معلومة

CD4 + كمستقبلات سطح خلية حيدات

CD4 + كمستقبلات سطح خلية حيدات


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

اليوم في الفصل ، كان معلمنا يناقش إمراضية فيروس نقص المناعة البشرية.

وقال إن الارتباط بين فيروس نقص المناعة البشرية والضامة يتم عن طريق التفاعل بين GP120 للفيروس و مستقبلات CD4، مستقبلات كيموكين (CCR-5 و CXCR-4) ومستقبلات fusin موجودة على البلاعم.

أشك في أن مستقبلات CD4 موجودة في الخلايا التائية المساعدة فقط. هل هم موجودون على البلاعم أيضًا؟ هل لدي فكرة خاطئة عن مستقبلات CD4؟ إذا لم يكن الأمر كذلك ، فهل هناك بعض المستقبلات الأخرى المسؤولة عن نقل الجزيئات الفيروسية داخل الخلايا الوحيدة والخلايا المتغصنة؟

هو موضع تقدير أي معلومات إضافية.


يمكن للخلايا الضامة والخلايا أحادية الخلية التعبير عن CD4 أو CD8 أو حتى المشاركة في التعبير عنها. تتفاعل جزيئات CD4 و CD8 مع مجمعات معقد التوافق النسيجي الكبير على الخلايا المجاورة ، وكما يمكنك تخيل إحداث تأثير متباين بطريقة تعتمد على نوع الخلية.

من الواضح أن Zhen et al. أظهر أن ربط CD4 أحادي الخلية بجزيئات MHC-II على خلايا أخرى ، مثل البطانة النشطة ، قد تسبب في نمط تعبير يفضي إلى تمايز البلاعم (1). جيبينغز وآخرون. أظهر أيضًا أن CD8 يرتبط بـ FcyR على سطح الوحيدات على غرار ارتباطات CD8 / TCR ، ويحفز إفراز السيتوكينات (2).

سأحاول العثور على مصدر نموذجي ، لكن CD8a على الخلايا التغصنية يمكن أن يرتبط بجزيئات MHC-II على الخلايا التائية مثل HLA-DR ويساعد في التهيئة المتقاطعة للخلايا التائية.

الآن ما يفعله CD4 على الضامة الوظيفية المتمايزة أقل وضوحًا بالنسبة لي ، وأحتاج إلى مراجعة الأدبيات حول ذلك أكثر قليلاً. يمكن أن يكون مجرد تعبير مطبوع لأنه خلايا مشتقة من خلية واحدة ، أو يمكن أن يثير أيضًا تأثيرًا مثل CD8 / FcryR أعلاه. لا اعرف.

هناك المزيد من الحالات ، لذلك تعمل هذه كأمثلة مختارة.


علم الأحياء: CD4

في علم الأحياء الجزيئي ، CD4 (مجموعة التمايز 4) هو بروتين سكري موجود على سطح الخلايا المناعية مثل الخلايا التائية المساعدة ، وحيدات ، والضامة ، والخلايا التغصنية. تم اكتشافه في أواخر السبعينيات وكان يُعرف في الأصل باسم leu-3 و T4 (بعد الجسم المضاد أحادي النسيلة OKT4 الذي تفاعل معه) قبل تسميته CD4 في عام 1984. & # 911 & # 93 في البشر ، يتم تشفير بروتين CD4 بواسطة CD4 الجين. & # 912 & # 93 & # 913 & # 93

الخلايا المساعدة CD4 + T هي خلايا الدم البيضاء التي تعد جزءًا أساسيًا من جهاز المناعة البشري. غالبًا ما يشار إليها باسم خلايا CD4 أو الخلايا التائية المساعدة أو خلايا T4. يطلق عليها اسم الخلايا المساعدة لأن أحد أدوارها الرئيسية هو إرسال إشارات إلى أنواع أخرى من الخلايا المناعية ، بما في ذلك الخلايا القاتلة CD8 ، والتي تقوم بعد ذلك بتدمير الجسيمات المعدية. إذا أصبحت خلايا CD4 مستنفدة ، على سبيل المثال في حالة عدوى فيروس نقص المناعة البشرية غير المعالجة ، أو بعد تثبيط المناعة قبل الزرع ، يُترك الجسم عرضة لمجموعة واسعة من العدوى التي كان من الممكن محاربتها لولا ذلك.


تنظيم المرسل الثاني لترابط المستقبل مع الحفر المطلية بالكالاثرين: آلية جديدة وانتقائية في التحكم في الالتقام الخلوي CD4.

CD4 ، وهو عضو في عائلة الغلوبولين المناعي الفائق ، لا يتم التعبير عنه فقط في الخلايا الليمفاوية المساعدة T4 ولكن أيضًا في الخلايا النخاعية. يلعب الالتقام الخلوي بوساطة المستقبلات دورًا مهمًا في تنظيم التعبير السطحي لجزيئات الالتصاق مثل CD4. في الخلايا اللمفاوية التائية p56lck ، يمنع التيروزين كيناز المرتبط بـ CD4 استيعاب CD4 ، ولكن في الخلايا النخاعية لا يتم التعبير عن p56lck ويتم استيعاب CD4 بشكل أساسي. في هذه الدراسة ، قمنا بالتحقيق في دور AMP الدوري (cAMP) في تنظيم الالتقام الخلوي CD4 في خط الخلايا النخاعية HL-60. تم الحصول على ارتفاعات cAMP الخلوية بواسطة 1) ذيفان الكوليرا ، 2) سم السعال الديكي ، 3) فورسكولين و IBMX ، 4) NaF ، أو 5) ناهض المستقبلات الفسيولوجية البروستاجلاندين E1. أدت جميع التدخلات الخمسة إلى تثبيط استيعاب CD4. زيادة مستويات cAMP لم تمنع الالتقام الخلوي في حد ذاته ، لأن استيعاب مستقبلات الأنسولين ومستقبلات الترانسفيرين والالتقام الخلوي في الطور السائل إما لم يتغير أو يتحسن بشكل طفيف. تم تحليل آلية تثبيط cAMP على مستوى البنية التحتية. أظهر استيعاب CD4 ، متبوعًا إما بالتصوير الإشعاعي الذاتي بالمجهر الإلكتروني الكمي أو عن طريق وضع العلامات على الذهب المناعي ، ارتباطًا سريعًا يعتمد على درجة الحرارة لـ CD4 مع حفر مغلفة بالكلاثرين في خلايا التحكم. تم تثبيط هذا الارتباط بشكل ملحوظ في الخلايا ذات المستويات المرتفعة من cAMP. وبالتالي تشير هذه النتائج إلى تنظيم المرسل الثاني لاستيعاب CD4 من خلال تثبيط ارتباط CD4 بالحفر المطلية بالكلاترين في الخلايا السلبية p56lck.


المظاهر السريرية لعدوى HIV-1

ينتقل فيروس HIV-1 عن طريق تبادل سوائل الجسم. قد تتضمن طريقة الانتقال نقل الفيروسات الحرة أو الخلايا المصابة بفيروس HIV-1. ينتج عن العدوى الأولية (الحادة) بفيروس HIV-1 أعراض سريرية في غضون أسبوع إلى ثلاثة أسابيع في نصف المصابين حديثًا على الأقل. تشبه هذه الأعراض أعراض الأنفلونزا أو عدد كريات الدم البيضاء مع طفح جلدي حمامي بقعي غير حاك. 52 بعد فترة وجيزة من العدوى الحادة ، يخضع معظم المرضى للانقلاب المصلي. يتبع ذلك فترة من الكمون السريري ، والتي قد تستمر من 3 إلى أكثر من 15 عامًا ، قبل أن يتطور الإيدز ويموت المريض في النهاية من عدوى متعددة و / أو أورام خبيثة. يصاحب التقدم في مرض الإيدز فقدان الخلايا الليمفاوية التائية CD4 + ، مع ملاحظة الأعراض عند مستويات الدم أقل من 500 خلية / لتر. على الرغم من أن الغالبية العظمى من المصابين بفيروس HIV-1 سيصابون بمرض الإيدز ، إلا أن هناك أدلة متزايدة على أن بعض الأشخاص قادرون على التعايش مع الفيروس لفترات طويلة من الزمن دون أن يصابوا بمرض إكلينيكي. يُطلق على هؤلاء الأفراد اسم "غير متقدمين على المدى الطويل" ، على الرغم من أن الوقت وحده هو الذي سيحدد ما إذا كانت هذه المجموعة ستستسلم أيضًا للمرض. 53 العوامل التي تؤثر على معدل التقدم إلى الإيدز (للمراجعة ، انظر ليفي 54) تشمل العمر (يتقدم معظم الأطفال المصابين بفيروس العوز المناعي البشري ببطء نسبيًا 55 ، 56) ، والصحة العامة (قد يؤدي وجود عدوى أخرى إلى تسريع التقدم إلى الإيدز 57) و نمط الحياة (التدخين ، 58 كحول 59 وتعاطي المخدرات 60 قد يسرعان من التقدم). قد تكون الاختلافات في إصابة سلالة HIV-1 والاستجابة المناعية للمضيف مهمة أيضًا في معدلات تطور المرض.


أنواع الخلايا التي تتنوع CD8 و CD4 السريع بين الأنواع الثديية

يتم التعبير عن CD8 و CD4 بواسطة عدة أنواع من الخلايا التي لا تعبر عن TCR ، على الرغم من أنه يجب تحذير هذا البيان من خلال عرض TCR المعاد ترتيبها على العدلات [21] ووجود جينات TCR مُعاد ترتيبها في DCs [4] وخلايا NK [22] . لدى الفئران والأنواع البشرية اختلافات كبيرة في جهاز المناعة لديهم [23]. أحد هذه الاختلافات في أنواع الخلايا ، والتي تعبر عن CD4 و CD8. على الرغم من وجود CD8 في الخلايا DC و T في جميع الأنواع [24 25 26] ، إلا أنه في الفئران والبشر فقط يوجد CD8 في مجموعة متنوعة من الخلايا المناعية الأخرى. تشير الأدلة الحالية إلى أن بروتين CD8α يتم التعبير عنه بواسطة الخلايا القاتلة الطبيعية في الفئران [27] والبشر [28] ولكن ليس في الفئران [29] (الجدول 1 والمراجع فيه). وبالمثل يعبر الجرذان [42 ، 44] والوحيدات البشرية [31] والضامة [35] عن CD8α ، وتفتقر نفس الخلايا في الفأر إلى CD8α [33]. ومن المثير للاهتمام أن الضامة والخلايا البدينة الجرذان تعبر أيضًا عن CD8β [35 ، 36]. على غرار حالة CD8 ، يتم التعبير عن CD4 في الفئران والإنسان من خلال مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا المناعية الفطرية أكثر من الفئران (الجدول 1 والمراجع فيه). ومن المثير للاهتمام ، أن البلدان النامية تتباعد أيضًا بين الأنواع في نمط تعبيرها عن CD4: تعبر الماوس DCs عن مستويات عالية من CD4 ، لكن DCs البشرية والفئران تعبر عن CD4 عند مستويات منخفضة [26].

آليات تنشيط الإشارات داخل الخلايا لـ CD4 و CD8

في مراحل زمنية مختلفة من إشارات TCR ، قد يعمل CD4 و CD8 داخل أو خارج أطواف الدهون للتأثير على الإشارات داخل الخلايا من خلال lck أو LAT. في واحدة من أولى خطوات تنشيط TCR ، CD45 ، الموجود خارج أطواف الدهون ، dephosphorylates lck. الراسب المناعي لـ CD4 و CD8 مع CD45 [45 ، 46] وقد يكون متورطًا في نزع الفسفرة المبكرة للدهون المستقلة عن lck. ثم ينتقل lck منزوع الفسفرة إلى طوافات دهنية لتفسفر موقعين على CD3ζ. قد ينظم نظام النخلة الديناميكي لـ lck و / أو CD4 و CD8 انتقال lck إلى أطواف دهنية. بعد ذلك ، يمكن تجنيد ZAP-70 بواسطة CD3ζ فسفرته. يمكن بعد ذلك لـ ZAP-70 فسفوريلات LAT ، والذي من المحتمل أن يكون مرتبطًا بـ CD4 و CD8 [12]. يمكن لهذا LAT المرتبط بطوافات الدهون أن يركز على شبكة سقالات من مجمعات الإشارات داخل الخلايا ، وتجنيد SLP-76 بشكل غير مباشر إلى مجمعات TCR. يقوم SLP-76 بتجنيد المنطقة غير المحفزة من التيروزين كيناز (NCK) ويسمح بتنشيط Itk المعين ، مما يساهم في الفسفرة وتفعيل PLCγ [47]. سيؤثر الارتباط اللاحق لـ PLCγ بـ LAT مع Grb2 معًا بقوة على تدفق الكالسيوم ، وإعادة تنظيم الهيكل الخلوي ، والانتشار ، ونسخ الجينات [48].

بالإضافة إلى تنشيط الإشارات داخل الخلايا من خلال lck أو LAT ، قد يؤثر CD8 على تنشيط الخلايا التائية بوساطة TCR من خلال ارتباطه خارج الخلية بفئة MHC الأولى. ، نموذجي للربط الملائم المستحث [9] ، في حين أن CD8 لديه معدل ارتباط أسرع نموذجي لربط الجسم الصلب (1.4 × 10 5 / Ms −1) [49]. يجب أن يتصل CD8 ، إحصائيًا ، بفئة MHC I على خلية ملائمة قبل TCR ، كما تؤكد البيانات التجريبية [50]. حركيات الربط لـ CD4 لفئة MHC I أقل وضوحًا ولكنها تشبه CD8 بشكل عام [9] ، مما يشير إلى أن النماذج المماثلة قد تكون قابلة للتطبيق عليها أيضًا. ومن المثير للاهتمام ، أن علم البلورات ثنائي الأبعاد لفئة معقد التوافق النسيجي الكبير I على طوافات دهنية يشير إلى أن الفئة الأولى من معقد التوافق النسيجي الكبير قد تتبنى اتجاه ضعيف على غشاء البلازما مع كشف موقع ربط CD8 وموقع ربط TCR محجوب جزئيًا [51]. وبالتالي ، تشير معدلات الارتباط والاعتبارات المكانية إلى أن CD8 قد ينشئ تفاعلات أولى مع MHC class I ويزيد من احتمالية مسح TCR والانحناء لإشراك فئة MHC I بشكل مثمر في وقت لاحق.


الاستنتاجات

في هذه الدراسة ، تُستخدم قياسات MRM MS و SEM لتقييم اثنين من تحضيرات خلايا الدم البشرية بحثًا عن المواد المرجعية للخلايا المثلى لقياس التدفق الخلوي الكمي التي تكون أكثر استقرارًا وأسهل في الحفاظ عليها من الدم الكامل الطازج. بسبب عملية التجفيد ، فإن قيمة كثافة CD4 على الخلايا الليمفاوية CD4 + من خلايا Cyto-Trol أقل من القيمة من PBMC المحفوظة بالتبريد ، والتي يتم تفسيرها على الأرجح من خلال اقتطاع بروتينات مستقبلات CD4 والميكروفيلي التالفة و / أو المكسورة حيث توجد مستقبلات CD4. من ناحية أخرى ، من المحتمل أن يسهم العائق الفاصل لربط الأجسام المضادة وارتباط مستقبلات CD4 مع الجزيئات الحيوية الأخرى بشكل كبير في ما يقرب من 50 ٪ من قيمة كثافة مستقبل CD4 الأقل لـ PBMC المحفوظة بالتبريد والتي تم تحديدها من قياس التدفق الخلوي أكثر من القيمة التي تم الحصول عليها من MRM MS.

إن تعبير CD4 المتسق على الخلايا التائية في PBMC المتبرع الطبيعي ، والذي يعمل بمثابة عنصر تحكم بيولوجي يعزز موثوقية التشخيص السريري والعلاجات المناعية. يلعب بروتين مستقبل CD4 هذا أيضًا دورًا مهمًا في تطور العدوى الفيروسية HIV-1 حيث يرتبط بروتين gp120 الفيروسي بمستقبل CD4 على الخلايا التائية ، مما يؤدي إلى دخول الفيروس وتفكك الخلية [15]. على الرغم من بذل العديد من الجهود في تطوير لقاحات ضد العدوى ، إلا أن هناك نجاحًا محدودًا إلى حد كبير بسبب تعقيد عملية العدوى الفيروسية وتقنيات القياس القوية المحدودة التي تدعم فهم الآليات الأساسية للقاحات التجريبية. التقنيات الثلاثة القوية المستخدمة في هذه الدراسة ، قياس التدفق الخلوي ، MRM MS والمسح المجهري الإلكتروني ، سمحت لنا بفهم أفضل للتغييرات التي تسببها عملية التجفيد على الخلايا الليمفاوية CD4 +. ستمكّن هذه التقنيات من قياس كثافة مستقبلات CD4 وعدد الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة لـ CD4 ، على سبيل المثال ، إيباليزوماب [16] وإيباليزوماب ثنائي الخصوصية [17] ، المرتبطة بالخلايا التي تحمل مستقبلات CD4. ستساعد هذه القياسات بشكل كبير في إلقاء الضوء على الآليات الأساسية للقاحين التجريبيين لعلاج فيروس نقص المناعة البشرية -1 والوقاية منه. علاوة على ذلك ، تم الإبلاغ عن تعبير سطح خلية CD4 المعدَّل والتوطين دون الخلوي [18] ، ونضوب بروتين CD4 السطحي [19] في الأدبيات في بعض حالات الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية. سيكون بالتأكيد أكثر صعوبة لتطبيق هذه التقنيات لقياس بروتينات CD4 الداخلية في حجرات خلوية مختلفة.


النتائج

الترسيب المناعي النوعي للـ CD4 و CCR5 من خطوط الخلايا.

وجد سابقًا أن جزء D1D2 القابل للذوبان ، ولكن ليس الجزء خارج الخلية بالكامل من CD4 ، يتداخل مع chemokine MIP-1α للربط بـ CCR5 ، مما يشير إلى التفاعلات المحتملة بين CD4 و CCR5 (11). على الرغم من أن الاختلافات بين المجالين وأجزاء المجال الأربعة لـ CD4 يمكن أن تُعزى إلى تعرض أفضل للحلقات المطابقة في جزء CD4 ذي المجالين ، فإن الاحتمال البديل هو أن تفاعل CD4D1D2-CCR5 لا يعكس خصائص الارتباط CD4 من النوع البري (المرتبط بالغشاء) بـ CCR5. لذلك ، استخدمنا مقايسة الترسيب المناعي ، المحسّن من أجل الكفاءة العالية والتكاثر ، للكشف المباشر عن التفاعلات بين CD4 و CCR5 المرتبط بالغشاء الأصلي.

لإثبات التكاثر المناعي المشترك لسطح الخلية CD4 و CCR5 ، استخدمنا خطوط الخلايا 3T3 المنقولة للتعبير عن CD4 (3T3.CD4) و CD4 و CXCR4 (3T3.CD4.CXCR4) أو CD4 و CCR5 (3T3.CD4.CCR5). كانت تركيزات CD4 على أسطح هذه الخلايا متشابهة جدًا: كانت نسبها 1.26: 1.2: 1 ، على التوالي ، كما تم قياسها باستخدام قياس التدفق الخلوي (البيانات غير معروضة انظر أيضًا الشكل 1).أ، الممر الثاني). كانت التركيزات السطحية لـ CCR5 و CXCR4 أيضًا متشابهة جدًا (لا تظهر بيانات قياس التدفق الخلوي). نظرًا لأن اكتشاف CD4 أسهل من خلال النشاف الغربي والترابط الحيوي مقارنة بـ CCR5 ، فقد استخدمنا في معظم الحالات الأجسام المضادة لـ CCR5 لتكوين الراسب المناعي CD4. وجدنا أن mAb 5C7 (29) الخاص بالطرف N كان أكثر الأجسام المضادة كفاءة في CCR5 المناعي مقارنة ببطارية من الأجسام المضادة الأخرى المضادة لـ CCR5 (البيانات غير معروضة). هذا mAb coimmunoprecipitated CD4 المرتبط بالسطح في خطوط الخلايا 3T3 التي تربط CD4 و CCR5 (الشكل 1).أ، الممر الرابع). كان النطاق CD4 لأنه يتماشى مع نطاق CD4 الذي تم الحصول عليه عن طريق الترسيب المناعي المباشر باستخدام مضاد CD4 mAb (OKT4) (الشكل 1).أ، lane II) ، بالوزن الجزيئي المتوقع (55 كيلو دالتون) ، ويتفاعل بشكل خاص في اختبار لطخة غربية (الشكل 1).أ، الممر الخامس). تم إثراء CD4 بدرجة عالية وعلى وجه التحديد في الراسبات المناعية المشتركة كما لوحظ من خلال مقارنة lysates المعالجة بالبيوتين على سطح الخلية والتي لم تتعرض للترسيب المناعي (الشكل 1).أ، الممر الأول) مع الراسبات المناعية المشتركة (الشكل 1أ، الممر الرابع). في هذه التجارب ، لم يتم اكتشاف CCR5 بسبب انخفاض كفاءة المعالجة الحيوية ، ومع ذلك ، فقد لوحظ باستخدام النشاف الغربي (الشكل 1).أ، الممر السادس). تم الحصول على نتائج مماثلة لعدد من خطوط الخلايا ، بما في ذلك PM1 و L1.2 transfectants ، التي تتعايش مع CCR5 و CD4 (البيانات غير معروضة).

ترسيب مناعي معين من CD4 و CCR5 المرتبط بسطح الخلية من خلايا 3T3 التي تتعاون مع هذين الجزيئين. (أ) تمت معالجة عدد متساوٍ من الخلايا 3T3 التي تعبر عن CD4 و CCR5 (+) أو CD4 فقط (-) ، ومعالجتها كما هو موضح في المواد والأساليب، وإما تستخدم كمحلل كامل الخلية (0.25٪ من الإجمالي ، جل I) أو مُستحضر مناعي بمضاد CD4 mAb (OKT4) (gel II) ، أو anti-CXCR4 mAb (4G10) (gel III) ، أو مضاد- CCR5 مللي أمبير 5C7 (المواد الهلامية من الرابع إلى السادس). تم الكشف عن البروتينات المعالجة بيوتينيلات باستخدام الستربتافيدين - الفجل البيروكسيديز (المواد الهلامية من الأول إلى الرابع). تم اكتشاف CD4 و CCR5 في قسامة من نفس العينات كما في الهلام الرابع باستخدام النشاف الغربي مع جسم مضاد متعدد الأضلاع مضاد لـ CD4 (T4-4) (جل V) أو جسم مضاد متعدد النسيلة لـ CCR5 [CKR5 (C20)] ( جل السادس). (تشير M إلى الواسمات الجزيئية ، والأرقام بالكيلو دالتون). (ب) الترسيب المناعي للـ CD4 بواسطة مضاد CCR5 mAbs m180 (الممر 1) و m181 (الممر 2). تم الكشف عن CD4 coimmunoprecipitated و CCR5 المناعي عن طريق الغناء النشاف الغربي كما في أ. (ج) ترسيب CCR5 من خلايا 3T3.CD4.CCR5 مع الأجسام المضادة لـ CD4. تم استخدام خلايا 3T3.CD4.CCR5 (الممرات 1 و 2 و 4) أو خلايا 3T3.CD4 (الممر 3) للترسيب المناعي بواسطة OKT4 (الممرات 2 و 3) أو بواسطة جسم مضاد للتحكم (CG10) (الممر 4). يظهر المسار 1 للمقارنة بين الترسيب المناعي ومضاد CCR5 mAb 5C7. تم الكشف عن CD4 و CCR5 باستخدام النشاف الغربي كما في أ. (د) تم تحصين محللات الخلايا بواسطة مضاد CCR5 mAb 5C7 ، تم تحليل منتج الترسيب المناعي باستخدام مجموعة صبغة الفضة (الممرات 1 و 2) ومقارنتها بالبروتينات التي تم الكشف عنها بواسطة الستربتافيدين - الفجل البيروكسيديز في محلولات بيوتينيلاتيد (الممرات 3 و 4). تشير M إلى علامة الوزن الجزيئي ، و + و - تدل على 3T3.CD4.CCR5 أو 3T3.CD4 ، على التوالي. ∗ ، العصابات الناتجة عن CD4 و CCR5. ينتج النطاقان الموجودان أعلى وأسفل CD4 عن سلسلة 5C7 mAb الثقيلة والخفيفة ، على التوالي. يمثل المسار 2 الممر 1 بحساسية أعلى ، حيث يظهر CCR5 بوضوح. (ه) لا يتأثر الترسيب المناعي المشترك CD4 – CCR5 بشكل كبير باستنفاد الكوليسترول. تم علاج خلايا 3T3.CD4.CCR5 بـ 10 ملي ميثيل- بيتا- سيكلودكسترين لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية (مما تسبب في سمية خلوية كبيرة) واستخدمت في الترسيب المناعي بواسطة الجسم المضاد 5C7 المضاد لـ CCR5 (الخط 2) ، ومقارنتها بالخلايا غير المعالجة (الممر 1) وخلايا 3T3.CD4 (الممر 3). تم الكشف عن CD4 و CCR5 باستخدام النشاف الغربي كما في أ. قاع يُظهر النشاف الغربي لـ CD4 من lysates كامل الخلية.

تم توضيح خصوصية الترسيب المناعي المشترك CD4 من خلال العديد من تجارب التحكم. لم يقم المضاد CCR5 mAb 5C7 بتجميع CD4 المناعي من خلايا 3T3.CD4 التي لا تعبر عن CCR5 (الشكل 1).أ، الممرات الرابع والخامس). في تجربة أخرى ، تم استخدام جسم مضاد (4G10) لمستقبل كيميائي مرتبط (CXCR4). هذا الجسم المضاد قادر على الترسب المناعي بكفاءة لـ CXCR4 والراسب المناعي المشترك CD4 و CXCR4 في الخلايا التي تعبر عن هذين الجزيئين (الشكل 3).أ) لكنها لم تتعاون مع CD4 المناعي في الخلايا التي تعبر عن CD4 و CCR5 (الشكل 1).أ، الممر الثالث). بالإضافة إلى ذلك ، كانت كمية CD4 المناعي المتساقط متناسبة مع كمية CCR5 المناعي ، والتي تم توضيحها باستخدام اثنين من مضادات CCR5 mAbs مع أنشطة مختلفة لتثبيط المناعة (الشكل 1).ب) ، مما يشير كذلك إلى تفاعل محدد بين CD4 و CCR5. نحن نشارك CCR5 مع جسم مضاد لـ CD4 (OKT4) (الشكل 1).ج، الممر 2) ، ولكن ليس بجسم مضاد للتحكم (CG10) ، والذي لا يرتبط بـ CD4 (الممر 4) ، في الخلايا التي تربط هذين الجزيئين (الممر 2) ، ولكن ليس في الخلايا السالبة CCR5 (الممر 3).

لمزيد من التقييم لخصوصية تفاعل CD4-CCR5 ولمعالجة مسألة ما إذا كانت البروتينات الأخرى تتفاعل مع CCR5 وربما تؤثر على رابطة CD4-CCR5 ، استخدمنا تلطيخ الفضة للبروتينات المناعية بواسطة مضاد CCR5 mAb 5C7 بالتوازي مع biotinylation (بعض البروتينات ، وخاصة مستقبلات الكيموكين ، يتم تصنيفها بشكل سيئ بواسطة البيوتين وقد لا يتم الكشف عن التركيزات المنخفضة). بصرف النظر عن النطاقات المقابلة لـ CCR5 و CD4 ، فإن النطاقات الرئيسية الأخرى الوحيدة هي تلك التي تمثل السلاسل الثقيلة والخفيفة من mAb 5C7 المترسب والنطاقات التي يبدو أنها ليست خاصة بـ CCR5 ، لأنها كانت مناعة في الخلايا السلبية CCR5 (الشكل. 1د). لا تشير هذه البيانات فقط إلى أن التفاعل بين CD4 و CCR5 لا يتوسطه جزيء آخر ، ولكنها تشير أيضًا إلى أن الترسيب المناعي المشترك لـ CD4 و CCR5 من غير المحتمل أن يكون بسبب تجزئة هذين الجزيئين داخل النطاقات الدقيقة الغشائية المحددة ، مما قد يؤدي إلى ترسيب مناعي متزامن لـ CD4 و CCR5 عدد أكبر من البروتينات. تُظهر تجربة أخرى تدعم هذه الفكرة أن تحلل الخلايا باستخدام منظفين مختلفين (Brij97 و NP40) لم يعطل تفاعل CD4-CCR5 (البيانات غير معروضة). علاوة على ذلك ، فإن استنفاد الكوليسترول من غشاء الخلية باستخدام methyl-β-cyclodextrin ، وهو إجراء ثبت أنه يعطل بنية المجال الصغير (انظر ، على سبيل المثال ، المرجع 30) ، لم يمنع الترسيب المناعي المشترك لـ CD4 و CCR5 (الشكل 1).ه).

الترسيب المناعي المشترك لـ CD4 و CCR5 في الخلايا الأولية CD4 + T ، الضامة ، و monocytes.

تم الحصول على نتائج مماثلة لتلك الموصوفة أعلاه لخطوط الخلايا أيضًا مع الخلايا البشرية الأولية المعرضة لدخول HIV-1. أدت محاولاتنا الأولية لترسيب CD4 و CCR5 المناعي من سطح الخلايا اللمفاوية التائية الأولية إلى نطاقات ضعيفة جدًا كانت في حدود حساسية الفحص ، بسبب انخفاض مستوى التعبير عن CCR5 على سطح هذه الخلايا والنسبة المئوية الصغيرة نسبيًا للخلايا معربا عنها كما تم تقييمها عن طريق قياس التدفق الخلوي (البيانات غير معروضة). باستخدام إجراءين بديلين لتنشيط خلايا CD4 + T ، كما هو موضح في المواد والأساليب، تم زيادة التعبير عن CCR5 بشكل كبير إلى مستويات عالية (+) وعالية جدًا (++) ، والتي تقابل في المتوسط ​​≈2-4 × 10 3 و3-5 × 10 4 جزيئات ، على التوالي ، كما هو مقدر باستخدام قياس التدفق الخلوي الكمي . في هذه الخلايا ، كانت مستويات CD4 متشابهة ، وكانت كمية CD4 coimmunoprecipitated مع مكافحة CCR5 mAb 5C7 مرتبطة بكفاءة اندماج الخلايا (الشكل 2).أ). ترتبط كمية CD4 المتناوب في الخلايا الضامة البشرية والخلايا الأحادية أيضًا بكفاءة اندماجها مع الخلايا التي تعبر عن HIV-1 JRFL Env (الشكل 2).ب) ولكن ليس مع التركيز السطحي لـ CD4. في الواقع ، عبّرت الخلايا الوحيدة عن مستويات مماثلة أو أعلى من CD4 ، لكن كمية CD4 المتساقطة المناعية كانت غير قابلة للاكتشاف أو بالكاد يمكن اكتشافها في اختبارنا (الشكل 2).ب). من المحتمل أن تكون الكمية الأكبر من CD4 المتساقط في الخلايا الضامة مرتبطة بالمستويات الأعلى من CCR5 مقارنة مع الخلايا الأحادية - في المتوسط ​​5-10 × 10 3 مقابل & lt2 × 10 3 جزيئات لكل خلية كما هو مقدر باستخدام قياس التدفق الخلوي الكمي. ومع ذلك ، كانت مستويات CCR5 في الضامة أقل مقارنة بخلايا ++ CD4 + T ، ولم نتمكن من اكتشاف CCR5 المناعي بواسطة النشاف الغربي (البيانات غير معروضة).

الترسيب المناعي للـ CD4 و CCR5 في الخلايا الأولية. (أ) تم استخدام خلايا CD4 T البشرية التي تعبر عن كميات عالية (+) وعالية جدًا (++) من CCR5 للترسيب المناعي باستخدام مضاد CCR5 mAb 5C7 (مركز) أو الاندماج مع خلايا هيلا التي تعبر عن HIV-1 JRFL Env (اليسار و حق). CD4 coimmunoprecipitated (مركز الأعلى) و CCR5 المناعي (وسط الأوسط) باستخدام النشاف الغربي كما في الشكل 1أ. يظهر النشاف الغربي لـ CD4 لمحلول الخلية الكاملة (قاع) كمقياس لمستوى CD4. كان متوسط ​​عدد المخلوقات لخلايا ++ 92 ± 10.5 ، بالنسبة للخلايا + كان 29 ± 7 ، وللتحكم كان خلايا هيلا 6 ± 3. كان متوسط ​​قطر الخلايا المخلوية من الخلايا ++ أكبر بحوالي 4 أضعاف من ذلك للخلايا +. (ب) الضامة البشرية (اليسار، حارة 1) وحيدات (اليسار، الممر 2) من أجل الترسيب المناعي CCR5. تم الكشف عن CD4 coimmunoprec ترسيب كما في أ. يظهر النشاف الغربي لـ CD4 لمحلول الخلية الكاملة (قاع) كمقياس لمستوى CD4. (حق) اندماج هذه الخلايا مع خلايا هيلا التي تعبر عن HIV-1 JRFL Env كما تم قياسه بواسطة مقايسة β-galactosidase. يمثل عنصر التحكم خلايا هيلا التي لا تعبر عن HIV-1 Env.

يكون تفاعل CD4 مع CCR5 أقوى من تفاعله مع CXCR4 ولا يزداد في وجود gp120.

لقد وجدنا سابقًا أن CD4 يمكن أن يرتبط ارتباطًا ضعيفًا بـ CXCR4 حتى في حالة عدم وجود gp120 (10). ومع ذلك ، تباينت النتائج في طريقة تعتمد على الحالة وسطر الخلية والمقايسة. لتقييم قوة ارتباط CD4 - CCR5 بالنسبة لتفاعل CD4 - CXCR4 ، تم استخدام خطوط خلوية 3T3 تعبر عن CD4 وإما CCR5 أو CXCR4 عند نفس تركيزات السطح تقريبًا. في الخلايا 3T3.CD4.CXCR4 ، ارتبط CD4 بشكل ضعيف بـ CXCR4 ، لكن الارتباط زاد بشكل كبير بإضافة X4 HIV-1 Env gp120 (IIIB) (الشكل 3)أ). في المقابل ، كانت كمية CD4 coimmunoprecipitated بواسطة مضاد CCR5 mAb 5C7 في 3T3.CD4.CCR5 خلايا عالية حتى في حالة عدم وجود gp120 ، وإضافة X4R5 (89.6) أو R5 (JRFL) HIV-1 Env gp120 لم تزيد بشكل كبير من الترسيب المناعي المناعي CD4 – CCR5 (الشكل 3 ب و ج). كانت كمية CD4 coimmunoprecipitated بواسطة مضادات CCR5 mAbs في غياب gp120 تقريبًا نفس كمية CD4 coimmunoprecipitated بواسطة anti-CXCR4 mAbs في وجود gp120. تشير هذه النتائج إلى أن ارتباط CD4 - CXCR4 أضعف من تفاعل CD4 - CCR5 وأن المجمعات مسبقة التشكيل بين CD4 و CCR5 قريبة من مستوى التشبع ، حيث لا يمكن أن تؤدي إضافة gp120 إلى زيادة تكوينها المعقد.

تأثير gp120 على الارتباط CCR5 – CD4 و CXCR4 – CD4. (أ) 3T3.CD4.CXCR4 تم تحضينها باستخدام مضاد CXCR4 mAb 4G10 في غياب (-) أو وجود (+) (5 ميكروغرام / مل) من HIV-1 IIIB gp120. تم الكشف عن CD4 و CXCR4 باستخدام النشاف الغربي مع إما المضاد متعدد الأضلاع المضاد لـ CD4 Ab T4–4 أو 4G10. (ب) تم تحضين خلايا 3T3.CD4.CCR5 باستخدام مضاد CCR5 mAb 5C7 في غياب أو وجود (5 ميكروغرام / مل) من HIV-1 89.6 gp120. تم الكشف عن CD4 و CCR5 باستخدام النشاف الغربي كما هو موضح في الشكل 1أ. (ج) نفس الشيء كما في ب ولكن تم استخدام gp120 من R5 HIV-1 JRFL بدلاً من المدار المزدوج 89.6.

من المحتمل أن يكون المجالان الأولان للـ CD4 والحلقة الثانية خارج الخلية لـ CCR5 متورطين في تكوين مجمع CD4-CCR5.

لتحديد المناطق المحتملة من CD4 المسؤولة عن التفاعل مع CCR5 ، استخدمنا خطًا خلويًا (A2.01.T4.T8) يعبر عن جزيء هجين CD4-CD8 يحتوي على المجالين الأولين من CD4 ، والذي تم عرضه سابقًا لدعمه. اندماج HIV-1 بوساطة Env (31) وإن كان بمعدل أقل من CD4 من النوع البري (16). تم تحفيز خلايا A2.01.T4.T8 للتعبير عن CCR5 بفيروس لقاح مأشوب يشفر الجين CCR5. هذه الخلايا ، التي تتعاون مع CCR5 والجزيء الهجين CD4-CD8 ، مدمجة مع الخلايا التي تعبر عن R5 HIV-1 Env Bal ، على الرغم من أنها أقل كفاءة إلى حد ما مقارنة بالخلايا التي تعبر عن النوع البري CD4 (البيانات غير معروضة). هذه النتائج مماثلة لملاحظاتنا التي تم الإبلاغ عنها سابقًا حول الاندماج بين خلايا وخلايا A2.01.T4.T8 التي تعبر عن X4 HIV-1 Env IIIB (16). تم ترسيب جزيئات CD4-CD8 بواسطة مضاد لـ CCR5 mAb من خلايا A2.01.T4.T8 التي تعبر عن CCR5 ولكن ليس من تلك المصابة بفيروس اللقاح البري (الشكل 4).أ). لم تكن المستويات السطحية لجزيئات CD4-CD8 في الخلايا المصابة بـ CCR5 وفيروسات اللقاح البري من النوع البري تختلف اختلافًا كبيرًا كما تم قياسها بواسطة قياس التدفق الخلوي (البيانات غير معروضة) والنشاف الغربي (الشكل 4)ب). لإثبات أن جزء CD8 من الجزيء الهجين CD4-CD8 لم يشارك في التفاعل مع CCR5 ، استخدمنا خلايا هيلا التي تعبر إما عن CD4 أو CD8. تم التعبير عن CCR5 مرة أخرى في هذه الخلايا بواسطة فيروس اللقاح المأشوب. في تلك الخلايا ، تم ترسيب CD4 فقط وليس CD8 باستخدام مضاد CCR5 mAb (5C7) ، مما يدل على أن جزء CD8 من جزيء CD4-CD8 الهجين من غير المحتمل أن يشارك في التفاعل مع CCR5 (البيانات غير معروضة). تشير هذه النتائج معًا إلى أن المجالين الأولين من CD4 مرتبطان بـ CCR5.

مشاركة المجالين الأولين من CD4 والحلقة الثانية خارج الخلية من CCR5 في رابطة CD4-CCR5. (أ) الترسيب المناعي المشترك للجزيئات الهجينة CD4-CD8 التي تحتوي على المجالين الأولين من CD4 بواسطة مضاد لـ CCR5 mAb. أصيبت خلايا A2.01.T4.T8 التي تعبر عن جزيء CD4-CD8 الهجين بفيروس اللقاح المؤتلف (vvCCR5–1107) (المسار 1) ، الذي يشفر الجين لـ CCR5 ، وفيروس اللقاح من النوع البري (WR). (الممر 2). تم استخدام مضاد CCR5 mAb 5C7 للترسيب المناعي CCR5 و T4–4 للكشف عن CD4 بواسطة النشاف الغربي. (ب) لم تكن كمية جزيئات CD4-CD8 في خلايا A2.01.T4.T8 المصابة بفيروس لقاح CCR5 (الممر 1) أو WR (الخط 2) مختلفة بشكل كبير كما يتضح من لطخة ويسترن بمضاد CD4 Ab (T4) - 4). (ج) يتم منع ترسيب CCR5 بواسطة مضاد CD4 mAb (OKT4) في وجود مضاد آخر لـ CD4 mAb (CG7). للمقارنة ، يُظهر الممر 1 CCR5 مناعًا بواسطة 5C7. تمثل الممرات 2 و 3 و 4 كمية CCR5 coimmunoprecipitated بمزيج من OKT4 (سائل الاستسقاء 3.5 ميكرولتر / مل) وزيادة تركيزات مضاد CD4 مللي أمبير CG7 (0 ، 5 ، و 10 ميكروغرام / مل ، على التوالي). (د) يتم منع الترسيب المناعي للـ CD4 بواسطة 5C7 في وجود مضاد آخر لـ CCR5 mAb (2D7) (29) موجه إلى الحلقة الثانية خارج الخلية. تم خلط كميات متساوية (3 ميكروغرام / مل) من 5C7 ، والتي لا تؤثر على دخول فيروس نقص المناعة البشرية ، بكميات متزايدة (0 و 3 و 6 ميكروغرام / مل) (الممرات 1 و 2 و 3 على التوالي) من HIV-1 -حجب mAb 2D7 ويستخدم للترسيب المناعي. العينة التي تم الحصول عليها من 9 × 10 6 3T3.CD4. تم تقسيم خلايا CCR5 إلى جزأين ، وتم استخدام الجزء الأصغر (1/6 من الإجمالي) لطخة غربية من CD4 بواسطة T4-4 ، والباقي تم استخدامه للغرب. لطخة CCR5 بواسطة CKR5 (C20). (ه) إن mAb 5C7 (الممر 2) الخاص بنهاية CCR5 يرسب CCR5 بكفاءة أكبر بكثير من mAb 2D7 الخاص بـ CCR5 ecl-2 (الممر 1). تم استخدام كميات متساوية (4 ميكروغرام / مل) من هذين mAbs للترسيب المناعي لـ CCR5 في خلايا 3T3.CD4.CCR5. تظهر العلامات الجزيئية على الجانب الأيمن (الممر M). (F و جي) التثبيط التفاضلي بواسطة اثنين من مضادات CCR5 mAbs و m182 و m183 (والتي لا ترسب CCR5 كما تم قياسها بواسطة مقايسة لدينا) من الترسيب المناعي CCR5 بواسطة مضاد CD4 mAb OKT4. تمثل الممرات 1 و 2 و 3 1 و 2 و 4 ميكروغرام / مل من م 182 و م 183 على التوالي. تم الكشف عن CCR5 بواسطة النشاف الغربي باستخدام CKR5 (C20).

لقد أكدنا أيضًا الملاحظات السابقة التي تفيد بأن جزءًا قابلًا للذوبان من CD4 يتكون من المجالين الأولين (sCD4D1D2) يتنافس مع البروتين الالتهابي البلاعم (MIP) 1-α لـ CCR5 (11). ومن المثير للاهتمام ، وجدنا أن عدوى HIV-1 التي تثبط mAb CG7 عند 60 نانومتر تقريبًا منعت تمامًا قدرة sCD4D1D2 على إزاحة chemokine MIP-1α (الجدول 1). نفس الجسم المضاد منع بشكل كبير الترسيب المناعي المشترك لـ CCR5 بواسطة مضاد CD4 mAb OKT4 (الشكل 4).ج). على عكس CG7 ، لم تكن المضاد الثاني لـ CD4 mAb (CG1) والتحكم mAb (CG10) فعالين في منع إزاحة MIP1-α بواسطة sCD4D1D2 (الجدول 1). على الرغم من أننا لا نعرف ما إذا كان sCD4D1D2 يمثل نموذجًا جيدًا لـ CD4 الأصلي فيما يتعلق بربط CCR5 ، فإن هذه النتائج تشير إلى أن مناطق معينة من CD4 ، من المحتمل أن تلك التي تتداخل مع حاتمة CG7 ، والتي من المحتمل أن تكون موجودة داخل مجال CD4 الأول (32) ، تشارك في الارتباط مع CCR5.

تثبيط الإزاحة CG7 لـ MIP-1α

لتوطين مناطق CCR5 التي تتفاعل مع CD4 ، استخدمنا خلائط من mAbs تتعرف على الطرف N والأولى (ecl-1) والثانية (ecl-2) الحلقات خارج الخلية من CCR5. أدت زيادة تركيز mAb مقابل ecl-2 لـ CCR5 (2D7) في خليط مع 5C7 إلى تقليل الكمية الإجمالية من CD4 المتسبب في المناعية المشتركة (الشكل 4).د) ، في حين تم زيادة طفيفة في كمية CCR5 المناعي (الشكل 4د) ، الذي ربما يكون ناتجًا عن الترسيب المناعي الإضافي والضعيف لـ CCR5 مع 2D7 (الشكل 4)ه). Another HIV-1-blocking mAb specific for the CCR5 ecl-2 (m182 R&D Systems) showed similar although weaker inhibitory effects (Fig. 4F) in contrast to the non-HIV-1-blocking anti-CCR5 mAb m183, which did not interfere with the CD4–CCR5 coimmunoprecipitation (Fig. 4جي). Other mAbs to the N terminus and mAbs to ecl-1 of CCR5 did not decrease the amount of coimmunoprecipitated CD4 when used in combination with 5C7 (data not shown). These results suggest that the ecl-2 of CCR5 is involved in the interaction with CD4. However, even at the highest concentration of mAb (2D7) used (50 μg/ml), the inhibition of the CD4–CCR5 coimmunoprecipitation was not complete, indicating that regions additional to the second extracellular loop of CCR5 are probably involved in the interaction with CD4.

Membrane-Associated CD4 Colocalizes with CCR5.

We further examined whether the CD4 and CCR5 molecules associate by using confocal laser scanning microscopic analysis of fluorescently labeled molecules. Colocalization of the two molecules was observed as demonstrated by the yellow (red-green colocalization) staining, suggesting formation of large multimolecular complexes between these two molecules (Fig. 5). A correlation map was prepared by using software developed in this laboratory. The regions of true overlap of green and red staining were selected from the noncolocalized staining and the background fluorescence and represented as white dots. A relatively high degree of colocalization is evident from this analysis (Fig. 5 أدنى). Less colocalization was observed between CD4 and CXCR4 (Fig. 5 اليسار) than with CCR5. It was previously shown that addition of X4 HIV-1 Env gp120 increases the colocalization of CD4 and CXCR4 (13). The extent of this increase appears to be comparable with the colocalization between CD4 and CCR5 in the absence of gp120 in a manner reminiscent of the immunoprecipitation data shown in Fig. 3. No significant colocalization was observed between CD45 and CCR5 or HLA class I and CCR5, suggesting specificity in the interaction between CD4 and CCR5 (data not shown). These results suggest that CCR5 (and to a lesser extent CXCR4) not only associates with native membrane-associated CD4 but that the two molecules form large multimolecular complexes possibly because of their dimeric structures (ref. 33, and data not shown).

Colocalization of CD4 and CXCR4 (اليسار) or CCR5 (حق). A CXCR4 (or CCR5)-myc tag-expressing HeLa cell, double stained for CD4 (green) and CXCR4 (or CCR5) (red) (العلوي). Colocalization of the two molecules is demonstrated by the yellow (red-green colocalization) staining, suggesting their clusterization. Correlation maps of these images (قاع) show the regions of true overlap of green and red staining selected from the noncolocalized staining and the background fluorescence, represented as white dots.

Inhibition of the CD4–CCR5 Interaction Correlates with the Inhibition of HIV-1 Env-Mediated Fusion.

It has been demonstrated that the anti-CCR5 mAb 2D7 inhibits entry of R5 and R5X4 HIV-1 into U87MG-CD4 cells expressing transfected CCR5 (24). To investigate the possibility of a relationship between inhibition of the CCR5–CD4 interaction and HIV-1 Env-mediated fusion, we used a recombinant vaccinia virus-based reporter gene assay for quantitation of cell–cell fusion (19). The mAb 2D7 inhibited fusion between 3T3.CD4.CCR5 cells and cells expressing R5 (Bal and JRFL) and R5X4 (89.6) HIV Envs. The inhibition was concentration-dependent, and cell–cell fusion was significantly decreased at concentrations in the range of 0.5–50 μg/ml, a concentration range similar to that observed for inhibition of the CD4–CCR5 interaction (data not shown). For several other anti-CCR5 mAbs, there was correlation (ص = 0.98, ص = 0.001) between inhibition of fusion and inhibition of the CD4–CCR5 interaction (Table 2). These results indicate that the CD4–CCR5 interaction may play a role in membrane fusion mediated by the HIV-1 Env. However, as was similar to the inhibition of the CD4–CCR5 interaction, even at the highest mAb concentration used (50 μg/ml), the inhibition of fusion was not complete. The lack of complete inhibition of fusion suggests that multiple interactions, possibly both CD4–CCR5 and gp120–CCR5, and multiple interaction sites involving other extracellular regions of CCR5, are involved in the initial steps of HIV-1 entry.

Correlation between inhibition of HIV-1 (Bal)-mediated fusion and CD4–CCR5 interactions by anti-CCR5 mAbs


المواد والأساليب

Cell-culture reagents

Cells were cultured in RPMI 1640 culture medium supplemented with 10% fetal calf serum (FCS Hyclone Laboratories, Logan, UT), 2 mM l -glutamine, 50 μg/mL gentamicin, 1 mM sodium pyruvate, and 1% nonessential amino acids (complete medium). DCs were stimulated with 1 μg/mL lipopolysaccharide (LPS الإشريكية القولونية 0111:B4 Sigma Chemical, Saint Louis, MO) CD154-transfected J558L cells at a ratio of 4:1 and 5 μM cytosine phosphate guanosine (CpG) oligonucleotide 2216 type A or CpG oligonucleotide 2006 type B (InvivoGen, San Diego, CA). CD4 + T cells were stimulated with anti–human CD3 mAb (clone TR66). Crystalline 1,25(OH)2د3 was a gift of Milan Uskokovic (BioXell, Nutley, NJ), dexamethasone was purchased from Sigma Chemical, and recombinant human (rh) IL-10 from PharMingen (San Diego, CA).

Cell purification

Peripheral-blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from buffy coats by Ficoll gradient (Pharmacia Biotec AB, Uppsala, Sweden). Peripheral-blood myeloid DCs (M-DCs) and plasmacytoid DCs (P-DCs) were magnetically sorted with blood dendritic-cell antigen-1 (BDCA-1) and BDCA-4 cell-isolation kits (Miltenyi Biotec, Bergish Gladblach, Germany), respectively, as described, 27 to a purity of 95% to 98% in both cases. DC subsets were analyzed either immediately or after culture in complete medium in the presence of 10 ng/mL recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (rhGM-CSF) or 20 ng/mL IL-3 (Pharmingen), respectively. To generate immature monocyte-derived DCs, monocytes, obtained from PBMCs by positive selection with CD14 beads (Miltenyi Biotec), were grown for 6 to 7 days in complete medium plus 10 ng/mL rhGM-CSF and 10 ng/mL IL-4 (PharMingen). CD4 + T cells were purified from PBMCs by negative selection with CD4 T-cell-isolation kit (Miltenyi Biotec), and CD4 + CD25 + T cells were subsequently positively selected with CD25 beads (Miltenyi Biotec).

Flow cytometric analysis

Flow cytometric analysis was performed as previously described, 7 in the presence of 100 μg/mL mouse IgG, using the mAbs anti-CD1c (BDCA-1) fluoroscein isothiocyanate (FITC) or phycoerythrin (PE), anti–BDCA-2 FITC or PE (Miltenyi Biotec), anti-CD1a FITC/PE, and anti-CD83 FITC/PE, all from Pharmingen, or with mAbs specific for ILT1 (clone 135.1), ILT2 (clone GHI75), ILT3 (clone ZM3.1), ILT4 (clone 42D.1), and ILT5 (clone 7H5). Cells were analyzed with an LSR flow cytometer (Becton Dickinson, Mountain View, CA) using CellQuest software (Becton Dickinson).

تنشيط الخلايا التائية

Peripheral-blood DC subsets were cultured for 5 days in complete medium and for an additional 7 days in the presence of CD4 + T cells with or without 20 μg/mL anti-ILT3 antibody. Intracellular cytokine production by CD4 T-cell lines was analyzed as described. 28 CD4 + T cells were cultured in 96-well flat-bottom plates with graded amounts of immature monocyte-derived DCs, which had been cultured for the last 48 hours with or without 10 nM 1,25(OH)2د3. The coculture of DCs and T cells was carried out in the presence or absence of anti-ILT3 mAb. After 5 days of culture, interferon-γ (IFN-γ) production was measured by 2-site enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Alternatively, CD4 + T cells were cultured in the presence of immature monocyte-derived DCs (ratio, 1:10) with or without anti-ILT3 and 7 to 10 days after primary stimulation, were restimulated under the same conditions. After 2 rounds of stimulation, CD4 + T cells were cultured in 96-well round-bottom plates precoated by overnight incubation with anti–human CD3 mAb. After 72 hours, cytokine production was quantified by 2-site ELISA. Paired mAbs specific for IFN-γ, IL-4, and IL-10 (Pharmingen), were used as described. 7 The detection limit for all cytokines was 15 pg/mL.

Suppression assay

The read-out system was composed of CD4 + CD25 – cells from donor A PBMCs labeled with Vybrant CFDA (carboxyfluorescein diacetate) succinimidyl ester (SE) cell tracer kit (Molecular Probes, Leiden, the Netherlands) and cultured in the presence of 1:10 LPS-matured monocyte-derived DCs from donor B. To evaluate the induction of regulatory T cells, graded amounts of CD4 + T cells from donor C were generated by 3 rounds of restimulation with allogeneic immature monocyte-derived DCs from donor D, which were cultured for the last 48 hours with or without 1,25(OH)2د3. The coculture was carried out with or without anti-ILT3 mAb (20 μg/mL). The suppression assay was performed in the presence of 1 μg/mL anti–human CD3 mAb. After 72 to 96 hours of culture, cells were recovered and analyzed with an LSR flow cytometer (Becton Dickinson) using CellQuest software.

Real-time quantitative RT-PCR

RNA was extracted using Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) according to the manufacturer's instruction, followed by a cleanup with the RNeasy Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Reverse transcription (RT) was performed, and real-time quantitative RT–polymerase chain reaction (PCR) of total cDNA using specific primers was carried out using an ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA) and Taqman chemistry. The primers used are commercially available from Applied Biosystems as assays on demand. Relative quantification of target cDNA was determined by arbitrarily setting the control value to 1 and changes in cDNA content of a sample were expressed as a multiple thereof. Differences in cDNA input were corrected by normalizing to β actin or GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) signals. To exclude amplification of genomic DNA, RNA samples were treated with DNAse (Sigma Chemical).

Immunohistology

Skin biopsies were obtained from untreated psoriatic plaques or from psoriatic lesions of 5 patients treated topically for 30 days with 0.005% calcipotriol cream (Psorcutan Schering, Milan, Italy) twice daily, or for 20 days with 0.1% mometasone furoate cream (Elocon Schering-Plough, Milan, Italy) twice daily, and snap-frozen in liquid nitrogen. Immunohistology was performed on 5-μm-thick cryostat sections fixed in acetone and dried overnight, as described. 29 Before incubation with specific mAbs or control isotype mouse Ig's, sections were hydrated for 10 minutes with 0.05 M Tris (tris(hydroxymethyl)aminomethane)–aminomethane saline buffer (TBS), pH 7.6, and incubated for 10 minutes with a mixture of normal human AB serum and normal rabbit serum (20% in TBS), to minimize nonspecific staining. Then, after washing in TBS, the sections were incubated for 30 minutes with specific mAbs, followed by polyclonal rabbit antimouse serum diluted 1/30 in TBS (Dako-Patt, Copenhagen, Denmark) and alkaline phosphatase anti–alkaline phosphatase complex diluted 1/50 in TBS (Dako-Patt). Finally, stainings were revealed using new fucsin (75 μL of a new fucsin–sodium-nitrite solution) in 10 mL of 0.05 M TBS, pH 8.7 5 mg naphthol AS-BI (7-bromo-3-hydroxy-2-naphtho- o -anisidine) sodium salt and 1 mM levamisole (Sigma Chemical). Sections were counterstained with Mayer haematoxylin, washed in water, and dried at room temperature before mounting. Slides were observed with a Leica light microscope (DMR Leica Microsystems, Milan, Italy) equipped with an HC Plans 10×/2.2 ocular and an N plan 20×/0.40 objective lens.

Immunofluorescent stainings were performed on 5-μm-thick frozen sections from skin biopsies of calcipotriol-treated psoriatic plaques. After fixing for 15 minutes in 4% paraformaldehyde and blocking with 0.1 M glycine for 10 minutes at room temperature, slides were incubated overnight at 4°C in blocking solution with affinity-purified rabbit anti–mouse CD11c (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA), washed 5 times with wash buffer (0.45 M NaCl, 0.24 M Na2HPO4, 0.24 M NaH2PO4, and 0.3% Triton X-100), and incubated for 60 minutes with polyclonal antirabbit FITC (Sigma Chemical). Alternatively, slides were incubated overnight at 4°C with biotinylated rat anti–mouse CD123 (Jackson Immunoresearch) followed by Rhodamine Red-X-streptavidin (Jackson Immunoresearch). Negative controls were performed by incubation with appropriate isotype-matched primary antibodies. The slides were then washed again and mounted with 90% glycerol/phosphate-buffered saline (PBS). Slides were analyzed with an MRC-1024 laser-scanning confocal microscope (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Images were acquired and processed with Laser Sharp 3.2 software (Bio-Rad).

1,25(OH)2د3 enhances ILT3 expression on DCs. Monocyte-derived human DCs were incubated for 48 hours with medium alone or containing 10 nM 1,25(OH)2د3 or 10 ng/mL IL-10, either when immature or during LPS-induced (100 ng/mL) maturation. Surface expression of the indicated ILT molecules was determined by cytofluorimetry. Histograms represented by broken lines show staining with an isotype control those with thick lines show staining with the indicated anti-ILT mAbs. Geometric mean fluorescence intensity (MFI) values are shown in the top right corner. A representative experiment out of 6 performed is shown.

1,25(OH)2د3 enhances ILT3 expression on DCs. Monocyte-derived human DCs were incubated for 48 hours with medium alone or containing 10 nM 1,25(OH)2د3 or 10 ng/mL IL-10, either when immature or during LPS-induced (100 ng/mL) maturation. Surface expression of the indicated ILT molecules was determined by cytofluorimetry. Histograms represented by broken lines show staining with an isotype control those with thick lines show staining with the indicated anti-ILT mAbs. Geometric mean fluorescence intensity (MFI) values are shown in the top right corner. A representative experiment out of 6 performed is shown.


Authorship

Contribution: J.M.M. designed and performed experiments, analyzed results, made figures, and wrote the manuscript B.R.L. designed experiments, participated in discussion of the results, and reviewed the paper J.E.S.-C. designed experiments and reviewed the paper A.J.C. performed experiments and reviewed the paper V.A.Y. performed experiments L.C.N., J.M., and D.F.N. participated in discussion of the results and reviewed the paper and L.L.L. participated in discussion of the results and edited the paper.

Conflict-of-interest disclosure: The authors declare no competing financial interests.


مناقشة

A novel anti-TLR5 monoclonal antibody, ACT5, revealed the cell surface expression of TLR5 on immune cells. The recruitment of TLR5 to the cell surface was completely dependent on TLR-specific chaperone PRAT4A. In Ba/F3 cells, PRAT4A physically associated with TLR5. PRAT4A knock-down resulted in marked suppression of NF-κB activation in response to flagellin. In addition, in a macrophage cell line J774, PRAT4A silencing abolished cell surface expression of endogenous TLR5 and flagellin-dependent cytokine production. These results suggest that PRAT4A-dependent cell surface expression of TLR5 is required for flagellin-induced cytokine production. Previous studies report that PRAT4A associates with a general chaperone gp96 and restricts gp96 client to TLRs ( 21). Taken together with the requirement of gp96 for flagellin response ( 20), the present results demonstrate that TLR5 is another client of the chaperone complex PRAT4A–gp96.

It is well established that TLR5 activates MyD88-dependent signaling pathways to induce cytokine production and DC maturation ( 4, 12). While cell surface TLR2/4-signaling requires a ‘sorting adaptor’, TIRAP, to recruit MyD88 to the cell surface TLR ( 17), a previous report demonstrated that TLR5 does not need TIRAP for cytokine production ( 16). Here, we confirm that TLR5 is another cell surface TLR, suggesting that MyD88 pathway from cell surface does not necessarily require TIRAP. TIRAP-independent MyD88 signaling from cell surface TLR5 may be a reason why flagellin, in contrast to LPS, is poor inflammatory and less relation to severe organ failure ( 37).

ACT5 revealed highly restricted expression of TLR5 on في الجسم الحي immune cells. Cell surface TLR5 was mainly detected on neutrophils, Ly6C hi classical monocytes, splenic CD8 − CD4 + /CD8 − CD4 − cDCs, splenic pDCs and CD11b hi CD11c hi lamina propria DCs. In acute inflammatory lesion, neutrophils and monocytes are swiftly recruited from the circulation and have a role in primary defense against microbial organisms. Neutrophils, Ly6C hi and Ly6C low monocytes infiltrated into the peritoneal cavity 12h after thioglycollate injection. Cell surface expression of TLR5 was detected on neutrophils and Ly6C hi classical monocytes, but not on Ly6C low monocytes. At 72h after thioglycollate injection, almost all exudate cells were TLR5 − Ly6C low monocytes. These findings indicate that cell surface TLR5 is one of the hallmarks of innate immune cells that are recruited early in inflammation.

All TLRs except TLR3 are expressed in human neutrophils and induce cytokine release, superoxide generation and CD62L shedding ( 38). However, neutrophils from mouse BM or an inflammatory lesion did not produce cytokines in response to flagellin despite the expression of TLR5 on the cell surface. Given a role for TLR5 in phagocytosis and ROS production ( 39), cell surface TLR5 in neutrophils may principally contribute to direct pathogen clearance rather than to cytokine production.

Based on cell surface markers, mice monocytes are subcategorized into two major subsets ( 40). The Ly6C hi CCR2 hi CX3CR1 low subset is called classical monocytes, which are recruited to a site of tissue injury or infection via CCR2-signaling and differentiate into macrophages or DCs. The other Ly6C low CCR2 low CX3CR1 hi subset, nonclassical monocytes, has a remarkable patrolling activity and gives rise to resident macrophages after entering tissues. This study showed that TLR5 is expressed on Ly6C hi , but not on Ly6C low monocytes in the BM, circulation and inflammatory lesions. Flagellin is able to induce IL-6 and MCP-1 production via cell surface TLR5 from Ly6C hi monocytes, suggesting that classical monocytes are one of the main sources of flagellin-induced cytokines in acute inflammation. Considering that Ly6C hi classical monocytes contributes to the gut immune system and have a role in protection against an enteric bacterium ( 41), flagellin-induced cytokines from classical monocytes have an important role in augmenting acute inflammation at mucosa.

In addition to neutrophils and classical monocytes, very restricted expression of cell surface TLR5 was also found in DCs. First, cell surface TLR5 was detected on CD8α − cDCs, but not on CD8α + cDCs, in the spleen. CD8α − cDCs are more potent in activating CD4 + helper T cells than CD8α + cDCs, and associate with induction of Th2-type response ( 42). Considering that flagellin has been shown to have the potent adjuvant activity with a tendency to induce Th2 response ( 12, 28), CD8α – cDCs, but not CD8α + cDCs, are likely to be required for the adjuvant activity of flagellin. Unexpectedly, splenic plasmacytoid DCs (pDCs), which is specialized to secrete large amounts of type I interferon, also express cell surface TLR5. As one report suggests that flagellin can induce IFN-β from BM-macrophages ( 43), flagellin may induce or augment the production of type I interferon in pDCs.

Against oral infection with a flagellated pathogen, TLR5 has a role in mounting adaptive immune responses ( 10, 36). CD11b hi CD11c hi DCs in the lamina propria express TLR5 mRNA and have a key role in activating flagellin-dependent adaptive immune responses. Consistent with these previous reports, our results showed that only CD11b hi CD11c hi DCs expressed TLR5 on the cell surface. In contrast to these في الجسم الحي DCs, TLR5 is barely detectable on BM-DCs. Similarly, TLR5 is detectable on Ly6C hi monocytes في الجسم الحي but not on BM-macrophages. These results reveal that BM-derived DCs/macrophages are distinct from في الجسم الحي DCs/macrophages. Unlike TLR2 and TLR4/MD-2, في المختبر maturation induced by GM-CSF or M-CSF does not accompany cell surface expression of TLR5, implying that a signal is missing in في المختبر maturation that induces cell surface TLR5.

In summary, our results show that TLR5 is expressed on the cell surface of neutrophils, classical monocytes and specific subpopulations of DCs, in a PRAT4A-dependent manner. The present result, however, does not necessarily exclude the possibility that intracellular TLR5 is functional. Although BM-DCs did not express cell surface TLR5, BM-DCs could respond to flagellin and induce DC maturation ( 12, 35). In the case of TLR4/MD-2, intracellular TLR4/MD-2 in BM-macrophages is responsible for upregulation of costimulatory molecules and certain chemokine production ( 22). Future studies need to focus on TLR5 inside the cells.

Japanese-Korean Cooperative Programme on Basic Medical Research Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology for Program of Japan Initiative for Global Research Network on Infectious Diseases Grant-in-Aid for Scientific Research (B), grant reference 21117001 Grant-in-Aid for Exploratory Research Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas, grant reference 23790526.

Classical monocytes, but not neutrophils, are the predominant source of flagellin-induced cytokines. (A) Gating strategies to sort neutrophils and classical monocytes from BM cells by Gr-1 and Ly6G staining. Red dots mean total CD11b + BM cells. Overlaid blue and green dots on red dots mean Ly6C int Ly6G + neutrophils and Ly6C hi Ly6G - classical monocytes, respectively (left dot plots). Since neutrophils and classical monocytes matched to Gr-1 hi Ly6G + and Gr-1 hi Ly6G – population (right dot plots), respectively, these populations were sorted and used for cytokine assay. (B and C) Sorted classical monocytes (B) and neutrophils (C) from BM cells were stimulated by 100ng ml –1 flagellin and cytokine production was analyzed by ELISA. Asterisks mean no signals were detected.

Classical monocytes, but not neutrophils, are the predominant source of flagellin-induced cytokines. (A) Gating strategies to sort neutrophils and classical monocytes from BM cells by Gr-1 and Ly6G staining. Red dots mean total CD11b + BM cells. Overlaid blue and green dots on red dots mean Ly6C int Ly6G + neutrophils and Ly6C hi Ly6G - classical monocytes, respectively (left dot plots). Since neutrophils and classical monocytes matched to Gr-1 hi Ly6G + and Gr-1 hi Ly6G – population (right dot plots), respectively, these populations were sorted and used for cytokine assay. (B and C) Sorted classical monocytes (B) and neutrophils (C) from BM cells were stimulated by 100ng ml –1 flagellin and cytokine production was analyzed by ELISA. Asterisks mean no signals were detected.


شاهد الفيديو: الأحياء -أ- حازم النسور المستقبلات المعستجيبة للمؤثرات الكيميائية (كانون الثاني 2023).