معلومة

تحضير PCR Mastermix

تحضير PCR Mastermix


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أقوم حاليًا بإعداد Mastermix PCR لأول مرة ، ولدي بعض الأسئلة المتعلقة بالتوزيع. أحاول تضخيم مجموعة جينية معينة في عينة من الحمض النووي حتى أتمكن من استخدامها في ناقلات الاستنساخ ؛ ومع ذلك ، لست متأكدًا من عدد مخاليط تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) المنفصلة التي يجب أن أعدها في المزيج الرئيسي لهذا الغرض؟ أيضًا ، ما هو الغرض من خليط تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل السلبي (بدون الحمض النووي للقالب) ، كما رأيت إجراءً أوصي بصنع واحد. هل يجب أن أحضر نفس عدد ردود الفعل السلبية كإيجابية ، أم يجب أن أحضر 1 فقط؟


يعد PCR Master Mix مجرد وسيلة لتسريع عملية المص. بدلاً من تحضير 10 تفاعلات مختلفة لكل منها 20ul (على سبيل المثال) ، يمكنك تحضير تفاعل واحد من 200ul ثم تقسمه إلى 10 أنابيب. هذا يقلل أيضًا من أخطاء الإلهاء (من غير المرجح أن تنسى الماصة مرة واحدة 100ul من 20 مرة 5ul). أيضًا ، يتم استخدام كمية أقل من البلاستيك (أطراف الماصة).

بعض النصائح:

نظرًا لخطأ بعض الماصات ، فمن الجيد عمومًا احتساب تفاعل إضافي كل 10. على سبيل المثال ، إذا كنت بحاجة إلى تشغيل 10 PCR ، فقم بعمل Master Mix لـ 11.

إذا كنت تخطط لتشغيل نفس PCR على قوالب مختلفة (وهو ما يحدث غالبًا) فلن تحتاج إلى إضافة القالب في المزيج الخاص بك.

يجب دائمًا تضمين الضوابط السلبية والإيجابية.

غالبًا ما يتم التحكم السلبي في تفاعل PCR عن طريق استبدال قالب DNA بالماء. يجب ألا يُظهر التحكم السلبي أي نطاق تضخيم. هذا يضمن عدم وجود ملوثات الحمض النووي في المزيج الخاص بك وأن البرايمر لا تضخم بعضها البعض.

التحكم الإيجابي هو رد فعل من المتوقع أن ينجح. في هذه الحالة ، إذا أظهر التحكم الإيجابي تضخيمًا ولكن العينة الخاصة بك لا تظهر ، فأنت تعلم أن ذلك ليس بسبب أن بعض المكونات في التفاعل تتصرف بشكل غير متوقع (البوليميراز ، المخزن المؤقت ، إلخ ...).

دعونا نقدم مثالا عمليا.

لنفترض أنني أريد تضخيم نفس التسلسل المستهدف من 10 عينات مختلفة من الحمض النووي.

يبدو رد فعل 1X كما يلي:

** PCR 1X ** القالب 1ul التمهيدي F 1ul التمهيدي R 1ul H2O 10ul MgCl2 2ul dNTPs 2ul Buffer 10X 2ul Polymerase 1ul

الآن ، بالنظر إلى عناصر التحكم الإيجابية والسلبية ، والحجم الإضافي بنسبة 10 ٪ ، سأقوم بإعداد Master Mix لـ 13 تفاعلًا. بالطبع ، يجب استبعاد النموذج.

** Master Mix 13X: ** Primer F 13ul Primer R 13ul H2O 130ul MgCl2 26ul dNTPs 26ul Buffer 10X 26ul Polymerase 13ul

الآن aliquot 19ul في 12 أنبوبًا ، أضف 1ul من القالب الصحيح لكل منهم (في C- فقط أضف 1ul H2O) وقم بتشغيله!

هناك حالات قد ترغب فيها في تضخيم تسلسل أهداف مختلفة من نفس الحمض النووي. في هذا السيناريو ، تريد تضمين القالب في Master Mix ، نظرًا لأنه هو نفسه بالنسبة لجميع التفاعلات ، لكنك تريد إضافة البادئات بشكل منفصل لأن كل تفاعل سيحتوي على مجموعة محددة من التمهيدي لتضخيم تسلسل معين.


هناك أربعة أشياء يمكنك تغييرها اعتمادًا على كمية الحمض النووي التي تحتاج إلى إدخالها في ناقل الاستنساخ:

  • (ط) كمية مخاليط تفاعل البوليميراز المتسلسل ("كم عدد الأنابيب")
  • (2) تركيز قالب DNA ("مقدار قالب DNA في الأنبوب")
  • (3) عدد الدورات ("كم مرة ستضخّم نموذجك")
  • (4) مدى كفاءة التضخيم ("مدى كفاءة التضخيم") ، أي من الناحية المثالية ، تضاعف كل دورة حمضك النووي تمامًا ، ولكنها عمليًا تقريبيا ضعف أو في بعض الأحيان أقل بكثير من الضعف

تذكر أن الأنبوب الواحد بعد 10 دورات يحتوي بشكل مثالي على كمية من الحمض النووي تساوي بالضبط أنبوبين بعد 9 دورات. عادة ما يكون تغيير عدد الدورات هو السبيل للذهاب. لا تحتاج إلى الكثير من الحمض النووي لإدخال ناقل ، سأذهب مع أنبوب واحد لتبدأ.

كم أحتاج من الحمض النووي؟

لا يمكننا مساعدتك في تحديد المقدار الذي تحتاجه ، ولكن انظر إلى مقدار ما تحتاجه لإدخاله في المتجه ؛ قم بعمل فائض باستخدام PCR ، وتحقق لمعرفة ما إذا كان PCR يعمل على مادة هلامية (تنقية الحجم) وقياس تركيز منتجك. ثم تأخذ الكمية المناسبة لصنع المتجه الخاص بك.

التحكم السلبي في تفاعل البوليميراز المتسلسل؟

التحكم السلبي هو تفاعل تحكم يحتوي على جميع المكونات الأساسية لتفاعل التضخيم باستثناء القالب. يتيح ذلك الكشف عن التلوث الناتج عن الكواشف الملوثة أو الحمض النووي الغريب. هنا يجب ألا ترى أي منتج PCR بالضبط - إذا فعلت ذلك ، فسيتعين عليك استكشاف أخطاء الكواشف وإصلاحها!

كم عدد مخاليط تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) المنفصلة التي يجب أن أحضرها؟

إذا كنت تقوم فقط بتضخيم الحمض النووي ، فيجب أن يكون الأنبوب الواحد كافيًا لرؤية أشرطة واضحة على مادة هلامية. في حالات أخرى ، على سبيل المثال مع PCR الكمي (وهو ما لا تفعله) ، يمكنك تحضير نسخ مكررة ، لذلك لديك أنبوب سلبي ، ودعنا نقول 3 أنابيب تجريبية (مكررات تقنية) حتى تتمكن من المتوسط ​​عبرها للحصول على دقة أفضل والموثوقية.

عند تحضير مزيج رئيسي ، على سبيل المثال بالنسبة لـ 10 ردود فعل ، قم بإعداده كما لو كنت تقوم بإجراء تفاعلات أكثر بنسبة 10٪ (11 تفاعلاً) بحيث يمكنك ماصة كل شيء بشكل مريح. هل تحتاج إلى 100 مل من محلول التجربة؟ صنع 110 مل. هذه ممارسة معملية عامة جيدة - قم دائمًا بعمل زيادة طفيفة في عمليات المزج الرئيسية.


يعتمد عدد التفاعلات التي تقوم بإعدادها على الكثير من المعلمات. للإجابة على هذا السؤال ، ستحتاج إلى تفاصيل حول مصدر قالب الحمض النووي ، ونقطة انصهار البادئات ، والتاك الذي تستخدمه وحجم المنتج الذي تريد تضخيمه. كل هذا سيحدد كيفية تحسين PCR الخاص بك. ألق نظرة على المرجع أدناه http://cshprotocols.cshlp.org/content/2009/4/pdb.ip66.abstract


ما هو PCR Master Mix؟

مزيج PCR الرئيسي هو حل مخلوط مسبقًا يحتوي على معظم المكونات اللازمة لتشغيل اختبار PCR. يحتوي المزيج على Taq DNA polymerase و dNTPs و MgCl2، وكذلك المعززات والمثبتات في المخزن المؤقت الذي تم تحسينه لتضخيم الحمض النووي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل.

مزايا استخدام PCR Master Mix

إن النداء الرئيسي لاستخدام مزيج رئيسي من PCR هو ملاءمته. تمت إضافة معظم المكونات بالفعل وتم تحسين الصيغة بالفعل ، وبالتالي تقليل وقت تحضير الفحص المسبق بشكل كبير.

يضمن استخدام مزيج PCR الرئيسي أيضًا درجة عالية من الاتساق ، حتى في بيئات المقايسة ذات الحجم الكبير ، كما أن انخفاض خطوات الماصات المتضمنة يعني أيضًا فرصًا أقل للتلوث. يؤدي استخدام مزيج PCR الرئيسي أيضًا إلى تقليل فرصة حدوث خطأ في التحضير ، مثل ترك أحد المكونات عن طريق الخطأ.

بالإضافة إلى ذلك ، قد تحتوي الخلطات الرئيسية التجارية على معززات ومثبتات مختلفة غير مألوفة لمستخدمي PCR المبتدئين. كما أنها تخضع لإجراءات مراقبة الجودة والتحليل الذي ينتج عنه منتج دقيق للغاية وموثوق. هذه العوامل تؤدي إلى أداء الفحص المحسن بشكل عام.

كل هذه المزايا مهمة بشكل خاص للنظر فيها للمستخدمين الجدد على PCR.

ماذا أضيف إلى PCR Master Mix؟

تنسيق Master Mix واستقراره

توجد خلطات PCR الرئيسية بشكل شائع في تنسيقين رئيسيين. في أغلب الأحيان ، تأتي الخلطات الرئيسية لـ PCR في شكل سائل. تتطلب الخلطات الرئيسية السائلة PCR عمومًا ظروف تخزين بين -20 درجة مئوية – ­­4 درجات مئوية ، وتميل إلى أن تكون أقل تكلفة من الخلطات المجففة بالتجميد. يتم إذابتها قبل استخدامها في اختبار PCR.

قد تأتي الخلطات الرئيسية لـ PCR أيضًا في شكل مجففة بالتجميد أو مجففة بالتجميد. هذا يسمح لشحن المزيج في درجات الحرارة المحيطة. يمكن أيضًا تخزين بعض الخلطات الرئيسية المجففة بالتجميد في درجات حرارة محيطة على المدى الطويل. ثم يتم إعادة تكوين المزيج الرئيسي بمحلول المخزن المؤقت المصاحب قبل الاستخدام.

عمليات المزج الروتينية لـ PCR Master

تعمل الخلطات الرئيسية المستخدمة في فحوصات PCR الروتينية على تضخيم التسلسلات المستهدفة حتى حجم 5 كيلو بايت ، مع محتوى GC يتراوح بين 40٪ و 60٪.

توجد أيضًا العديد من الخلطات الرئيسية للمقايسات التي تتطلب مستوى محسنًا من أداء PCR:

  • Hot Start Taq: منع التضخيم غير المحدد في درجات الحرارة المنخفضة
  • عالية الدقة Taq: إنزيمات متخصصة للأمبليكونات بعيدة المدى ، حتى 20 كيلو بايت

في الوقت الحقيقي يمزج الرئيسي PCR

تم تحسين الخلطات الرئيسية التي تم إنشاؤها للاستخدام مع مقايسات PCR في الوقت الحقيقي للمقايسات التي تستخدم إما الصبغة أو كيمياء الكشف عن المسبار.

قد تحتوي خلطات PCR الرئيسية المستخدمة في الاختبارات التي تستخدم كيمياء الكشف عن الصبغة أو لا تحتوي على صبغة ربط DNA مزدوجة الشريطة الفعلية. إذا لم يتم تضمين الصبغة ، فيجوز للمستخدم إضافة صبغة مخصصة خارجية إلى المزيج الرئيسي.

وبالمثل ، فإن الخلطات الرئيسية لـ PCR المصممة للمقايسات التي تستخدم كيمياء الكشف عن المسبار لا تتضمن المسبار المسمى بالفلوروفور في المزيج ، ولكن يمكن إضافته بواسطة المستخدم.

قد تشتمل الخلطات الرئيسية لـ PCR المخصصة للمقايسات باستخدام أي نوع من كيمياء الكشف أيضًا على صبغة مرجعية سلبية الأكثر شيوعًا هي ROX. هذه الصبغة المرجعية ضرورية لتشغيل بعض أدوات PCR في الوقت الفعلي ، ولكن ليس جميعها. يجب تحديد ما إذا كانت أداتك تتطلب هذه الصبغة المرجعية قبل اختيار مزيج رئيسي في الوقت الفعلي لـ PCR.

هل يجب أن أستخدم مزيجًا رئيسيًا من PCR منزلي الصنع؟

في معظم الحالات ، تكون مزايا استخدام مزيج رئيسي من PCR أكبر بكثير من الفوائد التي يمكن اكتسابها من إنشاء حل مزيج رئيسي مخصص لـ PCR.

ومع ذلك ، بالنسبة للمقايسات التي تتطلب مستوى معززًا من تحكم المستخدم في الظروف التجريبية ، قد تكون الخلطات الرئيسية PCR المصنوعة منزليًا هي الخيار الأفضل. قد تتضمن التطبيقات النهائية التي تتطلب هذا المستوى من تحكم المستخدم في مواصفات الفحص ، التسلسل والاستنساخ وما إلى ذلك.

غالبًا ما تأتي خلطات PCR الرئيسية المصنوعة في المنزل بتكلفة مخفضة أيضًا. ومع ذلك ، يجب إجراء تحسين المخزن المؤقت من قبل المستخدم ، والذي يتضمن استثمارًا إضافيًا للوقت.


تحضير مزيج رئيسي

إليك البروتوكول الأساسي لإعداد تجربة PCR:

أولاً ، يتم دمج جميع المكونات باستثناء قوالب الحمض النووي في ملف مزيج رئيسي (وتسمى أيضًا كوكتيل). يتم ضخ المزيج الرئيسي في أنابيب PCR الفردية ، وفي النهاية يتم إضافة قالب DNA مختلف إلى كل أنبوب. في هذا المثال ، توجد أربعة أنابيب PCR تتضمن عادةً اثنين من PCRs تجريبيين وعنصر تحكم إيجابي وسلبي.


الطرق # 160

تم تحضير مزيج PCR الرئيسي من خلال تضمين المكونات التالية (لكل تفاعل): SapphireAmp Fast PCR Master Mix (2X Premix) ، 25 & microl M13 Primer M4 (20 & microM) ، 0.5 & microl M13 Primer RV (20 & microM) ، 0.5 & microl dH2يا ، 24 ومايكرول. تم توزيع قسامات PCR master mix (50 & microl) في كل أنبوب PCR. تم استخدام طرف الماصة المجهرية المعقمة لنقل بضع خلايا من كل مستعمرة إلى أنبوب PCR المقابل ، حيث تم تعليق الخلايا في مزيج PCR الرئيسي. تم إجراء PCR باستخدام جهاز التدوير الحراري Takara PCR Thermal Cycler Dice (غير متوفر في جميع المواقع الجغرافية). كانت ظروف ركوب الدراجات: 94 درجة مئوية ، دقيقة واحدة تليها 30 دورة من 98 درجة مئوية ، 5 ثوانٍ 55 درجة مئوية ، 5 ثوانٍ و 72 درجة مئوية ، 40 ثانية. بعد اكتمال تفاعل البوليميراز المتسلسل ، تم تعريض 5 ميكرول من كل تفاعل لرحلان كهربائي على هلام الاغاروز 1٪ L03.


الأمريكتان

سيتم عرض الموقع باللغة الإنجليزية.

نحن نستخدم ملفات تعريف الارتباط هذه لضمان عمل موقعنا بشكل آمن وسليم ، فهي ضرورية لعمل خدماتنا ولا يمكن إيقاف تشغيلها في أنظمتنا. عادةً ما يتم تعيينها فقط استجابةً للإجراءات التي تقوم بها والتي ترقى إلى مستوى طلب الخدمات ، مثل تسجيل الدخول أو استخدام عربة التسوق أو ملء النماذج. يمكنك ضبط متصفحك لحظر ملفات تعريف الارتباط هذه أو تنبيهك بها ، لكن بعض أجزاء خدماتنا لن تعمل بدونها. مثل ملفات تعريف الارتباط الأخرى التي نستخدمها ، قد تكون ملفات تعريف الارتباط الضرورية للغاية إما ملفات تعريف ارتباط الطرف الأول أو ملفات تعريف ارتباط الطرف الثالث.

نستخدم ملفات تعريف الارتباط هذه لتذكر إعداداتك وتفضيلاتك. على سبيل المثال ، قد نستخدم ملفات تعريف الارتباط هذه لتذكر تفضيلات اللغة الخاصة بك.
السماح بملفات تعريف الارتباط المفضلة

نحن نستخدم ملفات تعريف الارتباط هذه لجمع معلومات حول كيفية تفاعلك مع خدماتنا ولمساعدتنا في قياسها وتحسينها. على سبيل المثال ، قد نستخدم ملفات تعريف الارتباط هذه لتحديد ما إذا كنت قد تفاعلت مع صفحة معينة.
السماح بملفات تعريف الارتباط الخاصة بالأداء / الإحصائيات

نحن وشركاؤنا الإعلانيون نستخدم ملفات تعريف الارتباط هذه لتقديم الإعلانات ، وجعلها أكثر صلة وذات مغزى بالنسبة لك ، ولتتبع كفاءة حملاتنا الإعلانية ، سواء على خدماتنا أو على مواقع الويب الأخرى ووسائل التواصل الاجتماعي.
السماح بملفات تعريف الارتباط التسويقية


الأمريكتان

سيتم عرض الموقع باللغة الإنجليزية.

نحن نستخدم ملفات تعريف الارتباط هذه لضمان عمل موقعنا بشكل آمن وسليم ، فهي ضرورية لعمل خدماتنا ولا يمكن إيقاف تشغيلها في أنظمتنا. عادةً ما يتم تعيينها فقط استجابةً للإجراءات التي تقوم بها والتي ترقى إلى مستوى طلب الخدمات ، مثل تسجيل الدخول أو استخدام عربة التسوق أو ملء النماذج. يمكنك ضبط متصفحك لحظر ملفات تعريف الارتباط هذه أو تنبيهك بها ، لكن بعض أجزاء خدماتنا لن تعمل بدونها. مثل ملفات تعريف الارتباط الأخرى التي نستخدمها ، قد تكون ملفات تعريف الارتباط الضرورية للغاية إما ملفات تعريف ارتباط الطرف الأول أو ملفات تعريف ارتباط الطرف الثالث.

نستخدم ملفات تعريف الارتباط هذه لتذكر إعداداتك وتفضيلاتك. على سبيل المثال ، قد نستخدم ملفات تعريف الارتباط هذه لتذكر تفضيلات اللغة الخاصة بك.
السماح بملفات تعريف الارتباط المفضلة

نحن نستخدم ملفات تعريف الارتباط هذه لجمع معلومات حول كيفية تفاعلك مع خدماتنا ولمساعدتنا في قياسها وتحسينها. على سبيل المثال ، قد نستخدم ملفات تعريف الارتباط هذه لتحديد ما إذا كنت قد تفاعلت مع صفحة معينة.
السماح بملفات تعريف الارتباط الخاصة بالأداء / الإحصائيات

نحن وشركاؤنا الإعلانيون نستخدم ملفات تعريف الارتباط هذه لتقديم الإعلانات ، وجعلها أكثر صلة وذات مغزى بالنسبة لك ، ولتتبع كفاءة حملاتنا الإعلانية ، سواء على خدماتنا أو على مواقع الويب الأخرى ووسائل التواصل الاجتماعي.
السماح بملفات تعريف الارتباط التسويقية


Pfu DNA Polymerase MasterMix [2X] (1 اقتباسات)

Pfu DNA Polymerase Mastermix [2X] عبارة عن محلول جاهز للاستخدام يحتوي على Pfu DNA Polymerase و dNTPs و MgSO4 ومخزن التفاعل بتركيزات مثالية للتضخيم الفعال لقوالب الحمض النووي بواسطة PCR. لتحضير PCR النهائي ، تتم إضافة البادئات والحمض النووي النموذجي فقط. يساهم Pfu Mix في تفاعل البوليميراز المتسلسل عالي التكاثر عن طريق الحد من مخاطر أخطاء الماص وسوء التقدير والتلوث.


لقد ثبت أن بوليميراز الحمض النووي Pfu ، المشتق من الأثار شديدة الحرارة Pyrococcus furiosus ، يُظهر ثباتًا حراريًا عاليًا وخصائص تدقيق مقارنة بالبوليميرات الأخرى. على عكس بوليميراز Taq ، فإن بوليميراز Pfu DNA عالي الحرارة يمتلك 3 & # 39 إلى 5 & # 39 نشاط تدقيق لغوي خارجي يعمل على تمكين البوليميراز من تصحيح أخطاء التضمين الخاطئ للنيوكليوتيدات. هذا يعني أن شظايا PCR الناتجة عن بوليميريز Pfu سيكون لها أخطاء أقل من إدراجات PCR الناتجة عن Taq. ينتج عن استخدام بوليميراز Pfu DNA في تفاعلات PCR منتجات PCR غير حادة الأطراف ، والتي تعتبر مثالية للاستنساخ في نواقل غير حادة الأطراف. استخدم Pfu polymerase للتقنيات التي تتطلب تخليق DNA عالي الدقة.

تعريف الوحدة
تُعرَّف وحدة واحدة (U) من Pfu polymerase على أنها كمية الإنزيم اللازمة لتحفيز دمج 10 نانومولات من deoxyribonucleotides في مادة غير قابلة للذوبان في الحمض في 30 دقيقة عند 70 درجة مئوية باستخدام DNA الرنجة للحيوانات المنوية كركيزة.

تكوين Pfu MIX
يتم توفير بوليميريز Pfu DNA في 2X Pfu buffer ، dNTPs ، 3mM MgSO4 وأزرق بروموفينول. المخزن المؤقت لمزيج Pfu عبارة عن تركيبة خاصة تم تحسينها لتحقيق أداء قوي في PCR.


NZYTaq II 2x Green Master Mix (MB358)

وصف: NZYTaq II 2 × Green Master Mix هو محلول جاهز للاستخدام يحتوي على NZYTaq II DNA polymerase (MB354) ، والذي ينتمي إلى جيل جديد من طقبوليميرات الحمض النووي المستمدة المحسّنة لتطبيقات PCR القياسية. يحتوي المزيج الرئيسي على dNTPs ومخزن رد فعل وإضافات بتركيزات مثالية ويدعم التضخيم القوي والموثوق لمجموعة واسعة من قوالب الحمض النووي حتى 6 كيلو بايت. MgCl2 التركيز النهائي 2.5 ملي مولار ، مما يسمح بتنفيذ مجموعة شاملة من بروتوكولات تفاعل البوليميراز المتسلسل. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تحميل التفاعلات المجمعة مع NZYTaq II 2 × Green Master Mix مباشرة على مواد هلامية agarose. يحتوي المزيج على صبغتين (أزرق وأصفر) تسمحان بمراقبة تقدم الرحلان الكهربائي.

تحتوي منتجات PCR الناتجة على A-overhang وهي مناسبة للاستنساخ باستخدام مجموعة استنساخ NZY-A PCR من NZYTech (MB053) أو مجموعة استنساخ NZY-A Speedy PCR (MB137).

سمات:
& # 8211 مزيج رئيسي ملائم للاستخدام PCR
& # 8211 تحميل جل مباشر
& # 8211 عوائد عالية مع الحد الأدنى من التحسين
& # 8211 تضخيم قوي باستخدام مجموعة واسعة من قوالب الحمض النووي
& # 8211 يترك حرف A

التطبيقات:
& # 8211 PCR قوية
& # 8211 مستعمرة PCR
& # 8211 جيل من المنتجات لاستنساخ TA

تحديد:

طول المنتج: 0-6 كيلو بايت
قدرة تشبه البدء الساخن: لا
وقت التمديد: 15-30 ثانية / كيلو بايت عند 72 درجة مئوية
3´ → 5´ نشاط: لا
عبء المنتج: 3’-A
شروط التخزين: تخزينها في -20 درجة مئوية
شروط الشحن: يُشحن في درجة حرارة الغرفة لتجفيف الثلج

عناصر:
NZYTaq II 2 × Green Master Mix (0.2 وحدة / ميكرولتر)

1. ماذا تفعل عندما لا يكون هناك تضخيم للمنتج أو عائد منخفض؟
يمكن أن يكون هذا بسبب المواقف التالية:
أ) درجة حرارة التلدين غير الكافية. قد تؤثر تركيبة خليط التفاعل على خصائص انصهار البادئات والحمض النووي. اضبط درجة حرارة التلدين لتلائم المادة الأولية بأقل درجة حرارة انصهار (5 درجات مئوية إلى 10 درجات مئوية أقل من Tm).
ب) وجود مثبطات PCR. يمكن أن تؤدي بعض إجراءات عزل الحمض النووي ، وخاصة عزل الحمض النووي الجيني ، إلى التنقية المشتركة لمثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل. تقليل حجم قالب الحمض النووي في التفاعل أو تمييع DNA القالب قبل الإضافة إلى التفاعل. تم إثبات فعالية العينات المخففة حتى 1: 10000 في تحسين النتائج ، اعتمادًا على تركيز الحمض النووي الأولي.
ج) تركيز المغنيسيوم منخفض للغاية. يتم تضمين Mg 2+ في Master Mix بتركيز نهائي يبلغ 2.5 ملي مولار ، وهو ما يكفي لمعظم الأهداف. بالنسبة لبعض الأهداف ، قد يتطلب الأمر تركيز أعلى من ملغ 2+. عاير من 2.5 ملم إلى 4 ملم (التركيز النهائي) بزيادات 0.5 ملم. (ملاحظة: MgCl2 لا يتم توفيره في أنابيب منفصلة).

2. كيف يمكنني تقليل عدد النطاقات غير المحددة؟
اضبط ظروف التلدين و / أو صمم مجموعة أخرى من البادئات بزيادة الطول وتجنب التسلسلات التكميلية.

3. كيف يمكنني تخزين NZYTaq II 2 × Green Master Mix؟
يجب تخزين المنتج في درجة حرارة ثابتة -20 درجة مئوية.

تحليل مقارن أولي لقوة حل COX1 و
16S-rDNA كواسمات جزيئية لتحديد القراد من البرتغال

Filipe D و Parreira R و Pereira A و Galvão N و Cristovão MJ و Nunes M و Vieira LM و Campino L و Maia و C
علم الطفيليات البيطرية: دراسات إقليمية و Repors , 2021

التنوع الهيكلي للمجموعات ذات التغذية الضوئية داخل موقع اليونسكو "كاتدرائية كويمبرا القديمة" (البرتغال) ، باستخدام نهج مشترك
Soares F ، البرتغال A ، Trovão J ، Coelho C ، Mesquita N ، Pinheiro AC ، Gil F ، Catarino L ، Cardoso SM ، Tiago I
التحلل البيولوجي الدولي والتحلل البيولوجي أمبير, 2019

تنوع الفطريات وتوزيعها عبر ظواهر تدهور حيوي مميزة في جدران الحجر الجيري لكاتدرائية كويمبرا القديمة ، أحد مواقع التراث العالمي لليونسكو
Trovão J ، البرتغال A ، Soares F ، Paiva DS ، Mesquita N ، Coelho C ، Pinheiro AC ، Catarino L ، Gil F ، Tiago I
التحلل البيولوجي الدولي والتحلل البيولوجي أمبير, 2019


    مزيج إنزيم eLONGase (GibcoBRL Life Technologies Cat. No. 10480-028)
    dNTPs (Roche Molecular Biochemicals ، 1051466 ، 1051458 ، 1051440 ، 1051482) - 4 مللي متر
    البادئات الأوليغنوكليوتيد إلى الأمام / العكسي - 7 & # 181M = 100 نانوغرام / & # 181 لتر من 40 مير التمهيدي مع 5 'الذيل
    الامتداد الشامل (انظر دليل بروتوكولات تحليل الحمض النووي - اختيار / تصميم PCR التمهيدي) (GibcoBRL Life Technologies)

I. إعداد رد فعل واحد

    الحجم الإجمالي لتفاعل PCR واحد هو 10 & # 181L. الجدول 1 يسرد الكواشف
    لتفاعل واحد والتركيزات الأولية والنهائية.

    الجدول 1. تركيزات الكاشف وأحجامه لتفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الأحادي
    كاشف[خاتمة أولية][الخلاصة النهائية]الحجم (& # 181 لتر)
    المخزن المؤقت eLONGase A10x0.5 مرة1
    العازلة eLONGase ب10x0.5 مرة1
    درهم 2010x0.5 مرة1
    DNTPs4 ملم100 & # 181 م0.25
    eLONGasetaq1 U / & # 181L0.4 U / & # 181L0.4
    التمهيدي 17 & # 181 م140 نانومتر0.2
    التمهيدي 27 & # 181 م140 نانومتر0.2
    الحمض النووي5 & ​​# 181 م2 نانوغرام / & # 181 لتر4
    الحجم الكلي10

II. إعداد كاشف eLONGase MasterMix

  1. يتم تقسيم eLONGase MasterMix إلى عمودين من لوحة PCR بها 96 جيدًا.
  2. يتم وضع حجم 7 أضعاف (39.2 لتر / بئر) من MasterMix في العمودين 1 و 7 في لوحة PCR الجاهزة.
  3. نضيف رد فعل إضافي واحد لاستيعاب خطأ الماص عبر الأعمدة.
      ملحوظة: إعداد الكاشف خاص بإعداد كتلة لوحة DNA PGA الخاصة بنا (انظر لوحة DNA) ، والتي تتكون من كتلة بئر عميقة 96 تنسيق تحتوي على 48 عينة DNA مكررة على جانبي الكتلة ، الأعمدة 1-6 و7-12 ، على التوالي (انظر الشكل 1).

ثالثا. وصفة eLongase Master Mix

  1. لسهولة التقطيع على لوحة PCR الجاهزة ، يمكن إعداد voume MasterMix كبير (حجم لوحة 12x96 أو أكبر) في لوحة عميقة 96 بئر ونقلها باستخدام ماصة متعددة القنوات (أو روبوت) إلى PCR جاهز لوحة (انظر العمود الأخير ، الجدول 2، أدناه).
    الجدول 2.تركيز وحجم eLONGase MasterMix
    كاشف[خاتمة أولية][الخلاصة النهائية]الحجم (& # 181 لتر)
    لوحة 1x96
    (عمودان)
    الحجم (& # 181 لتر)
    12x96 لوحة
    (24 عمودًا)
    المخزن المؤقت eLONGase A5X0.5 مرة14168.0
    العازلة eLONGase ب5X0.5 مرة14168.0
    درهم 201X1X41.3495.6
    dNTPs4 & # 181 م100 & # 181 م5.642.0
    eLONGase طق1 U / & # 181L0.04 & # 181 لتر0.2567.2
    الحجم الكلي78.4940.8
    ملحوظة: جميع الإضافات إلى بئر واحد في عمود واحد من الصفيحة العميقة 96 بئر ، ما لم يذكر خلاف ذلك.

رابعا. تحضير Elongase MasterMix ليتم تقسيمه

  1. ذوبان الجليد Elongase المخازن المؤقتة A و B و ddNTPs. بعد الذوبان ، دوامة جيدا.
  2. احتفظ بإنزيم Elongase في الفريزر لحين الحاجة إليه.
  3. أضف 495.6 لتر - ddH2O
  4. أضف 168 لترًا - Elongase Buffer أ
  5. أضف 168 لترًا - Elongase Buffer ب
  6. أضف 42 لترًا - dNTPs
  7. إزالة إنزيم Elongase من الفريزر
  8. أضف 67.2 لتر - إنزيم Elongase
  9. ببطء مزيج MasterMix 30 مرة في كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات 20-200 لتر (الإعداد = 15 لتر).
  10. كتلة الطرد المركزي العميقة 96 بئر على سرعة منخفضة (Jouan Centrifuge: 190 x g لمدة 20 ثانية ، البرنامج 1 (1000 دورة في الدقيقة لمدة 20 ثانية>.

خامسا - إعداد 96-حواف جيدا لوحات PCR الجاهزة

  1. ارسم خطًا بين العمودين 6 و 7 للإشارة إلى نصفي اللوحة ذات 96 بئر.
  2. ضع دائرة حول البئر في الصف Q والعمود 1 (في الزاوية العلوية اليسرى) لتحديد الاتجاه.
  3. تشكل Aliquot 39.w L كل بئر من الصفيحة العميقة ذات 96 بئرًا إلى العمودين 1 و 7 من لوحة ذات 96 بئر جاهز لـ PCR باستخدام ماصة متعددة القنوات 20-200.
  4. ضع كل طبق منتهي على الجليد.
  5. قم بتسمية رقائق الألومنيوم المانعة للتسرب بالتاريخ الحالي و PCR-READY MASTERMIX.
  6. أغلق كل لوحة بورق إحكام من الألمنيوم وفريزر من الدانتيل في -20 درجة مئوية.

السادس. إعداد تضخيم PCR جاهز

باليد:

تحدد هذه الاتجاهات إعداد لوحة واحدة. يمكن تضخيم مجموعتين من البرايمر على لوحة واحدة ، مجموعة واحدة في الأعمدة 1 من خلال 6 (يشار إليها أدناه بمجموعة التمهيدي رقم 1) والمجموعة الأخرى في الأعمدة 7 إلى 12 (يشار إليها أدناه بمجموعة التمهيدي رقم 2). يمكن إعداد لوحات متعددة في وقت واحد ، مع الاحتفاظ بجميع الألواح على الجليد أثناء عدم استخدامها.


شاهد الفيديو: PCR Master Mix preparation and RT-PCR (كانون الثاني 2023).