يزال بإمكان بروتيناته الفيروسية تحفيز المناعة. يقول درو وايزمان ، عالم المناعة في جامعة بنسلفانيا والخبير في لقاحات الرنا المرسال ، إنه في بعض الحالات النادرة جدًا لا يموت الفيروس على الرغم من الجهود المبذولة لقتله ، أو أن الجرعة المخففة قوية جدًا لدرجة تجعل البعض يمرض. لقاحات الرنا المرسال تقضي على هذا القلق لأنها لا تحتوي على أي فيروس.

يقول: "لا يمكنك أبدًا صنع فيروس معدي باستخدام الرنا المرسال".

كما يقول ، هناك نقطة ضعف أخرى في اللقاحات التقليدية ، وهي أنها قد تستغرق وقتًا طويلاً لتطويرها. لصنع لقاح ، يقوم العلماء عادةً بزراعة شكل ضعيف من الفيروس في بيض الدجاج ويختبرون أي أجزاء من الفيروس تستخرج الأجسام المضادة بنجاح. قد يستغرق هذا من أربعة إلى ستة أشهر في حالة لقاح الإنفلونزا السنوي ، على الرغم من أن العلماء يعرفون بالفعل كيفية صنع هذه اللقاحات وأي سلالات من الأنفلونزا من المرجح أن تسود في أي عام معين. مع وجود فيروس جديد تمامًا ، يمكن أن تمتد عملية صنع اللقاح إلى سنوات أو حتى عقود. اختبار لقاح جديد على نطاق واسع ، رغم أنه ضروري لضمان السلامة ، إلا أنه يستغرق وقتًا أيضًا.

"لنفترض أنك تريد أن تصنع فيروسًا مميتًا ، & # 8221 Weissman يقول. & # 8220 أولاً ، عليك معرفة كيفية زراعته ، وكيفية زراعته على نطاق واسع. ثم عليك التفكير في القضاء عليه ، ولكن لا تقم بتغييره حتى لا يقوم بعمل استجابة مناعية تحمي المضيف. ثم بعد القيام بذلك ، عليك أن تظهر أن الفيروس في الواقع قد مات. & # 8221

مع انتشار الوباء ، تعد السرعة عنصرًا جوهريًا ، ولذلك يحاول باحثو اللقاحات تسريع الجدول الزمني. يقول وايزمان: "ميزة الحمض النووي الريبي هي أنه يستغرق أيامًا حرفيًا لصنع لقاح جديد".

بمجرد أن يحدد الباحثون الرنا المرسال الذي ينتج عنه إنتاج الفيروس المعني لبروتيناته ، يمكن للعلماء صنع الحمض النووي الريبي الاصطناعي الذي يصبح أساسًا للقاح جديد. في سيناريو مثالي ، سيستخدم العلماء إنزيمات مختارة خصيصًا لتحفيز إنتاج هذا الرنا المرسال الاصطناعي ، ومن ثم لف الرنا المرسال في غلاف وقائي لمنعه من التدهور.

إذن أين هي لقاحات الرنا المرسال لدينا؟

كانت إمكانية الحصول على لقاحات mRNA موجودة منذ عام 1990 عندما قام الباحثون بحقن mRNA لأول مرة في الفئران واستنباط إنتاج الأجسام المضادة. في هذه السنوات المبكرة ، كان توصيل الحمض النووي الريبي (mRNA) يمثل خطرًا على الفئران التي تموت أحيانًا بسبب الالتهاب المفرط بعد تلقي الحمض النووي الريبي (RNA). قامت هذه الفئران المؤسفة بتنشيط ما يُعرف بالاستجابة المناعية الفطرية ، وهي استراتيجية عشوائية تستخدمها الثدييات لمقاومة أي شيء قد يكون ضارًا. كانت هذه عقبة خطيرة ، حيث لم يتمكن الباحثون من صنع لقاح mRNA صالح للاستخدام دون اكتشاف كيفية قمع هذه الاستجابة ، كما يقول وايزمان.

بدأت القصة تتغير في منتصف العقد الأول من القرن الحادي والعشرين عندما اكتشف وايزمان وزميله كاتالين كاريك & # 243 كيفية تقليل أو القضاء على مخاطر الالتهاب. تبين أن الإجابة هي مواد إضافية مثل ذرات الكربون إلى mRNA دون تغيير وظيفتها. يقول وايزمان: "عندما تغير بنية بعض قواعد الحمض النووي الريبي ، فإنك تتخلص من القدرة الالتهابية للحمض النووي الريبي".

تمنع هذه الإضافات أجهزة الاستشعار الموجودة على الخلايا من المبالغة في رد فعلها تجاه الرنا المرسال المحقون حديثًا. تم دمج هذا الفهم في اللقاحات التي تختبرها Moderna و Pfizer / bioNTech. (Karik & # 243 هو نائب الرئيس الأول في bioNTech Weissman ، وهو مستشار في bioNTech.)

في شهر يوليو الماضي ، بدأت كل من Moderna و Pfizer / bioNTech دراسات لقاحات الرنا المرسال في حوالي 30 ألف شخص لكل فرد ، على أمل إظهار أن لقاحاتهم آمنة في مجموعات كبيرة من الناس وفعالة في بناء بعض المناعة ضد فيروس كورونا. مع نتائج نوفمبر ، اقترب العالم خطوة واحدة من لقاح mRNA الأول وطريقة لإبطاء وباء Covid-19.

تقول سارة سليمان ، أخصائية المناعة في جامعة هارفارد ، إن الحجم الهائل لوباء COVID-19 يعني أن أنواعًا متعددة من اللقاحات ستكون ضرورية & # 8212mRNA وغير ذلك. & # 8220 في حالة COVID يمكننا & # 8217t وضع كل بيضنا في سلة واحدة ، & # 8221 سليمان يقول. & # 8220 من الناحية المثالية ، تريد إعطاء العالم كله هذا اللقاح. & # 8221 بحجة أنه لا توجد شركة واحدة يمكنها تلبية الطلب العالمي على اللقاح.

يقول سليمان ، في الأوقات الأقل تطرفًا ، لن تصنع الشركات ملايين جرعات اللقاح دون دليل قوي على أن اللقاح سيمكن مناعة طويلة الأمد. مع COVID-19 ، قد تبدأ الشركات في إنتاج ملايين الجرعات بناءً على أدلة أقل صلابة حتى تكون جاهزة للتوزيع بمجرد موافقة المجموعات الحكومية مثل إدارة الغذاء والدواء عليها.

يرى درو وايزمان مستقبلًا كبيرًا للقاحات الرنا المرسال بعد الوباء أيضًا. ويقول إنه ربما في يوم من الأيام يمكن أن يحل لقاح mRNA واحد (يُستكمل أحيانًا بجرعات معززة) محل اللقاحات العشرين أو نحو ذلك التي يتلقاها الأطفال اليوم. لكن سليمان أكثر حذرًا ، مشيرًا إلى أن لقاح الحصبة يعمل بالفعل كما هو ولا يحتاج إلى إعادة التكوين. وتقول إنه يجب علينا حفظ mRNA للقاحات جديدة لمواجهة التهديدات الجديدة & # 8212 لا إعادة اختراع العجلة.


نتائج

تُظهر الأورام الغدية المنتشرة والمعوية من النوع المعوي اختلافات قوية في ملفات تعريف mRNA

تم استخدام عينات السرطانات الغدية المعدية التي يمكن تخصيصها بوضوح لنوع الأمعاء أو النوع المنتشر والتي تحتوي على 75٪ على الأقل من الأنسجة الورمية لتشكيل المجموعتين النسجية (المنتشرة) ن= 19 معوي ن= 24). تم تحديد الجينات المعبر عنها تفاضليًا بين هذه المجموعات بواسطة اختبار ويلش. تم قبول الدلالة في التعبير التفاضلي في اختبار متعدد تم تصحيحه ص& lt0.05 واختلاف ذو مغزى في التعبير في FC ≥2. أسفرت كل طريقة اختبار متعددة عن عدد مختلف من الجينات مع اختلافات كبيرة في التعبير. أدى تطبيق Bonferroni FWER ، وهو أسلوب الاختبار المتعدد الأكثر تحفظًا وصرامة ، إلى 207 نسخة مشروحة فريدة و 44 نصًا فريدًا غير مشروح (322 مجموعة مسبار). حدد أسلوب Benjamini و Hochberg FDR الأكثر اعتدالًا 1280 نصًا مشروحًا فريدًا و 253 نصًا فريدًا غير مشروح (2071 مجموعة مسبار). في كلا نظامي الاختبار ، تم تنظيم غالبية الجينات المعبر عنها تفاضليًا (على سبيل المثال ∼ 73 ٪ لـ FDR) في أورام من النوع المنتشر ، في حين تم تنظيم عدد أقل من الجينات (على سبيل المثال ∼ 27 ٪ لـ FDR) في النوع المعوي (الشكل 1) ). يمكن العثور على قوائم مشروحة من الجينات الخمسين التي أظهرت التنظيم الأكثر أهمية في أي من النوعين النسيجي في الجدولين التكميليين S1 و S2. أسفر التجميع الهرمي ثنائي الاتجاه باستخدام قوائم الجينات التي تم الحصول عليها عن مخططات شجرية تضم مجموعتين رئيسيتين من العينات تمثل النوعين النسيجيين ومجموعتين جينيتين رئيسيتين تشيران إلى اتجاه التنظيم. ومع ذلك ، فإن استخدام قائمة الجينات المكتسبة بواسطة FDR أدى إلى 95.3٪ (41 من 43) من العينات التي تم تجميعها في المجموعة المعنية (الشكل 1 أ) ، في حين أن قائمة FWER المختارة بشكل أكثر صرامة أنتجت مخطط شجر عينة فيه 97.7٪ (42 من 43) تم تجميعها "بشكل صحيح" (الشكل 1 ب). كانت العينة التي تم تجميعها بشكل خاطئ (الشكل 1 ب) عبارة عن ورم من النوع المنتشر متجمع إلى نوع الورم المعوي. كان يمتلك عددًا كثيفًا من الخلايا السرطانية مع عدم وجود سدى تقريبًا ، وهي سمة غير شائعة إلى حد ما لأورام غدية معدية منتشرة.

خرائط الحرارة التجميعية الهرمية ثنائية الاتجاه للجينات المعبر عنها تفاضليًا بين السرطانات المنتشرة للإنسان والأورام الغدية المعوية من النوع المعوي. تم تحديد الجينات التي كان تعبيرها مختلفًا بشكل كبير بين العينات المنتشرة والنوع المعوي بواسطة اختبار ويلش. تم تطبيق تقنيات اختبار متعددة مختلفة لتصحيح الإيجابيات الخاطئة وأسفرت عن أعداد مختلفة من مجموعات المجسات المهمة التي اجتازت الاختبار (مصحح ص& lt0.05 أضعاف التغيير ≥2). تم استخدام قوائم مختلفة لاحقًا للتجميع الهرمي ثنائي الاتجاه. يتم تصوير شدة التعبير الطبيعي لمجموعات المجسات كخريطة حرارة. تم استخدام "المسافة الإقليدية" و "الربط الكامل" كمقياس للمسافة وخوارزمية ربط لجميع المجموعات. (أ) تم الحصول على خريطة حرارية للتجميع الهرمي لتوقيع 1533 جينًا (2071 مجموعة مسبار) تم تحديدها من خلال تطبيق Benjamini و Hochberg False Discovery Rate (FDR). (ب) تم الحصول على خريطة حرارة للتجميع الهرمي لتوقيع 251 جينًا (322 مجموعة مسبار) تم تحديدها من خلال تطبيق Bonferroni Family Wise Error Rate (FWER). (ج) تم الحصول على خريطة حرارة للتجميع الهرمي عند استخدام مجموعة المسبار لـ THBS4، الجين ذو الأهمية الأقوى في نظام الاختبار هذا وحده.

الجينات المنتظمة في الأورام الغدية المنتشرة والمعوية من النوع المعوي تنتمي إلى عمليات بيولوجية مختلفة

تؤدي تصحيحات الاختبار المتعددة الصارمة للغاية ، مثل Bonferroni FWER ، إلى مقايضة من حيث أنها قد تؤدي إلى إنتاج عدد كبير من السلبيات الخاطئة. ومن ثم ، تم استخدام الجينات الهامة التي حددها Benjamini و Hochberg FDR للتفسير البيولوجي. كشف تحليل GO أن الجينات التي يتم التعبير عنها بشكل مفرط في الأورام الغدية المعوية من النوع المعوي ترتبط في الغالب بالعمليات المرتبطة بالانتشار والنمو ، مثل دورة الخلية والانقسام (الجدول 1). على النقيض من ذلك ، فإن معظم الجينات المنتظمة في أورام سرطانية معدية من النوع المنتشر تشفر لبروتينات المصفوفة خارج الخلية أو للبروتينات التي لها أدوار مهمة في الالتصاق أو العمليات التنموية (الجدول 2). لم تتم مشاركة أي من مصطلحات GO المخصبة بشكل كبير بين النوعين.

Thrombospondin 4 - العلامة الأكثر فاعلية لسرطان غدي معدي من النوع المنتشر في مجموعة البيانات هذه

ضبط المسبار مع أعلى FC وأدنى ص- تمثل القيمة في نظام الاختبار هذا الثرومبوسبوندين 4 (THBS4) نسخة طبق الأصل. تم تنظيمه بنسبة 40.8 ضعفًا في الأورام المنتشرة وتم تصحيح FDR ص-قيمة 1.65E − 7. مجموعات هرمية ثنائية الاتجاه تعتمد على THBS4 أسفرت مجموعة التحقيق وحدها عن نفس "الصحة" في تجميع العينات كما هو الحال عند استخدام توقيع الجين الناتج عن FDR بالكامل (الشكل 1 ج). تم تصنيف نوعين فقط من الأورام المنتشرة بشكل خاطئ في كتلة الورم المعوي. لم تكن هناك سمات نسيجية غير عادية شائعة لهذه العينات. كان أحدهما عبارة عن سرطان غدي مخاطي (G3) مع انخفاض كثافة الخلايا السرطانية. الآخر ، في المقابل ، كان سرطانة غدية (G3) مع خلايا ورمية كثيفة للغاية وتقريباً لا سدى.

تم إجراء PCR الكمي في الوقت الحقيقي للتحقق من صحة THBS4 بيانات ميكروأري (في جميع العينات 43). أكد التحليل بوضوح الأهمية القوية في تعبير mRNA التفاضلي (ص& lt0.0001 ، مان ويتني يو-test) وأثبت ذلك THBS4 يغيب الرنا المرسال بشكل أساسي عن غالبية الأورام الغدية المعوية من النوع المعوي لهذه المجموعة ، في حين توجد كميات متزايدة داخل السكان من النوع المنتشر (الشكل 2). كشفت إعادة التقييم المرضي أن الأورام المعوية القليلة التي أظهرت بعض التعبيرات الضعيفة كانت جميعها ملوثة بكميات صغيرة من العضلات الملساء ، ويرجع ذلك أساسًا إلى أن جزء الورم الذي تم تحليله مشتق من منطقة تم فيها اختراق طبقات العضلات. أظهر تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بالإضافة إلى ذلك أن عيّنتي سرطانة المعدة المنتشرة التي تم تصنيفها بشكل خاطئ إلى سكان الأمعاء وفقًا للتكتل (راجع الشكل 1 ج) تظهر كميات أعلى قليلاً من THBS4 mRNA من غالبية العينات المعوية ، ولكن بكميات أقل من تلك الموجودة في بقية الأورام الغدية المعوية المنتشرة. أكد الكشف الكيميائي المناعي لبروتين THBS4 داخل عينات الورم المختارة عشوائيًا أن الاختلافات النسخية تنعكس على مستوى البروتين. جميع الأورام المنتشرة التي تم فحصها (ن= 10) أظهر إيجابية محددة لـ THBS4 ، في حين أنه لا يمكن ملاحظة أي إيجابية ملحوظة في السكان من النوع المعوي (ن= 5) (الشكل 3).

THBS4 تعبير الرنا المرسال في الأورام الغدية المعوية المنتشرة في الإنسان. وفرة مرنا THBS4 تم فحصه عن طريق PCR في الوقت الحقيقي الكمي. تم إجراء الكميات بالنسبة إلى نسخة الأكتين ، β (ACTB). تم حساب الدلالة في التعبير التفاضلي بين المجموعات باستخدام Mann-Whitney يو-اختبار. يتم عرض توزيع قيمة التعبير داخل المجموعات بواسطة مخططات المربع والشعيرات.

تعبير THBS4 في الأورام الغدية المعدية المنتشرة والأمعاء من النوع المعدي والأغشية المخاطية المعدية غير الورمية. تم إجراء الكشف الكيميائي المناعي لـ THBS4 (أحمر) في 10 ميكرومترم تجميد رقيقة. تمت مواجهة نوى الخلية باستخدام الهيماتوكسيلين (الأزرق). في الأورام المنتشرة ، لوحظ تعبير THBS4 في الغالب على أنه هياكل مصفوفة خارج الخلية ليفية لسدى الورم (أد).من حين لآخر ، تم الكشف عن إيجابية خلوية للخلايا تشبه الخلايا الليفية (ج, د). كان التعبير قويًا بشكل خاص في أعشاش الخلايا السرطانية (أ, ج) وفي مناطق الغزو في ظهارة صحية (خط منقط في ب). يشار إلى أمثلة لخلايا حلقة الخاتم برؤوس سهام. لا يمكن تحديد أي تعبير محدد عن THBS4 داخل أورام الأمعاء والظهارة وسدى الغشاء المخاطي المعدي غير الورمي (المنطقة المصورة كانت على نفس شريحة العينة كعينة من النوع المنتشر أ). يتم عرض الأقسام التمثيلية ، على التوالي. تم الحصول على الضوابط السلبية عن طريق حذف الجسم المضاد الأولي (البيانات غير معروضة). يتم تكبير الصور × 400 باستخدام أشرطة مقياس تمثل 50 ميكرومترم لكل منهما.

Thrombospondin 4 هو أحد مكونات سدر الورم الغزير للغاية من الأورام الغدية المعدية المنتشرة

تم تتبع توطين THBS4 داخل الأورام الغدية المعدية المنتشرة إلى سدى الورم. كانت جميع العينات التي تم فحصها إيجابية لـ THBS4 في الهياكل الليفية خارج الخلية المحيطة بالخلايا السرطانية (الشكل 3 أ و ب). في بعض الحالات ، يمكن الكشف عن إيجابية إضافية داخل الخلايا في السدى (الشكل 3 ج ود). كانت الخلايا التي تظهر تعبير THBS4 العصاري الخلوي صغيرة الحجم إلى حد ما ولها شكل مغزلي أو يشبه المغزل ، مصحوبة أحيانًا بعمليات خلية ممتدة. كل هذه الميزات تلمح إلى النمط الظاهري للأرومة الليفية. كان تعبير THBS4 قويًا بشكل خاص داخل المناطق ذات الكثافة العالية لخلايا الورم ، وما يسمى بأعشاش الخلايا السرطانية (الشكل 3 ج) ، وفي مواقع التسلل إلى الأنسجة "السليمة" المجاورة (الشكل 3 ب). لا ظهارة ولا سدى لنظرائهم غير الورمي المتطابق (ن= 5) عرضت أي تعبير THBS4 قابل للاكتشاف (الشكل 3). كانت الجوانب الوحيدة لجدار المعدة غير الورمي ، والتي أظهرت بالتأكيد تعبير THBS4 ، هي طبقات العضلات الملساء (الخلايا الخلالية والمحيط) من الغشاء المخاطي العضلي والبروبريا العضلية وكذلك جدران الأوعية (الشكل التكميلي S1).

في الأورام الغدية المعدية المنتشرة من النوع المنتشر ، يتم التعبير عن Thrombospondin 4 وإفرازه بواسطة الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان

تم إجراء دراسات تكوينية كيميائية مناعية باستخدام علامات لكيانات خلوية مختلفة لتحديد الخلايا التي تتميز بإيجابية THBS4 الخلوية ، أي تلك التي تعبر عن البروتين وتفرزه. خدم السيتوكيراتين كواسمات للخلايا ذات الأصل الظهاري (في هذه الحالة الخلايا السرطانية). تم استخدام Vimentin لتحديد الخلايا الليفية والخلايا الوسيطة بشكل عام. α- تم استخدام أكتين العضلات الملساء لتمييز الخلايا الليفية العضلية ، 35 والتي تمثل مجموعة سكانية فرعية من الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان في التحول الخبيث. لم تظهر أي من الخلايا الإيجابية لـ THBS4 أي إيجابية تجاه السيتوكيراتين ، في حين كانت جميعها إيجابية بالنسبة للفيمنتين و α- الأكتين العضلي الأملس (الشكل 4). وهكذا ، فإن الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان من النمط الظاهري للأرومة الليفية العضلية هي الخلايا التي تعبر عن THBS4 في الأورام الغدية المعدية المنتشرة.

كولوكليشن من THBS4 و cytokeratin و vimentin و α- الأكتين العضلي الأملس في الأورام الغدية المعدية المنتشرة في الإنسان. الكشف الكيميائي المناعي الفلوري المتزامن لـ THBS4 باللون الأحمر و pan-cytokeratin (KRT) ، vimentin (VIM) أو α- الأكتين العضلي الأملس (αSMA) باللون الأخضر تم إجراؤه في 10 ميكرومترم تجميد رقيقة. تم مسح الإشارات باستخدام مجهر مسح ليزر متحد البؤر. يتم عرض الصور التمثيلية لأقسام (كنفوكل) واحدة ، على التوالي. تم الحصول على عناصر التحكم السلبية عن طريق حذف الأجسام المضادة الأولية وتم مسحها ضوئيًا باستخدام إعدادات متطابقة (الثقب ، والإثارة ، ومتوسط ​​الإطار ، وما إلى ذلك) للبقع الإيجابية ، على التوالي (البيانات غير معروضة).

بالإضافة إلى، في المختبر تم فحص أنظمة خط الخلايا من نوع منتشر من سرطان المعدة الغدي المشتق من السرطان المرتبط بالسرطان والخلايا الليفية الطبيعية المشتقة من النظير الصحي من أجل THBS4 تعبير مرنا. في زوجي خط الخلية اللذين تم فحصهما ، احتوت الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان على مستويات تعبير أعلى بشكل ملحوظ (ص& lt0.01 ، ر-اختبار) من الخلايا الليفية العادية مع زيادة التعبير عن 2 و -3.3 أضعاف ، على التوالي (الشكل 5).

THBS4 تعبير mRNA في الخلايا الليفية المصاحبة للسرطان والمشتق من سرطان المعدة المنتشر من النوع البشري والخلايا الليفية الطبيعية المشتقة من النظير الصحي. تم تحليل سطرين من الخلايا الليفية المتطابقة من النوع المنتشر والمشتق من سرطان المعدة المرتبط بالسرطان (CAF-32 ، CAF-33) والخلايا الليفية الطبيعية المشتقة من النظير (NF-32 ، NF-33). تم فحص وفرة mRNA عن طريق PCR الكمي في الوقت الحقيقي. تم إجراء الكميات بالنسبة إلى نسخة الأكتين ، β (ACTB) وتم تعيين مستويات التعبير في خطوط NF على 100٪ ، على التوالي. تم تقييم أهمية في التعبير التفاضلي باستخدام ر-اختبار ( ** ص& lt0.01 *** ص& lt0.001). تمثل أشرطة الخطأ أخطاء معيارية متكاملة للمتوسط.

من أجل الحصول على عرض أكثر شمولية للخلايا التي تعبر عن THBS4 ، تم فحص لوحة من خطوط الخلايا البشرية من كيانات مختلفة من أجل THBS4 تعبير مرنا. أكد هذا التحليل أن الخلايا السرطانية ، بغض النظر عن الاشتقاق ، لا تعبر بشكل عام THBS4. تم العثور على نمط تعبير مقيد للغاية في خطوط الخلايا من الأورام الخبيثة الأخرى. فقط SH-SY5Y و Daudi و HL-60 أظهروا مستويات تعبير قابلة للقياس. تم اكتشاف أعلى تعبير حتى الآن في HEK-293 ، وهو خط خلوي مشتق من كلية جنينية طبيعية. لم يتم العثور على تعبير ذي صلة في خط الخلايا الليفية الوحيد في هذه الدراسة ، المشتق من جلد الجبين الطبيعي والمخصص 142BR (الشكل التكميلي S2).

يتم تحفيز الإفراط في التعبير عن Thrombospondin 4 في الخلايا الليفية المعدية بواسطة خلايا الورم

لتقييم ما إذا كان تعبير THBS4 في الخلايا الليفية يتم تشغيله بواسطة الخلايا السرطانية ، يتم إجراء في المختبر تم إنشاء نموذج الزراعة غير المباشرة. تم تحليل زوجين من الخلايا الليفية المتطابقة الطبيعية والمرتبطة بالسرطان من أجل التغييرات في THBS4 تعبير mRNA عند الطعن بوسائط مختلفة مكيفة للخلايا السرطانية. أدى العلاج بالوسط المكيف من OCUM-2M و OCUM-8 ، وهما خطان خلويان مشتقان من سرطانات معدية معوية (مجموعة سكانية فرعية من الأورام الغدية المعدية المنتشرة التي تتميز بالتليف المفرط) ، مما أدى إلى مستويات تعبير مرتفعة بشكل ملحوظ في كل من خطوط الخلايا الليفية الطبيعية (ص& lt0.05 ، ر-اختبار). في الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان ، أنتج متوسط ​​OCUM-8 فقط زيادات كبيرة (ص& lt0.05 ، ر-اختبار). أظهر الوسط المكيف OCUM-2M ميولًا للأهمية ، على الرغم من (ص& lt0.1 ، ر-اختبار). لم يكن الوسيط المكيف من خط الخلايا المعدية المشتقة من سرطان المعدة المنتشر من نوع MKN-45 غير قادر على التغيير بشكل كبير THBS4 التعبير في جميع الخلايا الليفية (الشكل 6).

تغييرات في THBS4 تعبير الرنا المرسال في الخلايا الليفية المنتشرة من نوع السرطان المعدي المشتق من السرطان والمشتق من الخلايا الليفية السليمة المشتقة من النظير عند التحفيز باستخدام الوسائط المكيفة للخلايا السرطانية. تم تحليل سطرين من الخلايا الليفية المتطابقة من النوع المنتشر والمشتق من سرطان المعدة المرتبط بالسرطان (CAF-32 ، CAF-33) والخلايا الليفية الطبيعية المشتقة من النظير (NF-32 ، NF-33). تم تحضين الأرومات الليفية لمدة 48 ساعة مع وسط مكيف مشتق من خط خلايا سرطان المعدة المنتشر للإنسان OCUM-2M أو OCUM-8 أو MKN-45. تم استخدام وسط خاص بخلايا الورم الطازجة كوسيط تحكم ، على التوالي. تم إجراء جميع التجارب في ثلاث نسخ مع إجراء تجارب تحكم على نفس اللوحة. THBS4 تم فحص وفرة mRNA عن طريق PCR الكمي في الوقت الحقيقي. تم إجراء الكميات بالنسبة لنسخة جابده تم ضبط مستويات التعبير في الخلايا الليفية المعالجة بالسيطرة على 100 ٪ ، على التوالي. تم تقييم أهمية في التعبير التفاضلي باستخدام ر-اختبار (°ص& lt0.1 * ص& lt0.05 ** ص& lt0.01). تمثل أشرطة الخطأ أخطاء معيارية متكاملة للمتوسط. يتم عرض نتائج التجارب التمثيلية.


مناقشة

التطورات الحديثة في التقنيات أحادية الخلية ، مثل الأساليب القائمة على القطيرات 2 ، تجعل من السهل وغير المكلف جمع مئات الآلاف من ملفات تعريف scRNA-seq ، مما يسمح للباحثين بدراسة أنظمة بيولوجية معقدة للغاية بدقة عالية. غالبًا ما يتم تسلسل المكتبات الناتجة على عمق منخفض للغاية (عشرات الآلاف من القراءات لكل خلية ، فقط) ، مما يجعل بيانات عدد القراءة المقابلة متناثرة حقًا. وبالتالي ، هناك حاجة متزايدة لتطوير طرق إحصائية موثوقة قابلة للتطوير ويمكن أن تمثل معدل تضخم صفري.

ZINB-WaVE هو نهج عام ومرن لاستخراج إشارة منخفضة الأبعاد من البيانات الصاخبة غير المضخمة ، مثل تلك من تجارب scRNA-seq. لقد أظهرنا من خلال تحليلات البيانات المحاكاة والحقيقية أن ZINB-WaVE يؤدي إلى تقديرات قوية وغير متحيزة للإشارات البيولوجية الأساسية. يأتي الأداء الأفضل لـ ZINB-WaVE فيما يتعلق بـ PCA بتكلفة حسابية ، حيث نحتاج إلى تحسين وظيفة الاحتمالية غير المحدبة عدديًا. ومع ذلك ، وجدنا بشكل تجريبي أن وقت الحوسبة كان خطيًا تقريبًا في كل من عدد الخلايا وعدد الجينات ، وتقريبًا تربيعيًا في عدد العوامل الكامنة (الشكل التكميلي 30). تستفيد الخوارزمية من الموازاة على أجهزة متعددة النواة وتستغرق بضع دقائق على كمبيوتر محمول حديث لتتقارب مع آلاف الخلايا.

يتمثل أحد الاختلافات الرئيسية بين ZINB-WaVE ونماذج تحليل العوامل المقترحة سابقًا (مثل PCA و ZIFA) في القدرة على تضمين المتغيرات المشتركة على مستوى العينة والمستوى الجيني. على وجه الخصوص ، من خلال تضمين عمود من الأعمدة في مصفوفة المتغير المشترك على مستوى الجين ، يعمل التقاطع المقابل على مستوى الخلية كعامل تطبيع واسع النطاق ، مما يسمح بنمذجة بيانات العد الخام ، دون الحاجة إلى التطبيع المسبق.

ومع ذلك ، ليس هناك ما يضمن أن الإشارة منخفضة الأبعاد المستخرجة بواسطة ZINB-WaVE ذات صلة بيولوجيًا: إذا كان الاختلاف الفني غير المرغوب فيه يؤثر على البيانات ولم يتم حسابه في النموذج (أو في التطبيع المسبق) ، فإن المصفوفة منخفضة الرتبة دبليو المستنتج من قبل ZINB-WaVE سوف يلتقط مثل هذه التأثيرات المربكة. لذلك من المهم استكشاف العلاقة بين العوامل الكامنة المقدرة من خلال إجراءاتنا والمقاييس المعروفة لمراقبة الجودة التي يمكن حسابها للمكتبات scRNA-seq ، باستخدام ، على سبيل المثال ، مبعثر حزمة Bioconductor R 43 (انظر الشكل 2f). إذا لاحظ المرء ارتباطًا كبيرًا بين واحد أو أكثر من العوامل الكامنة وبعض مقاييس مراقبة الجودة ، فقد يكون من المفيد تضمين مقاييس مراقبة الجودة هذه كمتغيرات مشتركة في النموذج.

لقد أدرك العديد من المؤلفين أن البيانات الجينومية عالية الأبعاد تتأثر بمجموعة متنوعة من التأثيرات التقنية غير المرغوب فيها (على سبيل المثال ، تأثيرات الدُفعات) التي يمكن الخلط بينها وبين الإشارة البيولوجية ذات الأهمية ، واقترحوا طرقًا لمراعاة هذه التأثيرات في أيٍّ من 38 خاضع للإشراف. أو بطريقة غير خاضعة للرقابة 27،44. في الآونة الأخيرة ، Lin et al. اقترح 45 نموذجًا يمكنه تمديد PCA للتكيف مع العوامل المربكة. ومع ذلك ، لا يبدو أن هذا النموذج مثاليًا لبيانات التعداد الصفري المتضخم. في الأدبيات scRNA-seq ، يستخدم MAST 23 معدل الكشف الخلوي المستنتج لضبط المصدر الرئيسي للارتباك ، في إعداد تعبير تفاضلي ، ولكنه غير مصمم لاستنتاج إشارة منخفضة الأبعاد.

تعد إزالة تأثيرات الدُفعات مثالًا مهمًا على كيفية تضمين المتغيرات المشتركة الإضافية في نموذج ZINB-WaVE الذي قد يؤدي إلى تمثيل أفضل للبيانات منخفضة الأبعاد. ومع ذلك ، لا يقتصر ZINB-WaVE على تضمين تأثيرات الدُفعات ، حيث قد يتم تضمين متغيرات مشتركة أخرى على مستوى العينة (على سبيل المثال ، مقاييس مراقبة الجودة) و / أو مستوى الجين (على سبيل المثال ، محتوى GC) في النموذج. على الرغم من أننا لم نجد أي أمثلة مقنعة تؤدي فيها إضافة متغير مشترك على مستوى الجين إلى تحسين استخراج الإشارة ، فمن المثير للاهتمام ملاحظة العلاقة بين محتوى GC وتأثيرات الدُفعات 46. من خلال الجهود التعاونية الكبيرة ، مثل Human Cell Atlas 47 ، في الأفق ، نتوقع أن تكون قدرة نموذجنا على تضمين المتغيرات المشتركة على مستوى الجينات التي يمكن أن تساعد في حساب الاختلافات في البروتوكولات مهمة.

على الرغم من أنه يمكن استخدام الإشارة منخفضة الأبعاد التي يستنتجها ZINB-WaVE لفحص البنية المخفية في البيانات بصريًا ، فإن التصور ليس هو النقطة الرئيسية في طريقتنا المقترحة. يُقصد من العوامل ذات الأبعاد المنخفضة أن تكون أقرب تقريب ممكن للإشارة الحقيقية ، والتي يُفترض أنها ذات بُعد منخفض جوهريًا. يمكن استخدام مثل هذا التمثيل المنخفض الأبعاد في تحليلات المصب ، مثل التجميع أو ترتيب الوقت الكاذب للخلايا 15.

يعد تصور مجموعات البيانات عالية الأبعاد مجالًا مهمًا بنفس القدر من البحث وتتوفر العديد من الخوارزميات ، من بينها أصبح t-SNE 25 الأكثر شيوعًا لبيانات scRNA-seq. في الآونة الأخيرة ، وانغ وآخرون. اقترح 48 خوارزمية تصور جديدة يمكن أن تمثل معدل تضخم صفري وأظهرت تحسنًا على t-SNE. نظرًا لأن t-SNE يأخذ كمدخل مصفوفة لمسافات أزواج الخلايا ، والتي قد تكون صاخبة في الأبعاد العالية ، فإن خط الأنابيب النموذجي يتضمن حساب مثل هذه المسافات في مساحة PCA ، واختيار ، على سبيل المثال ، أول 50 جهاز كمبيوتر. نهج بديل هو اشتقاق مثل هذه المسافات من الفضاء منخفض الأبعاد المحدد بواسطة العوامل التي استنتجتها ZINB-WaVE. تم استخدام هذه الاستراتيجية بشكل فعال في الشكل 3 ج لتصور مجموعة بيانات PBMC.

في هذه المقالة ، ركزنا على إعداد غير خاضع للإشراف ، حيث يكون الهدف هو استخراج إشارة منخفضة الأبعاد من البيانات الصاخبة ذات التضخيم الصفري. ومع ذلك ، فإن نموذج ZINB المقترح الخاص بنا أكثر عمومية ويمكن استخدامه ، من حيث المبدأ ، لتحليل التعبير التفاضلي الخاضع للإشراف ، حيث تكون معلمات الاهتمام هي معاملات الانحدار β المقابلة للمتغيرات المشتركة على مستوى العينة في المصفوفة X (على سبيل المثال ، نوع الخلية ، وحالة العلاج / التحكم). يمكن تحديد الجينات المعبر عنها تفاضليًا من خلال اختبارات نسبة الاحتمالية أو اختبارات والد ، مع وجود أخطاء معيارية لمقدري β تم الحصول عليها من مصفوفة هسه لوظيفة الاحتمال. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن اشتقاق احتمالات التسرب اللاحق بسهولة من النموذج واستخدامها كأوزان لإلغاء تأمين طرق RNA-seq القياسية 49 ، مثل edgeR 41. نتصور إصدارًا مستقبليًا من حزمة zinbwave بهذه الإمكانية الإضافية.


لماذا نستخدم الحمض النووي الريبي (cRNA) بدلاً من الحمض النووي الريبي (RNA) المستخرج الأولي في تقنية ميكروأري؟ - مادة الاحياء

نظرة عامة على استخدام Xenopus laevis كنظام نموذجي.

يعد استخدام الكائنات الحية التي يمكن تتبعها (أنظمة نموذجية) للإجابة على الأسئلة الأساسية في الطب والبيولوجيا ممارسة شائعة منذ العصور القديمة. أحد الأنظمة النموذجية ذات المساهمات المهمة هو Xenopus laevis ، وهو الضفدع الأفريقي المخالب ، وهو حيوان فقاري شبه متماثل يعيش في المياه العذبة. تكمن أسباب استخدامه في جميع أنحاء العالم في البحث في الدرجة العالية من الحفاظ على الآليات الخلوية والجزيئية الأساسية ، فهي غير مكلفة وسهلة التلاعب ويمكن الحصول على كميات كبيرة من المواد بسهولة لمجموعة متنوعة من الإجراءات التجريبية. في هذه المراجعة ، ستتم مناقشة المواد التي يتم الحصول عليها بشكل روتيني من Xenopus laevis ، وأهم الإجراءات التجريبية ، وكيفية استخدام نظام Xenopus في البحث بالإضافة إلى أنواع الأسئلة التي لا يمكن الإجابة عليها إلا باستخدام Xenopus.

يمكن التلاعب بالتكاثر بحيث يمكن لكل ضفدع أن يعطي بيضًا يصل إلى 3-4 مرات في السنة ، ويمكن أن تختلف المواد المستخدمة في الدراسات البحثية من البويضات إلى المستخلصات الخالية من الخلايا. يتم التحكم في إنتاج البيض عن طريق الحقن تحت الجلد من 50-100 وحدة من مصل الفرس الحامل (PMS) في أكياسها الليمفاوية الظهرية قبل عدة أيام من الحقن الثاني باستخدام 600-800 وحدة من موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية (hCG) قبل 12-16 ساعة من الجرعة المرغوبة. وضع البيض. مباشرة بعد الحقنة الثانية ، يتم وضعها في خزانات فردية وفي اليوم التالي يتم جمع البيض.

البويضات عبارة عن خلايا كبيرة قطرها> 1 مم. تحتوي على نواة ضخمة (أو حويصلة جرثومية) ، أكبر 100000 مرة من نواة الخلية الجسدية ، والتي تحتل ثلث حجم البويضة تقريبًا وتتطور بسرعة. الحويصلة محاطة بغلاف نووي ذو مسام كبيرة تسهل النقل من وإلى السيتوبلازم. بشكل مثير للإعجاب ، تحتوي البويضات على دورة خلية متزامنة وتعتقل في الطور الأول للانقسام الاختزالي حتى يتم تنشيطها بواسطة البروجسترون. يؤدي تنشيط البروجسترون إلى النضج الانتصافي للبويضات. يتم التحكم في مرحلة النضج من خلال نشاط عامل تعزيز النضج (MPF) [2] ، والذي يُعرف أيضًا باسم p34cdc2 كيناز وهستون كيناز H1 المرتبط بالنمو. عند تنشيط هرمون البروجسترون وزيادة نشاط MPF ، ينهار الهيكل النووي ، ويتكون المغزل ويتم الانتهاء من أول تقسيم انتصافي. ولكن يتم إيقاف الدورة مرة أخرى في المرحلة الطورية للدورة الانتصافية الثانية بفعل عامل تثبيط الخلايا (CSF) وهذا يشير إلى البويضة الناضجة التي تنتظر الإخصاب [3 ، 4]. بعد الإخصاب ، أي دمج الحيوانات المنوية مع البويضة ، يزداد تجمع الكالسيوم السيتوبلازمي وهذا يؤدي إلى تعطيل كل من MPF و CSF ، وإطلاق دورة الخلية (الشكل 1) (انظر مقاطع الفيديو التي تظهر تطور Xenopus على البويضة التخصيب)

المواد التي يمكن أن يقدمها Xenopus في علم الأحياء رائعة من حيث الجودة والكمية. على سبيل المثال ، يتوافق مبيض ضفدع واحد مع 1000 مبيض فأر [5] ويمكن إجراء بقع غربية مع عينات بروتينية من بويضة واحدة فقط (أو 1 ميكروليتر من المستخلص - انظر أدناه). البويضات غنية جدًا بجميع البروتينات والبروتينات اللازمة للمراحل الأولى من التطور حتى التطور الجنيني المبكر ، أي مرحلة الشرغوف. يمكن أن تحتوي على ما يصل إلى 4 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي ، وبالتالي فإن كل بويضة قادرة على تصنيع ما يصل إلى 400 نانوغرام من البروتينات يوميًا. يُعد إجراء التجارب على خلية واحدة في بويضات Xenopus laevis أمرًا روتينيًا لعلماء الأحياء التجريبيين. بالإضافة إلى ذلك ، فإنها تفتقر إلى نشاط النسخ حتى منتصف مرحلة الأريمة. يقدر محتوى البروتين بحوالي 500 ميكروغرام في كل بويضة وحوالي 10-50 مجم / مل في المستخلص.

مبيض Xenopus laevis كبير وشفاف وقد يحتوي على عدة مئات من البويضات الكبيرة أيضًا والتي يمكن الحصول عليها بسهولة. على الرغم من الاختلاف في الحجم ، يتم حفظ عمليات تكوين البويضات والنضج في الثدييات. لذلك ، يتم استخدامها على نطاق واسع من قبل الباحثين الذين يدرسون دورة الخلية.

يمكن تشريح البويضات يدويًا باستخدام ملقط من المبايض أو يمكن استخلاصها عن طريق الهضم باستخدام الكولاجيناز (نزع التثبيط الإنزيمي) لطبقات النسيج الضام خارج الخلية الأربعة التي تحيط بها. تمت مناقشة مزايا وعيوب أي من الطريقتين بالتفصيل في [6]. بعد ذلك ، من البويضات ، يمكن إزالة النواة يدويًا. يتم استخدام زوج من الملقط ذي الرؤوس الحادة لاختراق فتحة صغيرة في الخلية ومن خلال قوة الضغط المطبقة بواسطة زوج آخر من الملقط ذي الأطراف غير الحادة ، يتم استخراج النواة [6 ، 7]. ينتج عن هذا البويضات بدون أي نواة (البويضة المستأصلة) ونواة معزولة.يتم اختيار البروتوكول التجريبي الذي يتم من خلاله إجراء الاستئصال وفقًا للتطبيق النهائي ، والذي يمكن أن يكون تخريبًا مناعيًا [8] ، وحقن نوى جسدية وتوليف الحمض النووي الريبي لتحليل النسخ [9] ، وتعبير البروتين الخارجي عن طريق حقن الحمض النووي الريبي التكميلي ( cRNA) في السيتوبلازم أو الحمض النووي التكميلي (cDNA) في النواة [10] ، وحقن الببتيدات أو البروتينات المؤتلفة [11] وغيرها. يمكن عزل النوى التي تعمل بكامل طاقتها واستخدامها لدراسة جميع العمليات النووية بما في ذلك التعبير الجيني وديناميكيات الكروماتين والاستيراد والتصدير النووي للبروتينات ذات العلامات الفلورية أو وظيفة مجمعات المسام النووية [12 ، 13].

يبلغ حجم بويضة Xenopus laevis ما يقرب من 1 ميكروليتر. يمكنهم تحمل حقنة تصل إلى 50 nL باستخدام محاقن نانوية تلقائية ، دون أي تأثير ضار في الوظيفة. يتم ترتيب العديد من البويضات على شرائح خاصة ويتم حقنها بالتتابع باستخدام حاقن نانوي ، كما هو موضح في هذا الفيديو.

يمكن استخدام الحقن لتجارب اكتساب الوظيفة (GOF) أو فقدان الوظيفة (LOF) أو التجارب التي تتضمن كليهما. عن طريق الحقن التي تحتوي على أي نوع من DNA ، RNA ، DNA البلازميد [14] ، morpholino oligonucleotides [15] أو جزيئات البروتين ، يمكن التلاعب بوظيفة الجينات بسهولة. يمكن العثور على العديد من الأمثلة في الأدبيات على سبيل المثال ، التجارب الأولى التي أدت إلى استنساخ مضاد للفيروسات [16] ، أو تطوير تقنية مورفولينو [17] أجريت في بويضات Xenopus. وقد لوحظ أن Morpholino يولد نتائج إيجابية زائفة عالية [18]. تم أيضًا وصف توليد أجنة Xenopus laevis المعدلة وراثيًا واستخدمت لتقييم التعبير الجيني المتضمن في الأمراض المرضية [19 ، 20]. يمكن دراسة تجميع الكروماتين في الجسم الحي في البويضات بعد حقن الحمض النووي في الحويصلة الجرثومية. يمكن مراقبة تخليق الخيط التكميلي أو النسخ المتماثل عن طريق الحقن المشترك لـ dNTPs المشعة بينما يمكن تقييم تجميع النيوكليوزوم بمقايسة الالتفاف الفائق ومقايسة نوكلياز المكورات الدقيقة (MNase). يمكن أيضًا تكاثر الفيروس بعد الحقن المجهري للحمض النووي الريبي الفيروسي ، الذي ينتج فيروسات معدية [21]. تم تحديد موجات الزناد الأبوطوزية أيضًا من خلال الحقن [22]. قام Li L et al بحقن morpholino oligos و TALEN mRNA و mRNAs كاملة الطول لدراسة وظيفة Etv6 [23]. قام Clairfeuille T et al بحقن cRNA للإنسان و Blattella germanica Naالخامس (تم توليفها من خلال مجموعة mMessage mMachine من Thermo Fisher) إلى بويضات Xenopus laevis ، التي يتم الحصول عليها من Xenopus one أو Ecocyte ، لدراسة تعطيل قنوات الصوديوم ذات الجهد الكهربي [24].

كما هو الحال في الأنظمة النموذجية الأخرى المستخدمة في علم الأحياء التطوري ، يمكن إجراء عمليات الزرع بسهولة في بويضات Xenopus. كما هو موضح أعلاه ، نظرًا لحجم البويضات الكبيرة ، فإن الاستئصال هو إجراء روتيني مع Xenopus. يمكن حقن البويضة بالنيوكليوتيدات ، مثل morpholino أو siRNA ، مما يؤدي إلى فقدان وظيفة الهدف محل الاهتمام. بعد ذلك ، يمكن نقل النواة من هذه البويضة الطافرة أو الشرغوف إلى بويضة "من النوع البري" ، تمت إزالة نواتها أو تدميرها ، ويمكن زرع النواة السليمة في بويضة متحولة ومقارنتها (الشكل 2). يمكن أن تحل هذه الإجراءات التجريبية محل الاستراتيجيات ، مثل توليد الحيوانات المستنسخة المعدلة وراثيًا ، والتي ليست مجدية جدًا في الضفادع حتى الآن. لمزيد من المعلومات اقرأ أدناه تجربة جوردون.

علاوة على ذلك ، تم زرع القنوات الأيونية والمستقبلات الغشائية لأدمغة البشر المصابين بمرض الزهايمر بعد الوفاة وكانت وظيفية في بويضات Xenopus ولها تطبيقات في دراسة نشاط القناة المتعلق بالأمراض البشرية [25-27]. وبالمثل ، تعد بويضات Xenopus نظامًا رائعًا للتعبير عن النواقل العصبية من الدماغ البشري أو الخلايا المستزرعة ودراستها وروابطها (العقاقير والمبيدات الحشرية وما إلى ذلك) بعد حقن mRNA أو cDNAs أو حويصلات الغشاء من الأنسجة الأصلية. يمكن قياس التيارات المتولدة في مثل هذه التجارب في البويضات بسهولة نظرًا لحجم البويضة الكبيرة ، وبالتالي فإن نظام Xenopus له مساهمات كبيرة في دراسة الاضطرابات العصبية ، مثل الصرع [28].

يمكن ببساطة مراقبة تجميع الكروماتين بعد حقن البروتينات الخارجية أو بعد تجارب GOF أو LOF [29]. وبالمثل ، يمكن استخلاص البروتينات لتحليل اللطخة الغربية. ومن المثير للاهتمام ، أن الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) هو تقنية تستخدم على نطاق واسع مع خطوط الخلايا لتحديد التفاعل بين عوامل النسخ أو الواسمات اللاجينية مع عناصر DNA معينة ، مثل المروجين. يمكن أيضًا تطبيق شرائح ChIPs في بويضات Xenopus باستخدام نفس المبادئ ولكن مع مواد أولية أقل بكثير (10-15 بويضة) [30 ، 31]. هناك حالات حيث لا يتم استخدام Xenopus ، ومع ذلك ، يتم فحص مكونات الكروماتين ، مثل الهستونات ، [32].

بسبب المواد الكبيرة التي توفرها بويضات Xenopus ومستخلصاتها ، فقد تم استخدامها لعمل شاشات أولية للجزيئات الصغيرة التي يمكن استخدامها في علاج الأمراض البشرية ، مثل ورم خبيث للسرطان وتوليد أوعية دموية جديدة [33] ، وتدهور البروتين و تلف وإصلاح الحمض النووي [34 ، 35].

يعارض الحجم الكبير للبويضة بعض المشكلات في تجارب الفحص المجهري (صعوبة اختراق الأجسام المضادة وإشارة الخلفية من الصبغة القشرية وصفائح الدم) مما يجعلها أقل وضوحًا وتتطلب التحسين. على الرغم من الصعوبات ، فقد تم تطوير العديد من البروتوكولات لدراسة توطين وتنظيم الهيكل الخلوي وبروتينات الهيكل الخلوي (مثل الأكتين والتوبيولين والكيراتين) عن طريق التألق المناعي والفحص المجهري متحد البؤر (لمناقشة كاملة ، انظر بيكر وجارد ، 2006 [36]) ). البويضات Xenopus هي أيضًا الخلايا المفضلة لدراسة إشارات Ca 2+.

المستخلص الذي تم الحصول عليه من بيض Xenopus غير المخصب هو نظام خالٍ من الخلايا يكمل ويتغلب أحيانًا على استخدام الأنظمة النموذجية الأخرى. إنه يلخص جميع الوظائف البيولوجية للبويضة ، وقد ثبت أنه ينتظم ذاتيًا في هياكل شبيهة بالخلية ويخضع لجولات متعددة من الانقسام في ظل الظروف المناسبة [37]. المستخلص هو نظام مستخدم على نطاق واسع لدراسة دورة الخلية في المختبر ، وخاصة عمليات تكرار الحمض النووي وتكوين النواة. هذه عمليات مهمة للغاية لاستقرار الجينوم وأي خلل يمكن أن يساهم في العديد من الحالات المرضية ، مثل السرطان. يتم حفظ معظم الخصائص ، إن لم يكن كلها ، من الفقاريات إلى البشر. لذلك ، توفر مستخلصات بيض Xenopus البساطة لدراسة العمليات الخلوية الحيوية دون الحاجة إلى تعويض أي شيء.

تم تحضير المستخلصات الأولى بواسطة Lohka و Masui [38] واستخدمت على نطاق واسع بعد Blow and Laskey و Hutchison et al في منتصف الثمانينيات. يمكن أن تكمل هذه المقتطفات دورة خلية واحدة في المختبر ويمكن تخزينها مجمدة في نيتروجين سائل وعندما يمكن أن تظهر طازجة عدة دورات خلوية [39 ، 40]. تضمنت هذه الدورة تفكيك الكروموسومات ، وتشكيل الغلاف النووي ، والتكرار الكامل للحمض النووي بطريقة شبه محافظة كما هو الحال في البشر ، وإعادة تكثيف الكروموسومات ، وتفكك الغلاف النووي ، وتشكيل المغزل الانقسامي وفصل الكروماتيدات الشقيقة.

منذ ذلك الحين ، توجد العديد من الاختلافات في البروتوكولات الأصلية لإعداد المستخلص من مختبر إلى آخر وفقًا للمعدات المتاحة والخبرة الشخصية [1 ، 3 ، 41]. ومع ذلك ، فإن الاختلافات صغيرة وكلها توفر مستخلصات بيض عالية الجودة يمكن تخزينها في النيتروجين السائل لسنوات.

بشكل عام ، تتم إزالة طلاء الهلام من البيض (dejellying) ويتم سحق البيض بواسطة أجهزة الطرد المركزي المتسلسلة (الشكل 3). عند التفضيل ، تتم معالجة البويضات غير المخصبة بحامل أيون الكالسيوم قبل التكسير ، مما يعطل عامل تثبيط الخلايا (CSF) ويطلق دورة الخلية من الطور الأولي إلى الطور البيني التالي في غضون دقائق قليلة. المقتطفات التي تم الحصول عليها من هذه البيض المستحثة من الكالسيوم 2+ هي أطوار بينية. بدلاً من ذلك ، فإن الإضافة المباشرة للكالسيوم في مستخلص البويضات غير المستحثة (المستخلص الانقسامي المحبوس CSF) لها نفس التأثير وتؤدي إلى تكرار الحمض النووي للحيوانات المنوية. بعد إزالة الحطام وحبيبات الصباغ والدهون وبروتينات الصفار يمكن الحصول على عدة أنواع من المستخلصات اعتمادًا على السؤال العلمي المراد دراسته (الشكل 3).

تحتوي المستخلصات الأكثر تفصيلاً منخفضة السرعة (LSE) على السيتوبلازم بما في ذلك الأغشية الخفيفة والريبوزومات والمغلف النووي ويتم تحضيرها بواسطة الطرد المركزي متوسط ​​السرعة (2+ بيض ناتج كما هو موضح أعلاه) أو الانقسام (من البيض غير المستحث). تُظهر مقتطفات LSE بين الأطوار تجميع الكروماتين ، وتشكيل مركب ما قبل النسخ المتماثل (قبل RC) وتحميله على الكروماتين ، وإطلاق النار الأصلي وتكرار الحمض النووي ، والتجميع النووي بينما تُظهر المستخلصات الانقسامية LSE تكاثف الكروموسوم ، وتشكيل المغزل الانقسامي ، ولا يكرر الحمض النووي ما لم يتم تنشيطه بواسطة كاليفورنيا 2+.

يتم تحضير المستخلصات عالية السرعة (HSE) من LSE بعد طرد مركزي إضافي عالي السرعة (100،000 جم) والذي يفصل السيتوبلازم عن الأغشية والريبوسومات. وبالتالي ، لا يمكن لـ HSE تكوين نوى ، ويتم تجميع الحمض النووي في كروماتين ويتم تحميل ما قبل RC ، ولكن لا يمكن نسخ الحمض النووي المزدوج الشريطة. ومع ذلك ، فإنه يقوم بتوليف الخيط التكميلي عند إضافة جزيء DNA أحادي السلسلة.

لا ينتج عن تعداء جزيئات الحمض النووي في الخلايا حقيقية النواة تكاثر كافٍ. من ناحية أخرى ، تعد مستخلصات بيض Xenopus نظامًا قويًا ، جنبًا إلى جنب مع الخميرة ، لدراسة جميع مراحل تكرار الحمض النووي ، وخاصة ترخيص أصول التكاثر والبدء ، حيث تقوم بإعادة إنتاج الأحداث في آلية شبه تحفظية ، مثل الخلايا في الجسم الحي [42 ، 43]. من حيث المبدأ ، سيبدأ المستخلص بين الأطوار بجودة جيدة في ترخيص أصول تكرار الحمض النووي خلال الدقائق الأولى بعد إضافة مزيج تجديد ATP والقالب DNA (الحيوانات المنوية منزوعة الغشاء أو DNA البلازميد). سيبدأ تخليق الحمض النووي بعد 20-30 دقيقة وسيكمل جولة واحدة من تكرار الحمض النووي ، وسوف يقوم بتفكيك الكروماتين بالكامل وسيشكل نوى تعمل بكامل طاقتها في 60-80 دقيقة عند 23 درجة مئوية (الشكل 4 ج). بعد ذلك ، يدخلون الانقسام الخيطي ، ما لم تتم إضافة الهيكسيميد الحلقي لمنع تخليق البروتين وبالتالي ، لا يتم تصنيع cyclin B لدفع الانقسام ويتم إيقاف المستخلص في حالة شبيهة بـ G2.

بشكل عام ، يمكن مراقبة التقدم خلال دورة الخلية عن طريق: التألق المناعي بعد إضافة dUTPs المسمى بالبيوتين (الشكل 4E-F) أو مقايسة تكرار الحمض النووي بعد إضافة dNTPs التي تحمل علامات إشعاعية وترسيب TCA (الشكل 4 د) [1].

نظرًا لأن مستخلصات البيض متعددة الأطوار لا تحتوي على نواة مجمعة ولكنها تحتوي على جميع المكونات الضرورية لبناء نواة واحدة من نقطة الصفر ، فهي نظام مفيد لدراسة التجميع النووي والمسام النووية وتشكيل الغلاف النووي. باستخدام هذا لمصلحتنا ، إضافة جزيء ذي علامة الفلورسنت في المستخلص ، يمكن دراسة نقله من وإلى النواة بسهولة. وبالمثل ، يمكن استخدام إزالة المكون الهيكلي للغلاف النووي أو المسام النووية في مثل هذه الدراسات.

الميزة العظيمة لمستخلصات Xenopus هي السهولة التي توفرها في الاستنفاد المناعي لمكونات معينة أو إضافة بروتينات أو مثبطات أو جزيئات أخرى. هذه إجراءات قياسية وليست هناك حاجة للترنسفكأيشن أو التلاعبات المماثلة المطلوبة ، على سبيل المثال ، مع سلالات الخلايا المستنبتة. إنها إضافة بسيطة في الأنبوب. إلى جانب ذلك ، لا يحتوي مستخلص العصارة الخلوية على أجزاء خلوية مميزة تتكون وتحتوي على جميع البروتينات (على سبيل المثال ، عصاري خلوي ، نيوكليوبلازم ، مرتبط بالكروماتين) في حوض واحد. وبالتالي ، فإن إضافة / استنفاد / تثبيط البروتينات فعالة بسهولة ويمكن قياس نتيجة هذا التلاعب بسهولة [44]. على سبيل المثال ، فإن إضافة تركيزات عالية من حمض أوكادايك ، وهو مثبط لفوسفاتازات البروتين وخاصة بروتين فوسفاتيز 2 أ (PP2A) ، يوجه المستخلص لتجاوز التكرار والانتقال مباشرة إلى الانقسام (الشكل 5 اللوحة السفلية). أو يؤدي الاستنفاد المناعي للكيناز 2 المعتمد على السيكلين ، وهو الكيناز الرئيسي في جميع مراحل تكرار الحمض النووي ، إلى ضعف النسخ المتماثل كما يتضح من انخفاض كبير في عدد بؤر النسخ المتماثل (الشكل 5 اللوحة الوسطى).

توفر مستخلصات بيض Xenopus (وكذلك البويضات) بيئة ممتازة لدراسة التعديلات اللاحقة للترجمة (PTMs) للبروتينات المؤتلفة. تظهر البروتينات ومسارات الإشارات في Xenopus درجة عالية من الحفظ مع البشر [45]. لذلك ، يمكن للبروتين المؤتلف أن يجد شركائه الطبيعيين في مستخلص البيض وبالتالي يحتفظ بوظائفه الكاملة. هذا ليس هو الحال دائمًا في البكتيريا أو الخميرة ، التي لا تحتوي على جميع التعديلات اللاحقة للترجمة الموجودة في الثدييات الأعلى. تعتبر مستخلصات البيض عالية التركيز مقارنة بالمستخلصات من سلالات الخلايا المستزرعة (أي مطلوب القليل من المواد). أكبر ميزة هي أنها تقدم سياق فسيولوجي إلى حد ما في مستخلصات البيض بين الأطوار أو الانقسامية. ومن ثم ، عند إضافة شريك ملزم كـ "طعم" أو ركيزة من إنزيم في مستخلص Xenopus ، يكون احتمال العثور على المتفاعلات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية والمؤثرات الأولية أو النهائية في المرحلة المناسبة من دورة الخلية عالية جدًا.

تعتبر الوراثة اللاجينية وتعديلات الهيستون مهمة للتطور الجنيني ومسار العديد من الحالات المرضية ، بما في ذلك السرطان. يمكن تنقية كروماتين مستخلصات بيض Xenopus بين الأطوار أو الانقسامية بسهولة في مراحل مختلفة (على سبيل المثال ، الترخيص المسبق لأصول النسخ المتماثل ، إطلاق النسخ المتماثل للحمض النووي ، المرحلة S المتأخرة ، إلخ) من خلال تدرج السكروز ومقارنتها. يمكن تقييم الكروماتين المنقى عن طريق التخثر المناعي ، التألق المناعي ، إلخ. يوفر Xenopus القدرة على تحديد PTMs الجديدة التي يصعب العثور عليها في عينات أكثر تعقيدًا ، مثل خطوط الخلايا. يمكن العثور هنا على العديد من الموارد الأخرى للدراسات الجينية والجينومية والبروتينية [46].

يحتوي نظام نموذج Xenopus على العديد من التطبيقات الأخرى ، مثل فهم التجديد [47] ، نواة الأنابيب الدقيقة [48] ، فصل الطور [49] ، نمو الدماغ [15] والعديد من التطبيقات الأخرى. مجالات البحث الأخرى التي تساهم فيها أجنة Xenopus بشكل كبير هي أبحاث العين والرؤية ، وتطور القلب ، وعلم المناعة. استنادًا إلى التحليل الجنيني لعين Xenopus بعد التلاعب بالتعبير الجيني تحديدًا في العين عن طريق الحقن المجهرية للـ blastomeres ، تم الكشف عن العديد من الجينات ومسارات الإشارات الحاسمة لنمو العين ومصير شبكية العين (Xenopus White Paper 2009). فيما يتعلق بالتعبير الجيني ، حدد موغال BB وآخرون جينات مرجعية مثل clta.L و sub1.L وما إلى ذلك لدراسات PCR الكمية في الوقت الحقيقي في تطوير Xenopus laevis [50]. أنشأ DeLay BD وآخرون إجراء الضربة القاضية الخاصة بالكلى لجين lhx1 باستخدام CRISPR / Cas9 في الضفدع المتآصل [51].

في الختام ، تتمثل المزايا الرئيسية لنظام Xenopus في البويضات الكبيرة والمستخلصات الخالية من الخلايا ، والتي توفر الكثير من المواد (البروتين ، والحمض النووي ، والحمض النووي الريبي ، وما إلى ذلك) للدراسات الكيميائية الحيوية وسهولة في الحقن المجهري ، وتزامن دورة الخلية ، والآليات الجزيئية المحفوظة . بالنظر إلى أن التطور الجنيني يشترك في العديد من الخصائص مع السرطانات البشرية ، فإن Xenopus laevis و X. Tropicalis هما أدوات رائعة ليس فقط لدراسة تكوين الأورام ولكن أيضًا للإجابة على الأسئلة الأساسية العامة في علم الأحياء والطب [45 ، 52].

أصبح Xenopus laevis أحد أكثر النماذج الواعدة لدراسة آليات التجديد. لا تتمتع الأنسجة البشرية بالقدرة التجديدية لجلد البرمائيات ويصاب بالتليف بعد إصابة الجلد. لذلك ، فإن تحليل الخلايا المتفجرة المجددة لـ Xenopus والمقارنة مع التندب بوساطة الأرومة الليفية العضلية في البشر من شأنه أن يساعد على فهم العمليات التجديدية في البشر. حدد Aztekin C et al خلية منظمة للتجديد في ذيل Xenopus باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية [53]. على سبيل المثال ، استخدمت دراسة حديثة خلايا Xenopus الموصوفة بمشغل الجينات المستحث بالليزر بالأشعة تحت الحمراء (IR-LEGO) في دراسة تجديد الجلد [54 ، 55]. بالإضافة إلى ذلك ، تم الانتهاء بالفعل من تسلسل الجينوم في Xenopus laevis ويمكن تطبيقه على تنميط التعبير الجيني في الخلايا البرمائية المتجددة [56]. علاوة على ذلك ، قدم منشور حديث آخر عدة فحوصات لدراسة آليات التئام الجروح الخلوية والجزيئية في أجنة Xenopus [57]. تضمنت الطرق الموصوفة توليد بنيات الضربة القاضية والإفراط في التعبير وإدماج mRNAs الذي يشفر علامات الفلورسنت.

يعد تجديد الهياكل المركزية والمحيطية للجهاز العصبي مجالًا آخر للبحث ، حيث ثبت أن Xenopus laevis نموذج دراسة فعال. يتضمن استخدام Xenopus المعدّل وراثيًا لدراسات تجديد المحوار إدخال جزيء أو اثنين من جزيئات الوسم ، مثل أمينات ديكستران ، لمتابعة إعادة نمو المحاور التالفة تجريبيًا [58]. تم مؤخرًا نشر بروتوكول آخر يستخدم Xenopus للتحقيق في تجديد الحبل الشوكي [59]. تعتمد الدراسة على قدرة هذه الأنواع البرمائية على تجديد الحبل الشوكي في مرحلة تطور اليرقات. بالإضافة إلى ذلك ، طبقت دراسة حديثة البروتينات الكمية لتحليل مجموعة متنوعة من البروتينات المعبر عنها في الحبل الشوكي Xenopus في مراحل التجدد وغير التجديد [60]. فيما يتعلق بالجهاز الحسي البصري ، تم استخدام Xenopus لدراسة تجديد هياكل العين ، مثل العدسة وشبكية العين [61 ، 62].

Xenbase ، قاعدة بيانات كائن نموذج Xenopus ، هو مورد حيوي لجميع الباحثين [63-65]. يحتوي على تعليقات توضيحية جينومية و mRNA وبروتيومية ووظيفية ويرتبط ارتباطًا مباشرًا بالعديد من قواعد البيانات ، مثل NCBI أو Uniprot. تم تحديد تسلسل جينوم Xenopus laevis بشكل كامل مؤخرًا فقط. في البداية ، في بداية العقد الأول من القرن الحادي والعشرين ، كان يُعتقد أن جينوم رباعي الصبغيات يسبب مشاكل لن يتم ملاحظتها إذا تم اختيار ثنائي الصبغة Xenopus Tropis للتسلسل. في الواقع ، فإن المعرفة التي تم الحصول عليها من جينوم X. Tropical بالإضافة إلى التطورات الحديثة في تسلسل الحمض النووي ساعدت في تجميع جينوم Xenopus laevis وتسلسله بشكل كامل. لذلك ، يمكن إجراء دراسات البروتينات بشكل روتيني [66-70]. يمكن أيضًا الحصول على الجينات من Source Biosciences [49].

كان عالم الحيوان وعلم الأحياء البيئي توماس إتش مورجان (حصل على جائزة نوبل في علم وظائف الأعضاء أو الطب عام 1933) من أوائل الذين استخدموا Xenopus ، قبل أن ينتقل لدراسة ذبابة الفاكهة. لكن عمل عالم الغدد الصماء لانسلوت هوغبن هو الذي أسس Xenopus كنظام نموذجي. حتى ذلك الحين ، لا يمكن التلاعب بالتكاثر ، وبالتالي لا يمكن إجراء التجارب إلا في أواخر الشتاء حتى الربيع حيث يحدث التكاثر الطبيعي للضفادع. أدى عمله إلى تطوير اختبار الحمل الأكثر موثوقية وسرعة حتى الستينيات ، حيث اكتشف أنه عندما تم حقن بول من النساء الحوامل في أنثى Xenopus laevis ، وضع الضفدع البيض مما يشير إلى وجود موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية (hCG) في البول [5 ، 71] (انظر أيضًا http://www.columbia.edu/cu/biology/faculty/kelley/webessay/histories.html). لذلك ، بعد حقنة بسيطة من قوات حرس السواحل الهايتية ، يضع Xenopus laevis عددًا كبيرًا من البيض كل 3-4 أشهر في أي وقت في السنة ، والتي يمكن استغلالها من قبل علماء الكيمياء الحيوية أو علماء الأحياء الجزيئية أو التنموية. يمكن استخدام البيض مباشرة كبويضات أحادية الخلية أو بعد إجراء تجريبي بسيط ، يمكن تحضير مستخلصات البيض.

في وقت لاحق ، وجد مايكل فيشبيرج وزملاؤه ضفدعًا واحدًا في مستعمراتهم ينتج أجنة ثنائية الصبغة بنواة واحدة (بدلاً من اثنتين) ، وقاموا بتوليد الضفدع متماثل اللواقح الذي وضع الأساس للزرع النووي ، حيث يمكن استخدام طفرة O-nu هذه. العلامة الجينية للزرع النووي [72]. بعد بضع سنوات ، اكتشف عالم الأحياء التجريبي جون جوردون (طالب M. Fischberg) أن طفرة O-nu كانت نتيجة الحذف الكامل للعديد من جينات الريبوسوم [73]. على سبيل المثال ، تم تقديم مفهوم إعادة برمجة الخلايا المتمايزة لتصبح متعددة القدرات في البداية في عام 1962 من قبل جوردون ، الذي أخذ نواة خلية معوية ناضجة من الشرغوف ووضعها في خلية بويضة ، تمت إزالة نواتها. ثم رأى أن هذه البيضة تطورت لتصبح شرغوفًا صحيًا [74]. لعمله الرائد في إعادة برمجة الخلايا ، حصل جوردون على جائزة نوبل في علم وظائف الأعضاء أو الطب في عام 2012 ، بالاشتراك مع S. Yamanaka.

منذ ذلك الحين (الستينيات) ، على الرغم من أن البيئة الطبيعية لـ Xenopus مقتصرة على جنوب إفريقيا ، فقد أصبح نظامًا نموذجيًا شائعًا للغاية لمجموعة متنوعة من الدراسات وهو الآن ساكن مشترك لمختبرات الأبحاث في جميع أنحاء العالم. Xenopus هو نظام نموذجي رائع يستخدم على نطاق واسع في علم الأحياء والطب. في بيئة المختبر ، عادة ما يتم وضع الضفادع في خزانات بلاستيكية بها ماء من الصنبور في مجموعات من 6-15 مع أنبوب بلاستيكي داخل الخزان مما يوفر مكانًا للاختباء للضفادع. يجب أن تكون درجة الحرارة حوالي 16-20 درجة مئوية ، وعلى الرغم من أن الضفادع البرية تعيش في بيئات مظلمة نوعًا ما ، إلا أن دائرة من 12-14 ساعة من الضوء مع 10-12 ساعة من الظلام أمر حيوي لصحة جيدة (الشكل 6).


شاهد الفيديو: From DNA to protein - 3D (ديسمبر 2022).