معلومة

عد المستعمرات بالطريقة الصحيحة

عد المستعمرات بالطريقة الصحيحة


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أستخدم Rose bengal agar cloramfenicol للبحث عن الخميرة والقوالب لإدراجها في طبق بتري. ما هي الطريقة الصحيحة للحساب؟ لست متأكدًا مما إذا كنت أحسب كل شيء أم أكبر واحد فقط؟


نعم ، عليك أن تحسب كل فرد مستعمرة.

ومع ذلك ، من الناحية العملية ، فإن السؤال هو أكثر من ذلك ، ما الذي يعتبر لوحة معدودة ومدى أهميتها. ستجد في العديد من المختبرات أن الفنيين والعلماء لن يهتموا بإحصاء كل مستعمرة على اللوحة إذا كان لديك عدد كبير من المستعمرات. سيقولون على سبيل المثال ببساطة (مع قليل من الخبرة) ، عدد هذه اللوحة أكبر من 300 (اكتب>300).

ومع ذلك ، ستظل بالطبع بحاجة إلى الإحصاء ، لذلك من الشائع القيام بأحد الإجراءات التالية:

  • قسّم اللوحة إلى قطاعات متساوية الحجم (يمكنك رسم خطوط في الجزء السفلي من اللوحة) ، واحسب كل المستعمرات في قطاع واحد ، ثم اضرب هذا الرقم في عدد القطاعات التي قسمت فيها. لذلك ، على سبيل المثال ، قمت بتقسيم لوحة إلى 4 قطاعات (أرباع) من خلال رسم تقاطع كبير عليها ، يمكنك عد المستعمرات في ربع واحد ثم الضرب في 4. من الواضح أن هذا استقراء.
  • الخيار الآخر ، هو تخفيف عينتك حتى تحصل عليها في نطاق معدود. لذا يمكنك إجراء تخفيف متسلسل ، ووضعه على أطباق ، وبعد ذلك بمجرد نمو الكائنات الحية ، يمكنك حساب اللوحة بأكملها ثم الضرب في عامل التخفيف. لذلك ، على سبيل المثال ، لديك عينتك في مرق التخصيب وقم بعمل تخفيفين 1/10 (1/100) ثم صفيحة 0.1 مل (تعد 1/10) ، لديك عامل تخفيف نهائي قدره 1000. لذلك ستحتاج إلى مضاعفة العدد الذي تحصل عليه على هذه اللوحة التخيلية في 1000.

من الواضح أن لديك في عينتك مجموعة متنوعة من الكائنات الحية المختلفة. ربما يُنصح بالتحقق من الأساليب الرسمية لمعرفة ما يوصون به. فيما يلي مقتطف من طريقة BAM الرسمية للخمائر والعفن والسموم الفطرية:

عد اللوحات بعد 5 أيام من الحضانة. إذا لم يكن هناك نمو في 5 أيام ، أعد الحضانة لمدة 48 ساعة أخرى. لا تحسب المستعمرات قبل نهاية فترة الحضانة لأن التعامل مع الصفائح يمكن أن يؤدي إلى نمو ثانوي من الجراثيم المبعثرة ، مما يجعل التعداد النهائي غير صالح. عد اللوحات التي تحتوي على 10-150 مستعمرة. في حالة وجود الخمائر بشكل أساسي ، عادة ما تكون الصفائح التي تحتوي على 150 مستعمرة قابلة للعد. ومع ذلك ، في حالة وجود كميات كبيرة من العفن ، اعتمادًا على نوع القالب ، فقد يتعين خفض الحد الأعلى القابل للعد وفقًا لتقدير المحلل. نتائج التقرير في وحدات تشكيل مستعمرة (CFU) / g أو CFU / ml بناءً على متوسط ​​عدد المجموعة الثلاثية. تقريب العد إلى رقمين معنويين. إذا كان الرقم الثالث 6 أو أعلى ، فقربه للرقم أعلاه (على سبيل المثال ، 456 = 460) ؛ إذا كان الرقم 4 أو أقل ، فقم بالتقريب للرقم أدناه (على سبيل المثال ، 454 = 450). إذا كان الرقم الثالث 5 ، فقربه للرقم أدناه إذا كان أول رقمين عددًا زوجيًا (على سبيل المثال ، 445 = 440) ؛ التقريب للرقم أعلاه إذا كان أول رقمين عددًا فرديًا (على سبيل المثال ، 455 = 460). عندما لا تحتوي الألواح من جميع التخفيفات على مستعمرات ، فقم بالإبلاغ عن عدد الفطريات والخميرة (MYC) بأقل من 1 مرة من أقل التخفيف المستخدم. اعزل المستعمرات الفردية على PDA أو MA ، إذا كان من الضروري إجراء مزيد من التحليل وتحديد الأنواع.

يرجى الاطلاع على الرابط هنا.


العلاج بالخلايا الجذعية عند الولدان - حان الوقت (تقريبًا)

الخلايا الجذعية الأخرى لخلل التنسج القصبي الرئوي

الخلايا البطانية الأولية والخلايا المكونة للمستعمرة البطانية

كل من ECFCs و ECFC-CdM قد خففا بشكل فعال من إصابة الرئة بفرط التأكسج وارتفاع ضغط الدم الرئوي في الحيوانات التي تعاني من نقص المناعة. 15 في نموذج البليوميسين لـ BPD ، لم يكن لـ ECFC-CdM أي تأثير على بنية الرئة ولكنه منع ارتفاع ضغط الدم الرئوي. 57 قد يحد هذا من الإمكانات العلاجية لـ ECFC-CdM. تحسن ECFCs كلا من الاستقطاب وارتفاع ضغط الدم الرئوي. ومن المثير للاهتمام ، أن ECFCs قبل الأوان ولكن ليس لفترات طويلة فقدت تأثيرها العلاجي بعد التعرض لفرط التأكسج ، مما يشير إلى أن منتجات الخلايا قد تتأثر بشكل كبير بالتغيرات في ظروف الاستنبات.

الخلايا الطلائية السلى البشرية

في BPD الناجم عن البليوميسين ، قلل إعطاء الوريد من hAECs التهاب الرئة والتليف. 58 في المختبر ، يمكن تفريق hAECs إلى خلايا شبيهة بالنوع الثاني من الخلايا السنخية المنتجة للتوتر السطحي. بعد الإعطاء في الجسم الحي ، هاجرت hAECs إلى الرئة التالفة ويبدو أنها تتمايز إلى خلايا من النوع الثاني السنخي. 58 لوحظ تمايز مماثل في النوع الأول والخلايا الرئوية من النوع الثاني بعد إعطاء hAEC في الأغنام الجنينية مع إصابة الرئة التي يسببها جهاز التنفس الصناعي. 59 شوهدت التأثيرات المسببة لتولد الأوعية على المدى الطويل ولكن ليس hAECs قبل الأوان في نموذج البليوميسين. 28 كشفت المقارنة المباشرة بين الخلايا الجذعية السرطانية المتناهية الصغر والمشتق من الغشاء الأمنيوسي بعد إصابة الرئة التي يسببها البليوميسين عن تأثير متفوق للخلايا الجذعية الوسيطة على تليف الرئة ولكن تأثيرات مماثلة مضادة للالتهابات لكل من العلاجات الخلوية. 60

هناك حاجة إلى مزيد من البيانات حول الجرعات المثلى ، والتوقيت ، وطريق الإدارة قبل أن يمكن مقارنة hAECs و MSCs بشكل أكثر حاسمًا.


فرجينيا

كانت أول مستوطنة إنجليزية في العالم الجديد في ولاية فرجينيا ، حيث تم إجراء أول مستوطنة دائمة في عام 1607 ، بتوجيه من تجار لندن ، الذين أرسلوا مستعمرة من خمس سفن للاستقرار في جزيرة رونوك. أجبرتهم العواصف على دخول خليج تشيسابيك. صعدوا نهر بوهاتان ، ونزلوا ، وشكلوا مستعمرة جيمستاون. سمي النهر بنهر جيمس لتكريم ملكهم. بعد صعوبات مختلفة ، ازدهرت المستوطنة ، وفي عام 1619 ، عقدت أول جمعية تمثيلية في فيرجينيا في جيمستاون. شكلت هذه الجمعية الأساس لما سيصبح ولاية فرجينيا.


نظرة عامة على إجراءات واستخدامات تقنيات التعقيم

تضمن البرنامج المختبري دراسة تقنيات التعقيم. تعتبر تقنيات التعقيم هذه ضرورية في المختبر لأنها تساعد في الحفاظ على معقم المختبر ، كما أن العقم أمر حيوي في المختبر لأنه يسمح للعالم بدراسة وزيادة البكتيريا التي يحتاجون إليها بدقة. العقم مهم أيضًا في تجنب البكتيريا غير المطلوبة من التكاثر والنمو على وسط التقدم المعقم أو لوحة الأجار.

كان هناك عدد قليل من التقنيات المعقمة التي كان علينا اتباعها أثناء التعامل مع البكتيريا ووسط التمدد المعقم. لتجنب تلوث وسيط التطوير بالبكتيريا الهوائية وغيرها من المواد العائمة الحرة ، تم إنشاء موقد بنسن بالقرب من مكان وجود وسط التقدم وعينات البكتيريا. خلق موقد بنسن تيارًا حراريًا قضى ودمر معظم البكتيريا التي تحملها البيئة والمواد العائمة الأخرى بالقرب من مكان العمل. هذا قلل من فرصة تلوث وسط النمو وأمثلة البكتيريا.

تم إعداد موقد بنسن أيضًا للسماح باستخدام استراتيجية أخرى تسمى المشتعلة. تتضمن هذه التقنية نقل أي شيء لامس أي بكتيريا أو أي شيء يتلامس مباشرة مع عينة البكتيريا من خلال لهب الموقد. الأشياء الملتهبة هي معدات معملية مثل الحلقات البكتريولوجية ، وماصة الزجاج والحاوية أو أعناق القارورة. يجب أن تصل درجة حرارة الأشياء إلى أكثر من 100 درجة مئوية حتى يتم تعقيمها.

استراتيجية أخرى معقمة تسمى التلاعب. في هذه التقنية ، يتم استخدام أصغر إصبع لإزالة غطاء الزجاجة الذي يحتوي على البكتيريا ، مما يسمح لجميع الأصابع الأخرى بالحصول على أي شيء آخر مطلوب. تضمن هذه التقنية أيضًا عدم وضع غطاء الحاوية أسفل المنضدة حيث من المحتمل أن تلوث وبالتالي تلوث ثقافة البكتيريا في الحاوية.

النهج السابق ولكنه الأكثر أهمية هو من يمنع البكتريا من تلويث المختبر والمعدات. يحمل كل شخص كمية كبيرة من البكتيريا داخل وخارج الجسم. عندما نستخدم البكتيريا في المختبر ، كان علينا ارتداء طلاء المختبر ، وهذا يمنع البكتيريا من ملابسنا وأنظمتنا من الانتشار بعيدًا في المختبر. كما يجب أن نكون حذرين من أن الناس لا يسعلون أو يعطسون في وسط التقدم ، لأن هذا من شأنه أن يؤدي إلى تقدم البكتيريا التي يطلقها جسمك. أيضًا بعد إجراء التجربة ، كان من الضروري غسل اليدين بالصابون المضاد للبكتيريا للمساعدة في منع انتقال الملوثات. إذا لم يتم غسل اليدين بشكل صحيح وإذا بقيت البكتيريا على اليدين فقد تتكاثر بمعدل أسي ويمكن أن تسبب عدوى بكتيرية.

كان الجزء الأول من التجربة هو ملاحظة الانحرافات المختلفة وكمية البكتيريا على اليدين قبل الشطف وبعد الغسل. يتم ذلك عن طريق وضع اليدين في طبق بتري مع أجار المغذيات. أجار المغذيات هو وسيلة تقدم ميكروبيولوجية شائعة الاستخدام في الزراعة المملة للبكتيريا. تم فصل الطبق إلى قسمين وتم تمييزه بجزء واحد من الطبق به آثار من الأيدي المغسولة مسبقًا والجزء الآخر بعد الشطف. تم وضع الطبق بعد ذلك في الحضانة عند 37 دبلومة حيث أنه درجات الحرارة المثلى حيث تمتلك البكتيريا القدرة على التكاثر بمعدل أسي اعتمادًا على بعض العوامل ، على سبيل المثال كمية الطعام المتاح أو المساحة.

يحتوي الجزء التالي من التجربة على عمل لوحة خطية. تم إجراء ذلك باستخدام بكتيريا Staphylococcus aureus. تم استخدام اختبار صغير للبكتيريا SA ووضعها على حلقة معقمة وخط وسط أجار. يظهر مثال على طبق الخط الذي تم تنفيذه في الرسم التخطيطي أدناه:

رسم تخطيطي يوضح طريقة الطلاء المتقطع

1. أشعل الحلقة والخط وشق حلقة من المرق كما في A في الرسم التخطيطي.

2. إعادة تسمية الحلقة وتبريدها.

3. خط كما في B لنشر البكتيريا الأصلية على المزيد من أجار.

4. أعد تسمية الحلقة وتبريدها.

5. خط كما في C و D E و F باتباع نفس الإجراء بعد كل خط كما هو مقتبس أعلاه.

6. ضع بطاقة على الطبق واحتضنه مقلوبًا.

كان الجزء التالي من الفترة الأولى هو إجراء التخفيف المتسلسل. يمكّنك هذا من البحث عن عدد خلايا الجلد في مزرعة بكتيرية. نظرًا لأن إحصائيات الخلايا البكتيرية عادةً ما تكون عالية في الاختبار الأولي ، فإن إجراء هذا الاختبار بطريقة غير مخففة سيؤدي فقط إلى إنشاء الفناء الخلفي للبكتيريا (مسحة للعديد من مستعمرات البكتيريا الفردية التي تنمو بجانب أو فوق كل منها آخر).

يجب تقليل إحصائيات الخلايا البكتيرية ، والذي يتم إجراؤه عن طريق تخفيف كمية البكتيريا في الاختبار باستمرار. يتم خلط كمية صغيرة من عينة البكتيريا بمحلول مخفف (مثل المرق المعقم) ، ثم يتم عمل التخفيفات المتتالية. ثم يتم مضاعفة كمية صغيرة من كل عينة من عينات البكتيريا المخففة على لوحة أجار. يتم حساب كميات مستعمرات البكتيريا التي تتوسع في كل طبق. من خلال العمل بشكل عكسي باستخدام الضرب باستخدام "عامل التخفيف" (عدد المرات التي قمت فيها بتخفيف اختبار البكتيريا بمحلول مخفف) ، تمكنا من تخصيص عدد البكتيريا في العينة الأولية. بعد أن تم إنشاء التخفيفات ، تم نقل 100 لتر من كل تخفيف إلى صفيحة أجار باستخدام ماصة ، ثم تم تمريرها عبر لوحة أجار باستخدام مفرشة. ثم تم وضع هذه الصفائح الستة في الحضانة عند 37 درجة مئوية كل يوم وليلة. عند توزيع الفناء الخلفي للبكتيريا ، تم عمل الصفيحة بمستوى التخفيف 10-5 أولاً ثم البقية 10-4 ، 10-3 ، 10-2. يرجع السبب في ذلك إلى أن الموزع الذي تم استخدامه كان من البلاستيك ، لذلك تم نقل البكتيريا ذات التركيز المنخفض أولاً حيث لا يمكن حرق الموزعة البلاستيكية الشفافة لتدمير البكتيريا. إذا لم يتم استخدام استراتيجية التعقيم هذه واستخدمت أفضل تركيز للبكتيريا أولاً ، فربما يعني ذلك أن الوجبات البكتيرية قد تكون ملوثة ولن يتم اكتساب مستعمرة واحدة من البكتيريا. إذا تم استخدام آلة رش الكوب ، فقد يتم ذلك بترتيب تصاعدي حيث يمكن حرق الزجاج عن طريق وضع الإيثانول على السطح لقتل البكتيريا الموجودة على الموزعة الزجاجية قبل القيام بجزء آخر من التخفيف التسلسلي.

كانت المنطقة الأخيرة من الفصول المعملية الأولى هي تحضير مسحات البكتيريا لتلطيخ الجرام. تلطيخ الجرام هو أسلوب شائع يستخدم للتمييز بين مجموعتين كبيرتين من البكتيريا بناءً على مكونات بنية جدار الخلية المختلفة. عملية صبغ الجرام تميز بين المجموعات الموجبة للجرام والمجموعات السالبة الجرام عن طريق تلوين خلايا الجلد هذه باللون الوردي أو الأرجواني. تلطخ البكتيريا موجبة الجرام اللون الأرجواني بسبب وجود أي طبقة سميكة من الببتيدوغليكان في أسطح جدرانها الخلوية ، والتي تحافظ على اللون البنفسجي البلوري الذي تلطخ به هذه الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، تلطخ البكتيريا سالبة الجرام اللون الوردي ، والذي يُعزى إلى بنية جدار ببتيدوغليكان أصغر حجماً ، والتي لن تحافظ على اللون البنفسجي البلوري من خلال عملية إزالة اللون.

يتضمن تلطيخ الجرام ثلاث تقنيات: التلوين بصبغة قابلة للذوبان في الماء تسمى البنفسجي الكريستالي ، وإزالة اللون ، والتلوين المضاد ، عادةً باستخدام السافانين. بسبب الفروق في عرض غطاء الببتيدوغليكان في غشاء الخلية بين البكتيريا موجبة الجرام والبكتيريا سالبة الجرام ، تحافظ البكتيريا موجبة الجرام (مع مستوى ببتيدوجليكان أكثر سمكًا) على صبغة البنفسج البلوري من خلال عملية إزالة اللون ، بينما تفقد البكتيريا سالبة الجرام صبغة البنفسج الكريستالية وبدلاً من ذلك يتم تلطيخها بواسطة safranin في عملية التلوين النهائية. تتضمن العملية ثلاث خطوات:

1. الخلايا ملطخة بصبغة الكريستال البنفسجي. بعد ذلك ، يضاف محلول غرام اليود (اليود ويوديد البوتاسيوم) لتكوين مادة عضوية بين البنفسج الكريستالي واليود. هذا المركب هو جزيء أكبر من صبغة الكريستال البنفسجي الأصلية واليود وغير قابل للذوبان في الماء.

2. يتم وضع مزيل اللون مثل المشروبات الكحولية الإيثيلية أو الأسيتون في الاختبار ، مما يؤدي إلى تجفيف طلاء الببتيدوغليكان وتقليصه وشده. لا يستطيع الكريستال البنفسجي واليود العضوي الكبير أن يتخلل هذا الغطاء الببتيدوجليكان المشدود ، وبالتالي يتم التقاطه في الخلية في البكتيريا الموجبة للجرام. على العكس من ذلك ، يتحلل الغشاء الخارجي للبكتيريا سالبة الجرام وتكافح طبقة الببتيدوغليكان الرقيقة من الخلايا السالبة الجرام من أجل الحفاظ على مركب اليود البنفسجي البلوري ويفقد اللون.

3. تتم إضافة بقعة مضادة ، مثل الزعفران العادي القابل للذوبان في الماء بشكل ضعيف ، إلى الاختبار ، مما يؤدي إلى تلطيخها باللون الأخضر. بما أن السافرانين أخف من البنفسجي الكريستالي ، فإنه لا يعطل اللون القرمزي في خلايا الجلد الموجبة للجرام. ومع ذلك ، فإن الخلايا السالبة الجرام منزوعة اللون ملطخة باللون الأحمر.

(يتم عرض الطرق الوصفية في الكتيب لجميع التجارب.)


طريقة أبسط لقياس الالتهابات الفيروسية في النحل

قد يكون من الصعب تقييم مدى خطورة الإصابة بالفيروس في مستعمرة النحل. أداة جديدة من قسم الزراعة الإيكولوجية تجعل الأمر أسهل. الائتمان: Colourbox

طور علماء من جامعة آرهوس نموذجًا يسهل على مربي النحل تقييم خطورة العدوى الفيروسية في نحل العسل.

هل تحتاج إلى دق ناقوس الخطر إذا كان هناك 100000 جزيء فيروسي في خلايا النحل - أم أنه لا يوجد ما يدعو للقلق حتى يصبح هناك 10 ملايين جزيء؟ قد يكون من الصعب على معظم الناس التوفيق بين هذه الأعداد الكبيرة ، لكن العلماء من جامعة آرهوس الآن قد سهّلوا على مربي النحل استنتاج مدى خطورة ضغط العدوى الفيروسية في مستعمرات النحل.

على أساس الملاحظات في مستعمرات النحل الدنماركية ، صنف العلماء حالات العدوى الفيروسية في أربع فئات. هذا يعني أنه بدلاً من استخدام مقياس منزلق للأرقام مع وجود عدد كبير من الأصفار خلفه ، يمكنك فقط الرجوع إلى الفئات الأربع. هذا يجعل الأمر أسهل بالنسبة لمربي النحل ، عندما يحتاجون ، على سبيل المثال ، إلى اتخاذ قرار بشأن اتخاذ إجراء وقائي أم لا ، وما إذا كان يمكن استخدام مستعمرة النحل لمزيد من التكاثر. إنها أيضًا أداة مهمة للعلماء.

يقول كبير العلماء بير Kryger من قسم الزراعة الإيكولوجية في جامعة آرهوس.

نحل العسل لاعب مهم في سلسلتنا الغذائية. إنها تساعد على ضمان تلقيح المحاصيل حتى تتحول الأزهار إلى ثمار. في السنوات الأخيرة ، واجه نحل العسل مشاكل على نطاق عالمي: انهارت مستعمرات النحل لأسباب غير معروفة. منذ عام 2006 ، يتم فقدان حوالي 30 بالمائة من مستعمرات نحل العسل كل عام في الولايات المتحدة الأمريكية. في حين أن الوضع في الدنمارك ليس خطيرًا تمامًا ، إلا أنه لا يزال هناك مشكلة تتمثل في انهيار المستعمرات دون معرفة السبب الدقيق.

يمكن إلقاء اللوم على عدة عوامل ، إما بمفردها أو في انسجام تام ، بما في ذلك الفيروسات والطفيليات وأشكال مختلفة من الإجهاد. تم بنجاح تربية نحل العسل المقاوم لعث الفاروا والطفيلي المجهري الشبيه بالإسفنج Nosema apis. ربما يمكن فعل الشيء نفسه في المعركة ضد الفيروسات.

أظهرت الدراسات السابقة أن الفيروس منتشر في العديد من مستعمرات النحل وأن عدد قليل جدًا من طوائف نحل العسل خالية تمامًا من الفيروسات. ينطبق هذا أيضًا على الطوائف التي تبدو سليمة ، لذلك يجب أن يكون هناك نوع من التسامح الذي يعني أن النحل لا يمرض حتى عندما يصاب.

تشير هذه الحقيقة إلى أنه قد يكون من الممكن أن تنمو مستعمرات مقاومة. يتطلب التكاثر الانتقائي ، مع ذلك ، أنه يمكنك حساب عدد جزيئات الفيروس بحيث يمكن اختيار المستعمرات الصحيحة لإنتاج الجيل التالي.

مستعمرات نحل العسل تحت المجهر

للحصول على فكرة عن مستوى العدوى الحالي في الدنمارك ، فحص العلماء مستعمرات نحل العسل الدنماركي الصحية لسبعة فيروسات مختلفة. كما قاموا بفحص طوائف من المناحل ذات معدل مرتفع من سوس الفاروا أو معدل وفيات مرتفع في الشتاء.

يقول إسماعيل أميري ، الذي أجرى هذا المشروع كجزء من رسالة الدكتوراه: "لقد نظرنا إلى مستوى إصابة النحل الدنماركي مع التركيز على مستعمرات النحل الصحية. يمكن أن تشكل النتائج المستوى المرجعي لتقييم صحة مستعمرة النحل". دراسات في جامعة آرهوس بمساعدة العديد من مربي النحل الدنماركيين الذين أرسلوا نحلًا سليمًا للدراسة.

اتضح أن هناك اختلافًا كبيرًا في حدوث الفيروس في المستعمرات المريضة والصحية. من المستعمرات السليمة ، 36 في المائة لا تحتوي على فيروسات على الإطلاق. في المستعمرات المريضة ، كان هناك نوع واحد على الأقل من الفيروسات في كل مستعمرة. كان هناك أيضًا تباين كبير في عدد جزيئات الفيروس في كلا المجموعتين ، وكان من الشائع رؤية عدة أنواع من الفيروسات في وقت واحد في نفس المستعمرة. كان الفيروس الأكثر شيوعًا هو فيروس Sacbrook (SBV) وفيروس خلية الملكة السوداء (BQCV) وفيروس الجناح المشوه (DWV).

بناءً على ملاحظاتهم ، وضع العلماء أربع فئات لمستوى الإصابة:

  • مجاني (0 جزيئات فيروسية)
  • منخفض (أكثر من 0 ولكن أقل من 1000 جسيم فيروسي)
  • متوسط ​​(أكبر من أو يساوي 1،000 ولكن أقل من 10،000،000 جزيء فيروس)
  • عالية (أكثر من أو تساوي 10000000 جسيم فيروسي)

مكن تصنيف العدد الفيروسي إلى أربع فئات العلماء من مقارنة مستويات الفيروس إحصائيًا في مستعمرات النحل المريضة والصحية. هذا التصنيف لا يفيد العلماء فقط.

يقول Per Kryger: "عندما يستطيع النحالون العمل بأربع فئات من أرقام الفيروسات بدلاً من التدرج ، فإن ذلك يسهل عليهم اتخاذ قرارات استراتيجية من أجل منع المزيد من انتشار المرض أو في أعمال التكاثر" ، ويواصل:

"من المهم أن يفهم الأشخاص العاديون المعرفة التي ننتجها. ونعتقد أن مجموعة البيانات المبسطة هذه هي وسيلة لتحقيق هذه الغاية."


ما هي مستعمرات العفن؟

سؤال: لقد تم اختبار بعض عينات العفن من خلال مختبر هنا في الولايات المتحدة. عادت النتائج تظهر فطر الرشاشيات 19 مستعمرة للعينة الأولى. كانت نتائج العينة الثانية فطر الرشاشيات 3 مستعمرات جيوتريشوم 1 مستعمرة و بنسيليوم 1 مستعمرة. ما هي المستعمرات وماذا يمثل عددها؟ هناك مشكلة خطيرة في منزلنا ولا أحد منا يقوم بصحة جيدة. أي معلومات يمكن أن تعطيني ستكون محل تقدير كبير.


إجابة: في علم الأحياء ، تشير المستعمرة (من الكولونيا اللاتينية) إلى العديد من الكائنات الحية الفردية من نفس النوع التي تعيش معًا بشكل وثيق. في حالة العفن ، تشير المستعمرات إلى النمو الفردي (انظر الصورة). عدد المستعمرات هو عدد تلك الزيادات الفردية (المستعمرات) وقد تنتمي إلى أنواع مختلفة من العفن أو نفس النوع. على سبيل المثال في حالتك ، كانت العينة الأولى فقط فطر الرشاشيات (19 مستعمرة) والعينة الثانية تحتوي على 3 أنواع مختلفة من العفن. هذا & # 8217s الرشاشيات (3 مستعمرات) ، جيوتريشوم (1 مستعمرة) و بنسيليوم (1 مستعمرة). تُظهر الصورة الموجودة على اليمين مستعمرات من نوعين مختلفين من القوالب. تنتمي المستعمرات ذات اللون الأزرق والأخضر إلى بنسيليوم والباقي (مع مراكز خضراء) Stachybotrys المستعمرات.

لا يبدو أن عدد المستعمرات المبلغ عنها للعينتين مرتفع ولكن هذا لا يعني أنك لا تعاني من مشكلة العفن. قد ترغب في طلب المساعدة من مستشار بيئي محلي مؤهل قد يكون قادرًا على تقييم مدى نمو العفن في منزلك وتقديم المشورة لك بشأن ما يجب القيام به.

إذا كنت جديدًا هنا ، فقد ترغب في الاشتراك في موجز RSS الخاص بي. شكرا لزيارتكم!

حول جاكسون كونغو

يعمل الدكتور جاكسون كونغو في MBL ، وهو مختبر متخصص في تحديد وتعداد العفن والبكتيريا التي يتم اكتشافها بشكل شائع في الهواء والسوائل والعينات السائبة التي يتم جمعها من المنازل والمدارس والمكاتب والمستشفيات والبيئات الصناعية والزراعية وغيرها من بيئات العمل. يوفر جاكسون أيضًا دورة تدريبية فريدة عن العفن حول كيفية التعرف على العفن الداخلي ، وتطوير استراتيجيات فعالة لأخذ العينات ، وتفسير نتائج المختبر ، وكيفية التحكم في نمو العفن.


مقدمة

يعتبر النمو البكتيري مؤشرًا أساسيًا في العديد من الدراسات حول الكائنات الحية الدقيقة. يتطلب اختيار المضادات الحيوية (Van Doorn et al. ، 2000) ، واختبارات السموم (Chen et al. ، 2004) ، وتقييم سلامة الغذاء والدواء (Itoh et al. ، 1998) تحديد معدلات بقاء الكائنات الحية الدقيقة للتحقق إنجازات البحث. يتضمن هذا عادةً حساب عدد البكتيريا في وحدة حجم المرق البكتيري باستخدام طرق مختلفة ، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي ، والقياس الطيفي ، والترشيح الغشائي ، وطريقة لوح الآجار. يجمع قياس التدفق الخلوي (ماسي ، 2007) بين استخدام الخصائص البكتيرية مع مختلف المواد الفلورية. يتم وضع البكتيريا في مقياس التدفق الخلوي ، حيث يتم تحفيز المواد الفلورية التي تحملها بواسطة أشعة الليزر التي يتم ضبطها على ترددات معينة لتوليد الإشارات الضوئية. تقوم المرشحات ذات الأطوال الموجية المختلفة بتحويل هذه الإشارات إلى إشارات إلكترونية لتمكين عد البكتيريا. قياس الطيف الضوئي (Schmidt and Schmidt ، 2004) هو قياس كمي للانتقال البصري للتعليق البكتيري كدالة لطول الموجة. تشير كمية الضوء التي تمر عبر نظام التعليق إلى تركيز بعض البكتيريا التي لا تسمح بمرور الضوء. تتضمن طريقة الترشيح الغشائي (Inatomi ، 2003) تمرير عينات مخففة بشكل مناسب عبر مرشح غشائي بأقطار مسامية أصغر من تلك الموجودة في الكائنات الحية الدقيقة. تبقى الكائنات الحية الدقيقة على الغشاء ، والتي يتم وضعها بعد ذلك على وسط استزراع. يمكن بعد ذلك حساب العدد الإجمالي للبكتيريا في العينة الأصلية وفقًا لعدد المستعمرات التي تتشكل على مرشح الغشاء. تتضمن طريقة صفيحة الآجار (باربوسا ، 1995) تلطيخ المعلق البكتيري المخفف على وسط استزراع مناسب. نظرًا لأن الميكروبات الباقية فقط هي التي تنمو وتشكل مستعمرات على اللوحة ، فمن خلال حساب عدد المستعمرات ، يمكن الحصول على عدد البكتيريا القابلة للحياة. من بين هذه الطرق ، يتم استخدام طريقة لوحة أجار بشكل شائع لفحص معدل بقاء الميكروبات على قيد الحياة.

ومع ذلك ، فإن العد اليدوي للمستعمرات يستغرق وقتًا طويلاً وغير دقيق. لتوفير الوقت ومنع التناقضات ، تم تطوير عدد من برامج معالجة الصور ، مثل ImageJ. ImageJ هو برنامج مجاني لتحليل الصور يمكن استخدامه للعديد من معالجة الصور وتحليلها. ومع ذلك ، بالنسبة للمستخدمين الذين ليس لديهم معرفة عميقة بمعالجة الصور ، يلزم بذل المزيد من الجهود والإلمام باللغة للحصول على نتائج مرضية. بالإضافة إلى ذلك ، كلارك وآخرون. (2010) اقترح نظام عد مستعمرات منخفض التكلفة وعالي الإنتاجية يتكون من برنامج عد مستعمرات وكاميرا رقمية أو ماسح ضوئي للمستهلكين. يقرأ البرنامج ، المسمى "NICE" (NIST & # x27s Integrated Colony Enumerator) ، تنسيقات الصور القياسية ، وبالتالي يمكن استخدامه مع العديد من أنظمة التصوير. يمكن أيضًا استخدام البرنامج (OpenCFU) الذي أنشأه Geissmann (2013) والذي يوفر التحكم في معلمات المعالجة لحساب مستعمرات الخلايا والكائنات الدائرية الأخرى. نيازي وآخرون (2007) طور Clono-Counter ، والذي يستخدم ثلاثة معلمات ، وهي مستويات الرمادي ، والحجم الأقصى لمستعمرة واحدة ، وتوزيع المستوى الرمادي داخل المستعمرة ، لحساب المستعمرة. يحتاج المستخدمون إلى بعض الخبرة للعثور على المعلمات المناسبة ، ولكن يتم توفير بعض الإرشادات لتسريع العملية. اقترح Zhang and Chen (2007) عداد مستعمرات تلقائي لتعداد المستعمرات البكتيرية دون أي تدخل بشري ، والذي ثبت أنه أكثر دقة من Clono-Counter. على الرغم من أنها تتميز بدقة عالية في الصور ذات الوسائط الملونة ، إلا أنها تعاني من مشاكل مع الوسائط الشفافة. اقترح Chen and Zhang (2009) طريقة لإزالة الاختلافات في اللون الناتجة عن الزراعة في بيئات ثقافية مختلفة ، مما يسمح بتطبيقها على أطباق بتري من مختلف الوسائط. تم عرض الأداء المعقول للصور ذات الوسائط الملونة والواضحة. الرجال وآخرون. (2008) أزال حواف أطباق بتري بافتراض أنها دوائر مثالية على الرغم من التصاق المستعمرات على الحواف. من خلال عدد من التكرارات ، حددوا قيم العتبة القادرة على عزل المستعمرات عن الخلفية ، واستخدموا تحويل المسافة وخوارزمية مستجمعات المياه لتقسيم المستعمرات ، ثم استخدموا نسبة الضغط لإزالة الضوضاء قبل العد. اقترح Hong (2008) طريقة تعتمد على آلة ناقلات الدعم (SVM) لتحديد المستعمرة. استخدم نهجهم ستة معلمات ، وهي المنطقة ، والمحيط ، والقطر المكافئ ، وعامل الشكل ، والطول ، والعرض ، لتحديد المستعمرات ، بمعدلات التعرف على أكثر من 96 ٪. اقترح Ates and Gerek (2009) طريقة تتطلب من المستخدمين تحديد ثلاث نقاط أولاً. باستخدام حقيقة أن النقاط الثلاث يمكن أن تحدد الدائرة ، قاموا بعد ذلك بتحديد حواف أطباق بتري بشكل شبه تلقائي واستخدموا نسبة الانضغاط لتحديد وجود المستعمرات العنقودية التي تتطلب التقسيم. Brugger et al. (2012) استخدم CCD واحد لالتقاط صور للمستعمرات. كان يُنظر إلى حدود الطبق على أنها دائرة كاملة. تمت إزالة المستعمرات التي لامست الحدود. كانت النتائج مرتبطة ارتباطًا وثيقًا بالنتائج التي تم الحصول عليها من العد اليدوي. داهلي وآخرون. (2004) يستخدم ماسحًا ضوئيًا مسطحًا لعد الطوائف في 12 طبق بتري في المرة الواحدة. بعد التلوين ، تم وضع أطباق بتري على رفوف مصممة خصيصًا لإصلاح الأطباق في نفس الوضع من التجربة إلى التجربة وتقليل التظليل. باي وآخرون. اقترح (2009) أداة ميكروبيولوجية تدمج محدد موقع المستعمرة ومقياس تبعثر أمامي ووحدة تحكم حركة ثنائية الأبعاد لا تحسب وتحدد المستعمرات البكتيرية فحسب ، بل تقيس أيضًا توقيع التشتت الأمامي تلقائيًا لتحديد أنواع المستعمرة البكتيرية قيد التحقيق. Ogawa et al. (2012) اقترح تحليل صورة الظل بفاصل زمني (TSIA) ، والذي يتضمن التقاط صورة واحدة من طبق بتري كل ساعة ثم تحليل الاختلافات وفقًا للظلال. تتيح هذه التقنية للمراقبين تحديد مواقع المستعمرات. كما تم تطبيق تقنيات جديدة أخرى مثل تحويل المسافة (Mukherjee et al. ، 1995) ، وتحويل Hough (Barber et al. ، 2001) ، والمنطق الضبابي (Marotz et al. ، 2001) لتسهيل العد الآلي.

لاحظ العديد من المؤلفين (Men et al. ، 2008 ، Ates and Gerek ، 2009 ، Brugger et al. ، 2012) المشكلات المرتبطة باكتشاف المستعمرات حول محيط طبق بيري ، وبالتالي استبعاد هذه المنطقة من المعالجة. ومع ذلك ، نظرًا لتوزيع المستعمرات على كامل مساحة السطح للوحة ، فإن استبعاد المستعمرات حول محيط اللوحة قد يقلل الدقة الإحصائية. بالإضافة إلى ذلك ، تتطلب بعض الخوارزميات (Niyazi et al.، 2007، Ates and Gerek، 2009) من المستخدمين توفير معلمات يدويًا قبل العملية الآلية. للتغلب على هذه المشاكل ، تقترح هذه الدراسة نظامًا آليًا فعالًا بالكامل لعد المستعمرات. تؤخذ المستعمرات حول المنطقة المركزية ومناطق حافة طبق بتري في الاعتبار. تتم مقارنة أداء النظام المقترح بالعد اليدوي الذي تم التحقق منه. كما تم تطوير واجهة مستخدم رسومية سهلة الاستخدام (GUI).

يقدم القسم التالي إجراءات زراعة المستعمرات البكتيرية والتقاط الصور. تم تقديم طرق معالجة الصور ، التي تشتمل على تجزئة الصورة ، وعد المستعمرات في المنطقة المركزية ، وعد المستعمرات في منطقة الحافة في القسم 3 متبوعًا بالنتائج والمناقشات التجريبية. ويرد ملخص واستنتاجات في القسم 5.


عد المستعمرات بالطريقة الصحيحة - علم الأحياء

تعتبر التقنية المعقمة دائمًا أمرًا نسبيًا. تعتمد الاحتياطات المطلوبة على الوضع التجريبي ، بما في ذلك وسائط النمو المستخدمة ، والقدرات التنافسية للكائن التجريبي ، ومدة التجربة ، والاستخدام المقصود للثقافة. بالنسبة لهذه التجارب ، فإن أخطر مشكلة تلوث هي العفن. تنمو العديد من القوالب الشائعة جيدًا على وسائط الخميرة وتتنافس بشكل فعال ، مما يؤدي إلى زيادة نمو الصفائح وإخفاء تلك الخميرة التي تمكنت من النمو. تعتبر البكتيريا مشكلة أقل لأن معظمها لا ينمو جيدًا على هذه الوسائط ، وبقليل من الخبرة ، يمكن للمرء بسهولة تمييزها عن الخميرة. يمكن أن تكون سلالات الخميرة الأخرى ملوثات كارثية إذا لم يتم اكتشافها. على وجه الخصوص ، يمكن أن تكون الخميرة الحمراء التي تظهر أحيانًا مربكة حقًا ، ولكنها تتميز عن الخميرة الحمراء لأنها لا تتطلب الأدينين.

على عكس التجارب قصيرة المدى ، يجب أن تكون وسائط التعقيم صارمة للغاية لأن التخزين يتيح وقتًا كافيًا حتى تتطور الملوثات بطيئة النمو. لقد استنتجنا من التجربة أن تخزين الوسائط في البرد يؤدي في الواقع إلى نتائج عكسية. لا يمنع التلوث ولكنه يبطئ نموه. وبالتالي قد لا يتم اكتشاف التلوث حتى يتم تحضين الثقافات. من الأفضل تخزين الوسائط في درجة حرارة الغرفة واكتشاف التلوث قبل استخدام الوسيط.

(1) التعقيم بالحرارة الرطبة

تُعد الحرارة الرطبة التي يوفرها الأوتوكلاف أو قدر الضغط طريقة فعالة لتعقيم معظم المواد. عند ضغط 15 رطل / بوصة مربعة فوق الضغط الجوي ، تصل درجة حرارة الماء إلى حوالي 121 درجة مئوية قبل أن يغلي. يتم تعقيم معظم المواد بشكل فعال لمدة 15 دقيقة من التعرض لدرجة الحرارة هذه. في حالة عدم توفر الأوتوكلاف ، فإن قدر الضغط المنزلي العادي سيعقم بشكل فعال إمدادات الوسائط على دفعات صغيرة.

(2) التعقيم بالحرارة الجافة

يمكن تعقيم المواد الجافة مثل الزجاج والمعدن في الفرن ، لكن هذا يتطلب درجة حرارة أعلى (160 درجة مئوية) ووقتًا أطول (ساعتان على الأقل) من الأوتوكلاف. هذا هو الأكثر عملية للأواني الزجاجية عندما يتوفر فرن يتم التحكم فيه بواسطة مؤقت تلقائي بحيث يمكن أن يحدث التعقيم والتبريد بين عشية وضحاها. استخدام الأدوات البلاستيكية التي تستخدم لمرة واحدة والمعقمة مسبقًا تجعل الفرن أقل أهمية.

يعمل اللهب المنبعث من موقد الغاز على تعقيم الزجاج الصغير أو الأجسام المعدنية بشكل فعال ، مثل حلقات التلقيح ، ولكن يجب تجنب "قلي" الخميرة عن طريق ملامسة الأشياء المسخنة في اللهب. اغمس موزعات الزجاج في الكحول ثم استخدم اللهب لإشعال الكحول. ضع الأدوات المعدنية مثل الحلقات في اللهب حتى تصبح حمراء ساخنة. قم بتبريد الأدوات الساخنة عن طريق ملامستها للأجار أو داخل أنبوب زجاجي معقم. ومع ذلك ، نظرًا لأن اللهب خطير ، يمكن ويجب تجنب هذه الطريقة كلما أمكن ذلك. لقد وجدنا أن اللهب ضروري حقًا فقط لتعقيم حلقات التلقيح والأدوات الصغيرة. لم نتمكن من إثبات أي قيمة في إشعال فتحات الأنابيب أو الزجاجات أو القوارير في هذه التجارب.

(4) التعقيم بالكحول

في العديد من الإجراءات التجريبية ، تكون الطريقة الأكثر فعالية لتعقيم الأشياء هي استخدام الإيثانول. إما 95٪ أو 70٪ سيعملون. هذا الأخير هو في الواقع أكثر فعالية ، ولكن الأول هو الأكثر ملاءمة في كثير من الأحيان. بالطبع يجب السماح للكحول بالتبخر أو الاحتراق قبل استخدام الشيء الملامس للخميرة. استخدم لهبًا لإشعال الكحول ، فالشمعة عمومًا أقل تكلفة وأكثر أمانًا من موقد الغاز. الكحول ، أكثر من الحرارة ، يقوم بالتعقيم ، لذا فقط "أشعل" الكحول لتقليل التسخين وتسريع العملية. أيضًا ، امسح المقعد بالكحول قبل البدء في تجربة لإزالة الغبار المليء بالعفن ، وهو المصدر الأكثر شيوعًا للتلوث. إذا لم تكن بشرتك حساسة بشكل خاص ، امسح يديك بكمية صغيرة من الكحول أيضًا.

(5) الحفاظ على الأشياء المعقمة معقمة

أكثر مصادر التلوث شيوعًا أثناء التجربة هي الغبار ، من سطح المنضدة ، ومن الهواء ومن الأشخاص. هذا يفرض عدة مبادئ واضحة:
1) حافظ على الأشياء مغطاة قدر الإمكان.
2) لا تلمس أي شيء يلامس المزرعة وإذا لمسته ، فقم بتعقيمه مرة أخرى قبل استخدامه.
3) امسح السطح المحيط بالتجربة بالكحول وقلل من اضطراب الهواء.
4) تجنب الكلام أو الغناء أو الصفير أو السعال أو العطس في اتجاه الأشياء التي يجب أن تكون عقيمة. قد يكون الشعر الطويل ، إذا لم يتم ربطه من الخلف ، مصدرًا للتلوث.
5) الحفاظ على مساحة مناسبة للتحضير والتخزين واستخدام الوسائط المعقمة. لسوء الحظ ، فإن نباتات المنزل والحيوانات والمواد الأخرى مثل وسط ذبابة الفاكهة ، التي توجد بشكل شائع في فصول علم الأحياء ، هي مصادر وفيرة للعفن ويجب أن تبقى بعيدًا عن المنطقة المستخدمة في الإجراءات المعقمة.

(6) ادرس التلوث الخاص بك لتجنب ذلك في المرة القادمة

إذا تلوثت بعض لوحات أجار الخاصة بك ، يمكنك في كثير من الأحيان معرفة كيفية حدوث التلوث من خلال فحص اللوحة. إذا كانت الملوثات مغروسة في الأجار ، فمن المحتمل أن الملوث قد تم سكبه بالوسيط. إذا كان التلوث أسفل الأجار ، فمن الممكن أن يكون في الطبق قبل سكبه أو إدخاله عندما كان الغطاء مفتوحًا للصب. إذا كان التلوث في الأعلى ، فمن الممكن أن يكون قد حدث قبل إغلاق الغطاء بعد الصب ، أثناء فتح الغطاء لمسح التكثيف أو أثناء تلقيح اللوحة.

(7) صمم تقنياتك وفقًا لاحتياجاتك

تعد تقنية التعقيم المناسبة ضرورية لنجاح التجارب الميكروبيولوجية ، ولكن الاحتياطات المفرطة يمكن أن تكون عوامل إلهاء خطيرة. تتطلب الخميرة والبكتيريا طرقًا مختلفة عن زراعة الأنسجة. تنمو الخميرة بقوة ، وتتفوق على معظم الأشياء ، باستثناء عدد قليل من الفطريات الخيطية (الغامضة) وبعض البكتيريا. يمكن أن تصبح التجارب ملوثة ولا تضيع عندما يستخدم الطلاب الخميرة لأن الخميرة ستنمو جيدًا بما يكفي ، على الرغم من التلوث ، بحيث يمكن قراءة نتائج التجربة من خلال النمو المخالف. لذلك ، توخى أقصى درجات الحذر أثناء عمل الوسائط وصبها.

تستخدم معظم التجارب في هذا الكتيب نوعًا أو نوعين من أنواع الوسائط التالية:
1) وسط غذائي كامل يحتوي على كمية دون المستوى الأمثل من الأدينين (YED) ،
2) وسط غذائي كامل يحتوي على فائض من الأدينين (YEAD) ،
3) وسط محدد كيميائيًا يفتقر إلى الأدينين (MV) ،
4) وسيط محدد كيميائيا مع الأدينين (MV + Ade) ،
5) وسيط التبخر (YEKAC) ،
6) وسيط يستخدم لتحديد المسوخ الصغير (PETITE) و
7) وسيط غني يستخدم لتخزين سلالات الخميرة (YEPAD).

نحن نستخدم الوسائط المعدة من المكونات المتاحة تجاريًا. يتم تعويض النفقات الإضافية الصغيرة لهذه المكونات من خلال توحيدها وموثوقيتها. المدخرات التي يمكن تحقيقها باستخدام مكونات "محلية الصنع" أقل مما كان متوقعًا لأننا لم نعثر بعد على بديل لأغلى مكون ، أجار. على الرغم من أن المصادر الشائعة ، مثل أنواع مختلفة من عصائر الخضروات ، يمكن أن توفر معظم المكونات الأخرى ، فقد وجدنا أن التضحية بإمكانية التكاثر غير مبررة.

سيكون متوسط ​​YED (مستخلص الخميرة + سكر العنب) هو وسيلة النمو القياسية لدينا. يطلق عليه وسط "معقد" لأنه مصنوع من مكونات طبيعية (خميرة) وتركيبه الكيميائي الدقيق غير معروف. يحتوي على كل ما هو موجود في الخميرة - بما في ذلك الأدينين بالطبع - لذلك فهو أيضًا وسيط "كامل". تنمو المسوخات التي تتطلب الأدينين الأحمر جيدًا على هذا الوسط وتطور الصبغة الحمراء المميزة.

يحتوي وسط YEAD (مستخلص الخميرة + Adenine + Dextrose) على نفس مكونات YED ولكن يحتوي على كمية زائدة من الأدينين. تنمو المسوخات التي تتطلب الأدينين الأحمر جيدًا في هذا الوسط و سوف لن تطوير الصبغة الحمراء المميزة.

يحتوي وسط YEPAD (مستخلص الخميرة + البيبتون + الأدينين + الدكستروز) على نفس مكونات YEAD ولكنه يحتوي على الببتون المضاف. هذا وسيط غني جدًا يستخدم لتخزين سلالات الخميرة.

وسط MV (الحد الأدنى بالإضافة إلى الفيتامينات) هو وسيط محدد كيميائيًا ، مما يعني أنه يتكون من الحد الأدنى من المكونات الكيميائية النقية اللازمة لدعم نمو الخميرة من النوع البري. سنستخدم MV عندما نحتاج إلى وسيط لا يحتوي على الأدينين.

يحتوي وسط MV + Ade (الحد الأدنى بالإضافة إلى الفيتامينات + الأدينين) على نفس المكونات مثل MV ولكن يحتوي على كمية زائدة من الأدينين.

يحفز YEKAC (مستخلص الخميرة بالإضافة إلى أسيتات البوتاسيوم) ثنائي الصيغة الصبغية الخميرة للتكاثر والخضوع الانقسام الاختزالي. إنه غير متوازن من الناحية التغذوية ، لذا سيحدث نمو ضئيل للغاية.

يحتوي وسط PETITE على الجلسرين كمصدر للكربون ويستخدم لتحديد طفرات المستعمرات الصغيرة. لن تنمو الخلايا الصغيرة على هذا الوسط.

وصفات لوسائل نمو أجار

إذا كنت تستخدم مزيجًا مُعبأ مسبقًا ، فاتبع التعليمات الموجودة على العبوة. إذا كنت تقوم بوزن المكونات الجافة ، فاستخدم الوصفات التالية. يتم إعطاء الوصفات لتحضير 100 مل. إذا كنت ترغب في تحقيق المزيد ، فما عليك سوى مضاعفة المبالغ للحصول على الحجم الذي تريده. مثال: لتحضير 500 مليلتر ، اضرب كل مكون في 5. لا تضع أكثر من 600 مليلتر في دورق سعة 1000 مليلتر. إذا ملأت الحاويات ممتلئة جدًا فقد تغلي أثناء عملية التعقيم.يستغرق ما يقرب من 25 مليلترًا من المتوسط ​​لصب لوح قياسي واحد بحجم 100 × 15 مم. (يمكن صنع الوسائط السائلة من هذه الوصفات عن طريق حذف الأجار.)

خميرة مستخلص سكر العنب (YED):

1 جرام مستخلص الخميرة
2 غرام دكستروز لا مائي (جلوكوز)
2 جرام أجار (صمغ أجار أجار)
100 مل ماء

مستخلص الخميرة Adenine Dextrose Medium (YEAD):

1 جرام مستخلص الخميرة
2 غرام دكستروز لا مائي (جلوكوز)
2 جرام أجار (صمغ أجار أجار)
8 مل من محلول الأدينين
92 مل ماء

مستخلص الخميرة الببتون الأدينين سكر العنب المتوسط ​​(YEPAD):

1 جرام مستخلص الخميرة
2 جرام ببتون
2 غرام دكستروز لا مائي (جلوكوز)
2 جرام أجار (صمغ أجار أجار)
8 مل من محلول الأدينين
92 مل ماء

1 جرام مستخلص الخميرة
0.025 غرام دكستروز لا مائي (جلوكوز)
2.4 مل جلسرين
2 جرام أجار (صمغ أجار أجار)
98 مل ماء

0.15 جرام قاعدة نيتروجين الخميرة بدون أحماض أمينية وكبريتات الأمونيوم
0.52 جرام كبريتات الأمونيوم
2 غرام دكستروز لا مائي (جلوكوز)
2 جرام أجار (صمغ أجار أجار)
100 مل ماء

Minimal Media plus Adenine (MV + ade):

0.15 جرام قاعدة نيتروجين الخميرة بدون أحماض أمينية وكبريتات الأمونيوم
0.52 جرام من كبريتات الأمونيوم
2.0 غرام دكستروز لا مائي (جلوكوز)
2.0 غرام أجار (أجار صمغ أجار)
8.0 مل من محلول الأدينين
92 مل ماء

1 جرام خلات البوتاسيوم
0.25 جرام مستخلص الخميرة
2 جرام أجار (صمغ أجار أجار)
100 مل ماء

400 مجم أدينين في 400 مل من الماء (1 مجم / مل)
احفظه في درجة حرارة الغرفة.
استخدم 2 مل من محلول المخزون مقابل 100 مل من الوسط قلل الماء المضاف إلى الوسط بمقدار 2 مل.

أقراص Adenine Blotter الورقية

1.25 جرام من الأدينين
150 مل ماء مقطر
أقراص ورق نشاف فنية
أضف الأدينين إلى الماء المقطر في دورق كبير بما يكفي حتى لا يغلي المحلول. يغلي لمدة خمس دقائق. أضف الأقراص الورقية النشافة واتركها تغلي لمدة خمس دقائق أخرى. قم بإزالة الأقراص بالملقط المعقم إلى حاوية معقمة مغطاة مثل طبق بتري. ضعيها في طبقة واحدة واتركيها تجف لعدة أيام.

بالنسبة للعديد من التجارب قصيرة المدى ، من الممكن "تعقيم" الماء بالغليان.
1) ضع الماء في وعاء مغطى بشكل فضفاض ،
2) ضع الحاوية في قدر من الماء المغلي لمدة 15 دقيقة ،
3) بعد أن يبرد شد الغطاء على وعاء الماء.

ربما تكون الطريقة الأفضل لتحضير الماء المعقم هي وضع حاويات الماء المغطاة بشكل غير محكم في الأوتوكلاف أو قدر الضغط ثم تعقيم الماء في نفس الظروف المستخدمة في وسائط النمو.

F. درجة حرارة الحضانة ومعدلات النمو

تبلغ درجة حرارة النمو المثلى لهذه السلالات حوالي 30 درجة مئوية ، لكنها ستنمو بشكل مرضٍ تمامًا على نطاق أوسع بكثير. يمكن إجراء كل هذه التجارب في درجة حرارة الغرفة المريحة ، لكن الخميرة تتحمل تقريبًا أي درجة حرارة يستطيع الناس تحملها. ومع ذلك ، ستؤثر درجة الحرارة على معدل النمو. في درجات الحرارة المنخفضة ، تنمو الخلايا بشكل أبطأ ، ويجب تحديد المعدل بالتجربة. تعتمد أوقات الحضانة المقدرة في هذه التجارب على الحضانة عند درجات حرارة في حدود درجة أو درجتين من 30 درجة مئوية.

يمكن للمرء ، في الواقع ، إبطاء الخميرة عن طريق تبريدها لجعل التجارب تتناسب مع جداول الفصل. ببساطة قم بتبريد الأطباق أو قم بتبريدها في مراحل مختلفة لإبطاء النمو. ومع ذلك ، ضع في اعتبارك أنه بعد أن يتم تبريد الثقافة ، قد تكون هناك فترة تأخير تصل إلى عدة ساعات قبل أن تبدأ في النمو مرة أخرى. بالطبع ، إذا وصلت إلى المرحلة الثابتة ، فلن تنمو أكثر في أي درجة حرارة.

يمكن تخزين سلالات الخميرة لفترات طويلة في الثلاجة عند درجات حرارة أعلى بقليل من درجة التجمد. ستستمر بعض السلالات في النمو ، على الرغم من أنها بطيئة جدًا ، في درجات الحرارة هذه ، لكن معظمها يظل قابلاً للحياة لأسابيع أو شهور ، والبعض الآخر لسنوات.

يجب تجنب درجات الحرارة التي تزيد عن 30 درجة مئوية. على الرغم من أن الخلايا ستنمو في درجات حرارة أعلى ، فإنها تتراكم طفرات صغيرة غير مرغوب فيها ويتم تثبيط الأبواغ بشدة. يتم أيضًا تثبيط الصباغ الأحمر في طفرات الأدينين في درجات الحرارة المرتفعة. من الأسلم احتضان الثقافات التي يتم استنشاقها في درجة حرارة الغرفة المريحة.

احتضان الثقافات في الظلام أو الضوء المخفف بقدر ما هو مناسب. على الرغم من أنه ليس حرجًا ، فإن التعرض المطول لضوء الغرفة العادي أو الضوء الأكثر إشراقًا سيقلل من صلاحية الخلايا التي تحتوي على الصبغة الحمراء. يجب ألا تتعرض السلالة الحساسة للأشعة فوق البنفسجية G948-1C / U لمصادر الضوء لفترة طويلة.

لتحقيق النمو الأمثل ، ولكي تتطور الصبغة الحمراء ، يجب أن تكون الألواح هوائية. نقوم باحتضان الأطباق في أكياس تخزين الطعام البلاستيكية المفتوحة. يتوفر ما يكفي من الأكسجين مع الأكياس المفتوحة لدعم التنفس الهوائي. تمنع الأكياس البلاستيكية الألواح من الجفاف بسرعة كبيرة ، وتحميها من التلوث وتجعل حملها أسهل دون انسكاب.

ز- استخدام المسواك وحلقات التلقيح

بالنسبة لمعظم الأغراض ، أسهل طريقة لنقل الخميرة من مكان إلى آخر على وسط أجار هي باستخدام مسواك معقم. المسواك ذو النمط المسطح أسهل في الاستخدام من النمط الدائري. تعتبر النهاية المدببة مفيدة في انتقاء العينات من المستعمرات الفردية أو لعمل بقع أو خطوط صغيرة. تعتبر النهاية المسطحة جيدة لنشر الخميرة ولتشذيبها لعزل مستعمرات مفردة وللخلط. المسواك معقمة من الصندوق مباشرة طالما أن الصندوق غير ملوث. ما عليك سوى قطع زاوية واحدة لعمل ثقب صغير (حوالي 1/4 إلى 1/2 بوصة عرضًا) وسيكون الصندوق بمثابة موزع. تشير أعواد الأسنان الموجودة في صندوق إلى كلا الاتجاهين ، ولكن يمكنك بسهولة تحديد النهاية التي تفضلها لأي مهمة. بالطبع ، يجب على المرء أن يحرص على التعامل مع كل عود أسنان فقط بحلول النهاية التي لن تمس الخميرة أو الوسط.

عود الأسنان هو بديل لحلقة التلقيح التقليدية والمتوفرة تجارياً حتى في البلاتين. نصنع حلقات التلقيح الخاصة بنا من قطعة 6 إلى 8 بوصات من قضيب نحاسي (كما هو مستخدم في اللحام بالنحاس) وسلك نيتشروم. قم بحفر ثقب صغير بالقرب من نهاية القضيب لتثبيت السلك ، وأدخل نهاية السلك في الفتحة ، ولف عدة لفات حول القضيب واترك بوصة أو اثنتين من السلك مستقيمًا. في نهاية الجزء المستقيم شكل حلقة مع زوج من كماشة الأنف الإبرة. اشعل السلك في موقد خبز حتى يتوهج باللون الأحمر لتعقيمه قبل كل استخدام ، وبالطبع اتركه ليبرد قبل أن يلمس (أو يقلى) الخميرة. لمسه للأجار يبرده على الفور.

هناك عدة طرق لنشر الخلايا. يستخدمون أنواعًا مختلفة من معدات الماصات وطرقًا مختلفة لتحريك الخلايا على سطح أجار.
طريقة صب الطلاء الكمي
تتطلب هذه الطريقة إعداد أنبوب تخفيف نهائي منفصل لكل لوحة ثم يتم سكب محتويات الأنبوب بالكامل على سطح أجار. تتميز هذه الطريقة بأنها لا تتطلب استخدام اللهب. من عيوبه عدم إمكانية استنساخه.

1. قم بعمل سلسلة من 1 إلى 10 تخفيف من معلقات خلية الخميرة.
2. الماصة 0.1 مل من المعلق المناسب في أنبوب معقم يحتوي على 0.9 مل من الماء المعقم. قم بتدوير الأنبوب لتعليق الخلايا ثم صب محتويات الأنبوب بالكامل على سطح وسط أجار. قم بإمالة اللوحة وتدويرها لتوزيع التعليق بالتساوي على سطح الأجار.
3. إذا كانت هناك بقع غير مغطاة ، استخدم عود أسنان معقم لفرد التعليق على المناطق المكشوفة.

تعليق لابد أن يكون يُسمح لها بالنقع في أجار قبل تعريض الألواح للمعالجة التجريبية. لتسريع العملية ، اصنع أطباق الأجار عدة أيام مقدمًا واتركها تجف قليلاً قبل صب الخميرة المعلقة.

يوضح قسم الفيديو التخفيف التسلسلي وعدد الخلايا القابلة للحياة طريقة الطلاء بالصب.

طريقة الانتشار الكمي
عندما تريد بيانات دقيقة ، فمن الأفضل استخدام طريقة طلاء بديلة. يتم وضع تعليق الخلية بدقة على سطح الأجار ثم يتم نشره باستخدام مفرشة معقمة. هناك نوعان من الموزعات:

لا يوجد موزع لهب مشبك ورق
يمكنك بسهولة صنع مفرشة غير مكلفة قابلة لإعادة الاستخدام عن طريق استقامة ثنيتين في مشبك ورق كبير ، تاركًا طرفًا على شكل دبوس شعر للانتشار ومقبض مستقيم بزاوية قائمة عليه. يمكنك تعقيم عدة موزعات معًا في أكواب مغطاة أو ملفوفة بورق أو ورق.
الموزعة الزجاج الملتهب
إذا كانت لديك المعدات والمهارات اللازمة للعمل مع قضيب زجاجي ، فيمكنك صنع مفرشة زجاجية بسيطة عن طريق تسخين وثني قسم بوصة واحدة في نهاية قطعة قصيرة من قضيب الزجاج. يمكن أيضًا شراء هذه الموزعات.

1. قم بعمل سلسلة من 1 إلى 10 تخفيف من معلقات خلية الخميرة.
2. استخدم طرف ماصه جديده لماصه 0.1 مل من التعليق المناسب علي سطح الاجار. قم بضرب الأنبوب قبل أخذ العينة. إذا كنت تقوم بعمل لوحات متعددة ، فيمكنك ماصة الخلايا في كل لوحة باستخدام نفس طرف الماصة ثم نشرها دون حرق الموزعة بين كل لوحة.
3. قم بتعقيم الموزعة في 95٪ من الإيثانول ثم قم بتمرير الموزعة عبر اللهب لإشعال الكحول. امسك الموزعة بعناية حتى يحترق كل الكحول الموجود على الموزعة تمامًا. يعد استخدام لهب الكحول خطوة خطيرة وتتطلب عناية وإشرافًا دقيقًا من قبل المعلم.
4. تبريد الموزعة عن طريق لمسها في أجار. استخدم الجانب المسطح لنشر التعليق على السطح ثم استخدم الجزء المنحني من الموزعة لعمل حدود متداخلة. اقلب اللوحة 90 درجة وكرر عملية عمل ضربات متداخلة. يمكن وضع الغطاء فوق اللوحة لتقليل التلوث. تجنب نشر التعليق إلى الحافة حيث يمكن أن ينساب بين الأجار وجانب طبق بتري.

مقطع الفيديو باستخدام الخميرة لقياس الأشعة فوق البنفسجية الشمسية ، يوضح طريقة طلاء الزجاج المشتعلة.

طريقة صب الطلاء النوعية لإنتاج مروج الخلايا
تنتج هذه الطريقة نموًا سميكًا ومتساويًا للخلايا (العشب) فوق سطح صفيحة الآجار. هذه طريقة سريعة ومفيدة لمجموعة متنوعة من التجارب النوعية.

1. عمل معلق عكر لخلايا الخميرة.
2. الماصة 1.0 مل من المعلق على سطح وسط أجار. قم بإمالة اللوحة وتدويرها لتوزيع التعليق بالتساوي على سطح الأجار.
3. إذا كانت هناك بقع غير مغطاة ، استخدم عود أسنان معقم لفرد التعليق على المناطق المكشوفة.

كما هو الحال في طريقة صب الطلاء الكمي التعليق لابد أن يكون يُسمح لها بالنقع في أجار قبل تعريض الألواح للمعالجة التجريبية. إذا قمت بإعداد أطباق الأجار قبل عدة أيام وتركتها تجف قليلاً قبل صبها على تعليق الخميرة ، فسوف تسرع العملية.

قسم الفيديو تأثير الأشعة فوق البنفسجية الشمسية على الخلايا يوضح طريقة صب الطلاء للعشب.

1. الماصات الدقيقة الأوتوماتيكية ، الماصات المصلية ، و الماصات التي يمكن التخلص منها

الماصات الآلية هي حصيلة عمل البيولوجيا الجزيئية وعلم الأحياء الدقيقة الحديث. فهي سريعة ودقيقة ، وتوفر قدرًا كبيرًا من الوقت والإحباط. غالبًا ما تتطلب التجارب في هذا الدليل استخدام ماصة 0.1 مل. على الرغم من أنها باهظة الثمن نسبيًا ، إلا أنها تجعل المهمة سريعة جدًا بحيث يمكن بسهولة مشاركة المرء من قبل العديد من الطلاب أو مجموعات المختبرات. سوف تستخدمه لعمل التخفيفات التسلسلية ولطلاء الخلايا على أجار. يتم تغليف الأطراف المعقمة في عبوات بلاستيكية قابلة لإعادة الاستخدام. تدرب على استخدام المصاصة بالماء حتى تشعر بالراحة معها. (في حالة عدم توفر المراميات الدقيقة الأوتوماتيكية ، فمن الممكن استبدال الماصات ذات اللمبة التي تستخدم لمرة واحدة أو الأنابيب المصلية أو الأنابيب الشعرية المتدرجة)

1. اضغط على الطرف الصغير من المصاصة بقوة في الطرف المفتوح للطرف بينما لا يزال الطرف في الموزع.
2. لملئه ، اضغط على المكبس ببطء حتى تشعر بمقاومة ، ولكن ليس بقدر الإمكان. اغمر الطرف في المحلول ثم حرر المكبس ببطء. إذا التصقت أي قطرات بالطرف ، امسحها على حافة الوعاء.
3. ضع الطرف في السائل في الأنبوب الذي تستخدمه بالمص ثم اضغط على المكبس ببطء. هذه المرة اضغط عليها بقدر الإمكان لطرد كل العينة. قم بإزالة طرف المصاصة من المحلول ، ثم حرر المكبس ، وتخلص من الطرف.

يمكن استخدام الأنابيب المصلية ومضخات الماصات بدلاً من الماصات الآلية. ستعطي هذه الماصات قياسات دقيقة جدًا للحجم. من الممكن شراء أنابيب مصلية معقمة بعدة أحجام. يجب أن يكون لديك مجموعة من مضخات الماصات المتاحة للطلاب لاستخدامها مع هذه الماصات. تذكر أنه ليس من الممارسات الجيدة أبدًا استخدام فمك لسحب السائل إلى الماصة. ولا حتى الماء المعقم!

تعتبر الماصات التي تستخدم لمرة واحدة مقبولة أيضًا في معظم التجارب في هذا الكتيب. ثلاث قطرات من ماصة واحدة مليمتر واحد تساوي تقريبًا 0.1 مل. قياسات الحجم ليست دقيقة ولكن هذه الأنابيب رخيصة ولا تتطلب استخدام مضخات الماصة. يمكن أيضًا شراء هذه الماصات معقمة ومغلفة بشكل فردي. توفر أغلفة الماصات المعقم مسبقًا حاملًا معقمًا مناسبًا للماصة أثناء الإجراء التجريبي.

J. صنع ثقافة فرعية من الخميرة

يمكن توفير مغذيات الخميرة بواسطة وسط صلب أو سائل. عندما تأتي سلالات الخميرة من أحد الموردين ، فإنها عادة ما تنمو على نباتات أجار. إذا حافظت على هذه الفتحات مغلقة بإحكام وتبريدها ، يمكنك تخزينها لمدة تصل إلى عام واحد. تسمح لك الفتحات الأصغر باستخدام المسواك لتحريك الخميرة. من الأفضل أن يكون لديك ثقافات جديدة لتجاربك. لذلك في اليوم السابق الذي تنوي فيه استخدام الخميرة ، انقل عددًا صغيرًا من الخلايا من مزرعة المخزون إلى وسط طازج (عادةً YED). يمكنك استخدام حلقة ملتهبة لنقل الخلايا ولكن المسواك المعقمة أسهل في العادة. قم بلمس الخلايا الموجودة في المنحدر الذي لا تحتاج إليه لنقل العديد من الخلايا. اصنع خطًا من الخلايا على سطح الأجار ، حاول ألا تخدع سطح الأجار. يسمى هذا الإجراء الخاص بزراعة الخميرة الطازجة بالثقافة الفرعية. يجب أن تقوم بإجراء زراعة فرعية قبل 12 ساعة على الأقل من نية استخدام الخميرة.

في بعض الأحيان يتم إرسال الثقافات من مراكز مخزون الخميرة على أوراق الحليب. لعمل ثقافة فرعية جديدة: افتح الرقاقة بشكل معقم وباستخدام ملقط معقم ضع المربع الصغير من ورق الحليب على طبق أجار YED معقم. إذا قمت بمسح الورقة عبر الأجار عدة مرات ، يجب أن تحصل على مستعمرات مفردة لاستخدامها وستنمو بقعة كبيرة من الخلايا في مكان وضع الورق. سوف يستغرق الأمر من 3 إلى 5 أيام للعديد من السلالات المستزرعة بهذه الطريقة لتنمو إلى حجم مناسب. الثقافات المرسلة بهذه الطريقة أقل عرضة للظروف الجوية القاسية وأوقات السفر الطويلة.

K. عزل المستعمرات المفردة

تتطلب العديد من التجارب نمو مستعمرات من خلايا مفردة معزولة. يمكن تحقيق ذلك بسهولة عن طريق تسليط ثقافات على صفيحة أجار بنهاية مسطحة لعود أسنان. الغرض من هذه التقنية هو تخفيف الخلايا الموجودة على سطح الأجار في خطوط متتالية ومتداخلة ، حتى يتم فصل الخلايا الفردية أو توزيعها لتشكيل مستعمرات مفردة معزولة. يوضح الشكل أدناه الأسلوب الذي يجب أن تمارسه حتى تصبح بارعًا.

تتمثل الخطوة الأولى في عمل خط واحد قصير من الخلايا (يبلغ طوله حوالي 2 سم) بالقرب من حافة الأجار في طبق بتري. باستخدام عود أسنان جديد ، اصنع خطًا متداخلاً ثانيًا بزاوية 15 درجة تقريبًا للخط الأول ، واسحب الخلايا من الخط الأول إلى أجار جديد. اصنع عدة خطوط متوازية أخرى بنفس عود الأسنان. ثم خذ عود أسنان جديد وكرر العملية بدءًا من نهاية آخر خط. كرر هذا التسلسل حتى تتم تغطية اللوحة بالكامل. نظرًا لأن عدد الخلايا التي يتم إنتاجها من خلية أصل واحدة هو استنساخ ، فهذه عملية لاستنساخ الخميرة. إذا لم تكن الثقافة نقية ، لأي سبب كان ، فإن هذا يوفر طريقة لعزل الحيوانات المستنسخة النقية. يمكن تحقيق نفس النتيجة باستخدام حلقة ملتهبة ومبردة في كل خطوة حيث يتم استخدام عود أسنان جديد. هذا النهج أبطأ ، ويخاطر بقلي الخلايا.

في بعض التجارب ، نقوم بنقل العديد من الثقافات من نوع واحد من الوسط إلى نوع واحد أو عدة أنواع أخرى ، لتحديد متطلبات نمو الثقافات. يمكن القيام بذلك باستخدام المسواك أو الحلقات ، ولكن إذا كان هناك الكثير من السلالات المراد نقلها ، فإنه يصبح شاقًا. لعبت طريقة بسيطة وسريعة - الطلاء المتماثل - دورًا رئيسيًا في تطوير علم الوراثة الميكروبية وهي واحدة من أكبر مدخرات العمالة على الإطلاق. يمكن إجراء التجارب الموضحة أدناه بدون هذه التقنية ، ولكن القيام بها أمر رائع ويستحق عناء إعدادها. حتى مع التجارب المتواضعة ، يعد الجهد استثمارًا جيدًا على المدى الطويل.

مبدأ الطلاء المتماثلة هو مبدأ ختم مطاطي.

يتم استخدام ختم قطني قطني لختم نسخة طبق الأصل من نمط الخلايا التي تنمو على لوحة واحدة إلى لوحة واحدة أو عدة لوحات أخرى. يتكون الجهاز من حامل أسطواني للقطيفة بحجم مناسب تمامًا ليناسب الجزء السفلي من لوحة بتري ، وحلقة من نوع ما لتثبيت القطيفة في مكانها. بالنسبة للألواح البلاستيكية القياسية مقاس 10 سم ، يبلغ القطر المناسب حوالي 3.3 بوصة. يمكن أن يكون الحامل أسطوانة من الخشب أو المعدن أو البلاستيك أو أي مادة أخرى يمكنك تصنيعها. يمكن أن يكون حتى علبة طعام رطل واحد أو حاوية أسطوانية ثقيلة أخرى إذا كان القاع مسطحًا. (الدائرة المقطوعة من صينية اللحم الرغوية تجعل سطحًا مسطحًا جيدًا لوضع علبة الطعام) يمكن أن تكون الحلقة التي تمسك القطيفة عبارة عن مشبك خرطوم كبير ، أو بعض الأشياء الأخرى التي تم العثور عليها ، أو حتى شريط مطاطي كبير.

بالطبع ، يجب تعقيم القطيفة ، وعادة ما يحتاج القطيفة القطنية المقطوعة حديثًا إلى إزالة الوبر بقطعة من شريط التقنيع قبل تعقيمها. الأوتوكلاف وجففها جيدا. نحن نستخدم مربعات بحجم ستة بوصات ، نقوم بتكديسها ولفها في الورق ، وتعقيمها ، ثم تجفيفها في مكان التفريغ. في حالة عدم توفر الأوتوكلاف ، جففهم في فرن دافئ أو اتركهم على المنضدة حتى يجفوا. لإعادة استخدام المربعات القطيفة ، اشطفها بالماء العادي وأعد تعقيمها. يمكن استخدام الأقمشة الأخرى مثل عدة طبقات من شاش القطن بدلاً من القطن المخمل.

لنسخة طبق الأصل ، اقلب اللوحة الرئيسية ، التي عليها خميرة ، فوق القطيفة الموجودة على الحامل واضغط على اللوحة بقوة مقابل سطح القماش المعقم. ثم انزع اللوح ببطء ، تاركًا نسخة طبق الأصل أو طباعة من نمط الخلية على القطيفة. انقل النسخة المتماثلة الموجودة على القطيفة إلى واحدة أو سلسلة من الألواح المعقمة بالضغط على كل لوحة برفق على القطيفة ثم تفرقعها. من الممكن عمل ما يصل إلى 20 نسخة متماثلة من لوحة رئيسية واحدة إذا لزم الأمر. الإجراء موضح في الشكل 13.

تتحكم الطريقة التي تزيل بها الصفيحة من القطيفة في كمية الخميرة المنقولة من القطيفة إلى الطبق أو من الصفيحة إلى القطيفة. إذا قمت بتقشير اللوحة الرئيسية من القطيفة بحركة بطيئة ومتدحرجة ، فستبقى خميرة على المخمل أكثر مما لو قمت بفكها بحركة عمودية سريعة. من المستحسن نقل أقل عدد ممكن من الخلايا مع الاستمرار في رؤية طباعة الخلايا على لوحة النسخة المتماثلة.

م. تقدير عدد خلايا الخميرة في الثقافة

هناك العديد من الطرق لعد الخلايا بشكل مباشر ، وأكثرها شيوعًا هو استخدام غرف العد للميكروسكوب أو عدادات الجسيمات الإلكترونية. هذه لها قيمة إرشادية قليلة في علم الوراثة ، وليست مناسبة للاستخدام العام في الفصول الدراسية.لذلك ، قمنا بتصميم تجارب لا تعتمد على تعداد دقيق للجسيمات. عندما تكون هناك حاجة إلى تعداد الخلايا ، نحددها من عدد المستعمرات على اللوحات (انظر إجراءات التخفيف والطلاء).

ومع ذلك ، تتطلب العديد من التجارب إجراء تقديرات تقريبية لعدد الخلايا في معلق سائل من أجل الحصول على عدد معقول من المستعمرات المطلية. لهذا سوف تستخدم واحدة من أكثر الأدوات البصرية تعقيدًا وحساسية في الوجود: العين البشرية. مع القليل من الممارسة بشكل مدهش ، يمكنك تعلم تقدير عدد الخلايا في التعليق بمجرد النظر إليها.

يعتمد التقدير المرئي لكثافة الخلية على عتبة العين الحادة إلى حد ما لرصد التعكر. عند عرضها في أنبوب قياسي 13 × 100 مم ، فإن معلقات الخميرة التي تقل عن مليون خلية لكل مل لا تكون عكرة بشكل واضح. فوق هذه الكثافة العتبة تكون غائمة بشكل واضح. عن طريق ضبط عدد الخلايا في التعليق حتى بالكاد تكون مرئية ، يمكنك الحصول على تعليق بكثافة معروفة (حوالي 1 × 106 خلية / مل) ثم استخدام التخفيفات التسلسلية للحصول على تركيزات أخرى. (انظر أيضًا التجربة التخفيفات التسلسلية وعدد الخلايا القابلة للحياة)

  • أنابيب معقمة ، مغطاة 13 × 100 مل
  • ماء معقم
  • ماصات معقمة سعة 1 مل (أنابيب بمصباح يمكن التخلص منها أو أنابيب مصلية ومضخة ماصة)
  • الماصات الدقيقة ونصائح معقمة (اختياري)

إجراء:
أ. ضع 1 إلى 2 مل من الماء المعقم في الأنبوب.
ب. استخدم حلقة التلقيح المبردة والملتهبة أو المسواك المعقمة لتعليق كمية صغيرة من الخميرة ، بحجم رأس الدبوس ، في الماء.
ج. امزج المعلق جيدًا عن طريق إمساك الأنبوب بشكل غير محكم بالقرب من قمته بين الإبهام والسبابة ، وضربه بالقرب من الجزء السفلي بجانب راحة إصبع واحد أو أكثر من أصابع اليد الأخرى ، مما يؤدي إلى حركة دائرية. (تقترب حركة الضربات من الإيماءة التي قد يقوم بها المرء ليطلب من شخص ما أن يأتي إلى هنا).
يجب أن يحتوي هذا المعلق على ما يقرب من 1 × 107 خلية / مل ، ولكن يصعب الحكم على هذه الكثافة ، لذلك سنخففها قبل الحكم على كثافتها.
د. امصه 0.9 مل من الماء المعقم في انبوب مع ماصه معقمه 1.0 مل.
ه. قم بتخفيف 0.1 مل من تعليق الخلية في هذا الأنبوب وضربه. قارنه بأنبوب يحتوي على ماء معقم. إذا كان الأنبوب الذي يحتوي على خلايا بالكاد عكرًا ، فإنه يحتوي على ما يقرب من 1 × 106 خلية / مل.
F. إذا لم يكن الأنبوب عكرًا بشكل واضح ، فقم بإضافة أحجام إضافية بمقدار 0.1 مل من التعليق الأصلي حتى يتم ذلك. إذا كنت تعتقد أنه أكثر تعكرًا من حد الرؤية ، فقم بإضافة المزيد من الماء المعقم. اضبط أحجام الماء والخلايا حتى تقتنع. تتبع الأحجام التي تضيفها حتى تعرف التخفيف النهائي الذي قمت بإجرائه.

ن. إجراءات التخفيف والطلاء

في العديد من التجارب ، يجب على المرء أن ينشر عددًا معروفًا تقريبًا من الخلايا على صفيحة لتنمو في مستعمرات. نحن نستخدم التخفيفات المتسلسلة ، ونقوم بعمل عدة تخفيفات صغيرة ، واحدة تلو الأخرى ، بدلاً من تخفيف واحد كبير. تعمل هذه الطريقة على حفظ المواد وتجنب استخدام كميات كبيرة يصعب قياسها وتعقيمها.

  • أنابيب معقمة ، مغطاة 13 × 100 مل
  • ماء معقم
  • ماصات معقمة سعة 1 مل (أنابيب بمصباح يمكن التخلص منها أو أنابيب مصلية ومضخة ماصة)
  • الماصات الدقيقة ونصائح معقمة (اختياري)
  • مشبك الورق أو الموزعة الزجاجية: يتم توزيع الخلايا على سطح الآجار باستخدام الناشرات.

صنع التخفيفات التسلسلية:
ينتج عن الإجراء التالي سلسلة من التخفيفات التي تختلف حسب عوامل العشرة. ستكون قادرًا على استخدام هذا الإجراء لمعظم التجارب التي تتطلب تخفيفًا تسلسليًا (الشكل 12).

أ. قم بإعداد تعليق يحتوي على حوالي 1 × 106 خلية / مل في ماء معقم باستخدام الإجراء الموضح في تقدير عدد خلايا الخميرة في الثقافة.
ب. امص 0.9 مل من الماء المعقم في كل من الأنابيب الثلاثة وقم بتسميتها. نوصي بعمل رسم تخطيطي في دفتر ملاحظاتك يوضح الإجراء ومعنى التسميات الخاصة بك.
ج. أعد تعليق الخلايا في التعليق الأصلي. قم بإزالة 0.1 مل باستخدام المرذاذ الصغير وطرف جديد وقم بنقله إلى أحد أنابيب الماء. ثم اضرب الأنبوب لتعليق الخلايا.
د. كرر الإجراء بشكل متسلسل ، باستخدام ماصة جديدة أو طرف ماصة لكل من الأنابيب المتبقية ، بحيث يحتوي كل أنبوب على 1/10 من عدد الخلايا كالسابق. يجب أن يحتوي التخفيف الثالث على حوالي 1 × 103 خلية / مل.

تصفيح التخفيفات:
إذا كنت تتوقع أن تنمو جميع الخلايا ، فإنك ستقوم فقط بصفيحة التخفيف النهائي ، حيث ستكون الأنابيب الأخرى شديدة التركيز وستحتوي الصفائح المصنوعة منها على عدد كبير جدًا من المستعمرات التي لا يمكن عدها. ومع ذلك ، في تجارب الإشعاع ، ستستخدم التخفيفات التي تحتوي على المزيد من الخلايا للتعويض عن انخفاض عدد الخلايا التي تنجو من التشعيع. بهذه الطريقة ستحصل على العدد الأمثل من الخلايا للعد في كل لوحة ، حتى عندما تكون معظم الخلايا ميتة.

ه. سيكون لديك بيانات أفضل إذا قمت بإجراء جميع اللوحات في نسختين أو ثلاث نسخ. قم أولاً بتسمية اللوحات باستخدام قلم تعليم (Pilot SC-UF أو Sharpie). (ستستخدم أيضًا هذا النوع نفسه من القلم لتمييز المستعمرات عند عدها.) نوصي بتحديد كل لوحة برقم السلالة ، والجرعة (للتجارب الإشعاعية) ، والتخفيف المصقول ، والأحرف الأولى من اسمك ، ولكن قد تفضل لتشفير هذه المعلومات في ملاحظاتك ووضع الرموز أو الأرقام على اللوحة. اكتب فقط على الغطاء أو بأحرف صغيرة على حافة القاع ، تاركًا الجزء السفلي واضحًا لتمييز المستعمرات عند عدهم.

F. أعد تعليق الخلايا في كل أنبوب عن طريق دفعه قبل أخذ عينة ، ثم الماصة 0.1 مل في وسط كل من اللوحات المكررة. إذا كنت تستخدم موزعات مشبك الورق ، فاخذ مفرشة معقمة من الظرف. إذا كنت تستخدم رشاش زجاج ، فقم بإزالته من الكحول ، وأشعل لهبًا ، وبعد احتراق اللهب ، المسه بأجار إحدى اللوحات بعيدًا عن الخلايا. انشر الخلايا على السطح باستخدام أي مفرشة ، مع الحرص على إبقاء الخلايا على بعد 0.5 سم على الأقل من حافة الأجار. (إذا كنت تستخدم ماصة طريقة الطلاء بالصب ، 0.1 مل من المعلق في 0.9 مل من الماء المعقم. اخلط الخلايا في الماء. صب كل الخليط على سطح الأجار ثم قم بإمالة اللوح وتدويره حتى ينتشر الخليط بالتساوي على سطح أجار.)

O. الفحص المجهري للخميرة

أسهل طريقة لفحص الخميرة تحت المجهر هي النظر إليها مباشرة على اللوحة. يعمل هذا فقط مع الأهداف منخفضة الطاقة (10x) لأن الأهداف ذات الطاقة الأعلى تقترب جدًا من الأجار والضباب. لرؤية المزيد من التفاصيل ، قم بعمل شريحة مبللة. ضع قطرة ماء على شريحة مجهر. انقل كمية صغيرة من الخميرة إلى الماء باستخدام عود أسنان معقم وحركه قليلاً. ثم ضع ساترة فوق تعليق الخميرة على الشريحة. إذا كان سيتم عرض الاستعدادات من قبل عدد من الطلاب ، فقم بإغلاق قسيمة الغطاء على الشريحة باستخدام طلاء أظافر الأصابع وستكون الشريحة قابلة للعرض لعدة ساعات. لا ينبغي أن يكون الغمر بالزيت ضروريًا ولمجرد ملاحظة أشكال الخلايا ، ليس من الضروري تلطيخها. باستخدام طرق التلوين المناسبة ، يمكن رؤية النواة ، ولكن يمكن رؤية الخميرة الكروموسومات صغيرة جدًا بحيث لا يمكن رؤيتها باستخدام معظم المجاهر الضوئية.

بالنسبة للعروض التوضيحية في الفصل الدراسي ، قد ترغب في استخدام مجهر فيديو. هناك عدد من مجاهر الفيديو الجيدة جدًا المتوفرة في السوق. إذا لم يكن لديك واحد ، فمن الممكن الحصول على العديد من نفس النتائج باستخدام مجهر الفصل وكاميرا الفيديو المنزلية. عندما ننظر من خلال المجهر ، فإن أعيننا تركز على اللانهاية. إذا وضعنا كاميرا فيديو بالقرب من عين المجهر وضبطنا تركيز الكاميرا على ما لا نهاية ، فسوف "ترى" نفس الشيء مثل أعيننا. يساعد على قطع الضوء الذي يدخل من الجانب عن طريق لف عدسة الكاميرا ومجهر العين بقطعة قماش داكنة أو رقائق الألومنيوم.

تستفيد التجارب من السلالات التالية:

س: تشعيع الخميرة بالأشعة فوق البنفسجية

تعد مصابيح UV-C القياسية لمبيدات الجراثيم ، وهي عبارة عن أنابيب تصريف بخار الزئبق منخفضة الضغط ، مصدرًا مثاليًا للأشعة فوق البنفسجية لإشعاع الخميرة من النوع البري بأنزيمات إصلاح الحمض النووي العادية. تعتبر مصابيح الياردات التي تعمل بالشمس أو الكوارتز من المصادر الجيدة للأشعة فوق البنفسجية لإشعاع سلالات الخميرة المتحولة التي تعاني من نقص في إنزيمات ترميم الحمض النووي الطبيعية.

تعد مصابيح UV-C القياسية القاتلة للجراثيم من أنابيب الفلورسنت الشائعة التي لا تحتوي على طلاء فلوري وبغلاف شفاف للأشعة فوق البنفسجية. طيف الزئبق منخفض الضغط عبارة عن طيف خطي يبلغ طول الخط الأبرز فيه 253.7 نانومتر. هذا قريب من 260 نانومتر وهو الأمثل لامتصاصه الحمض النووي.

كان تصميم الأشعة فوق البنفسجية. تملي غرفة الإشعاع عدة اعتبارات ، أهمها السلامة. (ارى تعليمات لبناء غرفة إشعاع فوق البنفسجي) سوف يسبب الإشعاع المنبعث من المصابيح المبيدة للجراثيم حروقًا مؤلمة وخطيرة للعينين والجلد ، لذا يجب حمايتها بشكل فعال. لا يمكن التحكم في التعرض للخلايا عن طريق تشغيل المصباح وإيقاف تشغيله لأن شدة خرج المصباح تعتمد بشدة على درجة الحرارة. لذلك ، يجب وضعه في صندوق محمي بآلية مصراع حتى يمكن تسخينه إلى درجة حرارة ثابتة قبل استخدامه. يجب أن يكون الباب والغالق متشابكين بحيث لا يمكن فتحهما في نفس الوقت.

إجراءات التشغيل لغرفة الأشعة فوق البنفسجية:

1. قم بتوصيل المصباح وتشغيله. يمكنك معرفة وقت تشغيل المصباح بأمان من خلال رؤية ضوء المؤشر.
2. اترك المصباح يسخن لمدة 30 دقيقة ، إن أمكن.
3. قم بتوسيط طبق بتري ليتم كشفه على العلامة الموجودة في أسفل الصندوق ، ثم قم بإزالة غطاء اللوحة ، ثم قم بخفض الباب برفق ، وافتح المصراع. قم بقياس وقت التعريض الضوئي من وقت فتح المصراع. عندما ينقضي الوقت ، أغلق المصراع ، ارفع الباب برفق ، ضع الغطاء على طبق بتري وقم بإزالته. يؤدي تحريك الباب بسرعة كبيرة إلى حدوث اضطراب في الهواء والذي من المحتمل أن يتسبب في تلوث ألواح الأجار. إذا كان الصندوق مزودًا بمصباح UV-B ، فيمكن اتباع نفس الإجراء.

إجراء التعرض باستخدام أشعة الشمس أو مصابيح الهالوجين الكوارتز:

1. قم بتغطية الطبق بورق داكن ، وحين يظل مغطى ، ضع الطبق بزاوية 90 درجة من مصدر الضوء. إذا كنت تستخدم ضوء هالوجين كوارتز ، فقم بإزالة الغطاء الزجاجي من الضوء. في حين أن الشمس وضوء الفناء ينتجان أقل من الأشعة فوق البنفسجية من أنبوب مبيد الجراثيم ، فلا يزال يتعين على المرء اتخاذ الاحتياطات المعقولة. لا تنظر مباشرة إلى المصدر وتجنب أي تعرض مباشر طويل الأمد للجلد.

تنبيه: لمبة الهالوجين الكوارتز تسخن بشدة. يجب أن يكون استخدام هذا المصباح تحت الإشراف المباشر للمعلم.

2. قم بإزالة الغطاء الداكن من اللوحة وابدأ في قياس وقت التعرض. عند انقضاء الوقت ، غطي الطبق وانقله إلى الحاضنة. ليس من الضروري عادةً إزالة الغطاء عن أطباق بتري البلاستيكية عند استخدام أشعة الشمس أو مصابيح الهالوجين المصنوعة من الكوارتز كمصدر للأشعة فوق البنفسجية. معظم أطباق بتري البلاستيكية شفافة بالنسبة للأطوال الموجية للأشعة فوق البنفسجية التي تنتجها هذه المصادر. قد ترغب في إجراء تجربة تجريبية على كل دفعة جديدة من أطباق بتري. إذا كنت تحصل على معدلات بقاء أعلى مما تتوقع ، فقد ترغب في إزالة الجفن أثناء التعرض للأشعة فوق البنفسجية. إذا أصبح التلوث مشكلة ، فقد ترغب في تغطية الأطباق بغلاف بلاستيكي رفيع أو كيس شطيرة. لن تمتص هذه الأغشية البلاستيكية الرقيقة كميات كبيرة من الأشعة فوق البنفسجية.


الاستعمار والحكم الذاتي المبكر

مع بداية القرن السابع عشر وجدت ثلاث دول - فرنسا وإسبانيا وإنجلترا - تتنافس على الهيمنة في أمريكا الشمالية. من بين هؤلاء إنجلترا ، الأكثر تأخرًا على الساحة ، سيطرت أخيرًا على بدايات ما يعرف الآن بالولايات المتحدة. فشل الفرنسيون ، المنزعجون من الحروب الخارجية والمشاجرات الدينية الداخلية ، لفترة طويلة في إدراك الإمكانات العظيمة للقارة الجديدة ، ونمت مستوطناتهم في وادي سانت لورانس بشكل ضعيف. كان الإسبان منشغلين بأمريكا الجنوبية والأراضي التي يغسلها البحر الكاريبي وخليج المكسيك. لكن الإنجليز ، بعد إخفاقاتهم الأولية تحت قيادة السير همفري جيلبرت والسير والتر رالي ، زرعوا مستوطنات ثابتة على طول الطريق من ولاية ماين إلى جورجيا ، وغذوها بتدفق مستمر من الناس ورأس المال ، وسرعان ما استوعبوا المشروع الاستعماري الأصغر للهولنديين في وادي هدسون والجهد السويدي الصغير على نهر ديلاوير. في غضون قرن ونصف ، كان لدى البريطانيين 13 مستعمرة مزدهرة على ساحل المحيط الأطلسي: ماساتشوستس ، نيو هامبشاير ، رود آيلاند ، كونيتيكت ، نيويورك ، بنسلفانيا ، ديلاوير ، نيو جيرسي ، ميريلاند ، فيرجينيا ، نورث كارولينا ، ساوث كارولينا ، وجورجيا.

في وقت قصير ، دفع المستعمرون من قطاع مياه المد نحو جبال الأبالاتشيون ، وفي النهاية عبروا الجبال عن طريق كمبرلاند جاب ونهر أوهايو. لقد أصبحوا ، عقدًا بعد عقد ، أقل أوروبية في العادات والتوقعات ، وأصبحوا أكثر أمريكية - فالحدود على وجه الخصوص وضعت بصمتها عليهم. إن تحررهم من معظم الميراث الإقطاعي لأوروبا الغربية ، والاعتماد على الذات الذي اكتسبوه بالضرورة في الطبيعة الخاضعة للإخضاع ، جعلهم فرديين للغاية.


نواقل التعبير: 5 أشياء يجب معرفتها | استنساخ

غالبًا ما يكون نتاج الجين المستنسخ ، وليس الجين نفسه ، هو الذي يهمنا بشكل أساسي - خاصةً عندما يكون للبروتين قيمة تجارية أو علاجية أو بحثية.

مع زيادة فهم أساسيات استقلاب الحمض النووي ، والحمض النووي الريبي ، والبروتين وتنظيمها ، يمكن للباحثين الآن معالجة الخلايا للتعبير عن الجينات المستنسخة من أجل دراسة منتجات البروتين الخاصة بهم.

تم تصميم نواقل التعبير بحيث يمكن نسخ أي إدخال مستنسخ إلى RNA ، وفي كثير من الحالات ، حتى ترجمته إلى بروتين. يمكن إنشاء مكتبات تعبير (كدنا) في نواقل مصممة خصيصًا مشتقة من البلازميدات أو العاثيات.

يمكن تصنيع البروتينات المشفرة بواسطة استنساخ cDNA المختلفة داخل مكتبات التعبير هذه في الخلايا المضيفة ، وإذا توفرت فحوصات مناسبة لتحديد بروتين معين ، فيمكن تحديد استنساخ cDNA المقابل وعزله. نواقل التعبير المصممة لتعبير RNA أو التعبير البروتيني ، أو كليهما ، متوفرة.

الشيء # I. تعبير RNA:

يمكن إنشاء ناقل للتعبير في المختبر عن إدراج الحمض النووي كنصوص من الحمض النووي الريبي عن طريق وضع محفز عالي الكفاءة بجوار موقع استنساخ متعدد الاستخدامات. الشكل 4.14 يصور متجه التعبير هذا. يتم نسخ ناقل الحمض النووي المؤتلف الخطي في المختبر باستخدام SP6 RNA polymerase. يمكن الحصول على كميات كبيرة من منتج الحمض النووي الريبي بهذه الطريقة إذا تم استخدام الريبونوكليوتيدات المشعة كركائز ، وجزيئات الحمض النووي الريبي المفيدة أثناء صنع المجسات.

شيء # ثانيًا. تعبير البروتين:

نظرًا لأن cDNAs هي نسخ DNA من mRNAs ، فإن cDNAs هي نسخ غير متقطعة من exons للجينات المعبر عنها. نظرًا لأن cDNAs تفتقر إلى الإنترونات ، فمن الممكن التعبير عن إصدارات cDNA من الجينات حقيقية النواة في مضيفات بدائية النواة التي لا يمكنها معالجة النسخ الأولية المعقدة للجينات حقيقية النواة. للتعبير عن بروتين حقيقي النواة في الإشريكية القولونية ، يجب استنساخ حقيقيات النوى (كدنا) في ناقل تعبير يحتوي على إشارات تنظيمية لكل من النسخ والترجمة.

وفقًا لذلك ، يتم تصميم المروج الذي يبدأ فيه بوليميريز الحمض النووي الريبي النسخ بالإضافة إلى موقع ربط الريبوسوم لتسهيل الترجمة في المتجه مباشرةً من موقع التقييد لإدخال الحمض النووي الغريب. يساهم إدخال كودون AUG الذي يحدد الحمض الأميني الأول في البروتين (موقع بدء الترجمة) (الشكل 4.15).

تم بناء محفزات قوية تدفع تخليق البروتينات الأجنبية إلى مستويات تساوي 30٪ أو أكثر من إجمالي البروتين الخلوي للإشريكية القولونية. مثال على ذلك هو المحفز الهجين ، ptac ، الذي تم إنشاؤه عن طريق دمج جزء من المحفز لجينات الإشريكية القولونية التي ترميز إنزيمات استقلاب اللاكتوز (محفز اللاكتوز) مع جزء من المحفز للجينات التي تشفر إنزيمات تخليق التربتوفان الحيوي ( مروج trp) (الشكل 4.16).

في الخلايا التي تحمل نواقل تعبير ptac ، لا يتم تحفيز محفز ptac لدفع نسخ الإدخال الأجنبي حتى تتعرض الخلايا للمحفزات التي تؤدي إلى تنشيطها. تعد نظائر اللاكتوز (a β-galactoside) مثل isopropyl- β-thiogalactoside ، أو IPTG ، محفزات ممتازة لـ ptac. وبالتالي ، يمكن التحكم بسهولة في التعبير عن البروتين الغريب. يمثل الإنتاج البكتيري لبروتينات حقيقية النواة القيمة أحد أهم استخدامات تقنية الحمض النووي المؤتلف.

على سبيل المثال ، يتم الآن إنتاج الأنسولين البشري للعلاج السريري لمرض السكري في البكتيريا. تشتمل الأنظمة المماثلة للتعبير عن الجينات الأجنبية في الخلايا حقيقية النواة على ناقلات تحمل عناصر محفز مشتقة من فيروسات الثدييات ، مثل فيروس القرد 40 (SV40) وفيروس إبشتاين بار والفيروس المضخم للخلايا البشري (CMV).

يستخدم نظام للتعبير عالي المستوى للجينات الأجنبية خلايا حشرية مصابة بناقل التعبير الفيروسي. تصيب الفيروسات العصوية الحشرات قشريات الأجنحة (الفراشات والعث). في نواقل الفيروس البكتيري المهندسة ، يتم استنساخ الجين الأجنبي في اتجاه مجرى المروج لـ polyhedrin ، وهو بروتين هيكلي كبير مشفر فيروسيًا ، ويمكن أن يؤدي دمج الناقل المؤتلف إلى تراكم منتج الجين الأجنبي إلى مستويات تصل إلى 500 مجم / لتر.

شيء # ثالثا. فحص مكتبات التعبير (كدنا) بالأجسام المضادة:

غالبًا ما تتوفر الأجسام المضادة التي تتفاعل بشكل تبادلي مع بروتين معين مهم. إذا كان الأمر كذلك ، يمكن استخدام هذه الأجسام المضادة لفحص مكتبة تعبير cDNA لتحديد وعزل نسخ cDNA التي تشفر البروتين. يتم إدخال مكتبة (كدنا) في البكتيريا المضيفة ، والتي يتم تطهيرها وتنمو بين عشية وضحاها ، كما هو الحال في مخطط تهجين المستعمرة الموصوف سابقًا.

توضع أغشية النايلون المرتبطة بالحمض النووي على الألواح للحصول على نسخة طبق الأصل من المستعمرات البكتيرية. ثم يتم تحضين غشاء النايلون في ظل ظروف تحفز تخليق البروتين من إدخالات cDNA المستنسخة ، ويتم معالجة الخلايا لتحرير البروتين المركب.

يرتبط البروتين المركب بإحكام بغشاء النايلون ، والذي يمكن تحضينه بعد ذلك مع الجسم المضاد المحدد. يكشف ارتباط الجسم المضاد بمنتج البروتين المستهدف عن موضع أي مستنسخات (كدنا) تعبر عن البروتين ، ويمكن استعادة هذه الحيوانات المستنسخة من اللوحة الأصلية. مثل المكتبات الأخرى ، يمكن فحص مكتبات التعبير باستخدام مجسات قليلة النوكليوتيد أيضًا.

شيء # رابعا. تعبير البروتين الانصهار:

تحمل بعض نواقل التعبير إدخالات cDNA المستنسخة مباشرة في تسلسل الترميز لجين ترميز البروتين المحمول بالنواقل (الشكل 4.17). تؤدي ترجمة التسلسل المؤتلف إلى تخليق بروتين هجين أو بروتين اندماجي. تمثل المنطقة الطرفية N للبروتين المنصهر متواليات الأحماض الأمينية المشفرة في المتجه ، بينما يتم ترميز باقي البروتين بواسطة الإدخال الأجنبي.

ضع في اعتبارك أن تسلسل الكودون الثلاثي داخل الإدخال المستنسخ يجب أن يكون في طور مع الكودونات التي تساهم بها متواليات المتجهات لصنع البروتين الصحيح. يمكن اختيار تسلسل البروتين N-terminal الذي يساهم به الناقل ليلائم الأغراض. علاوة على ذلك ، فإن إضافة تسلسل إشارة N-terminal الذي يستهدف البروتين الهجين للإفراز من الخلية يبسط استعادة بروتين الاندماج.

تم تطوير مجموعة متنوعة من أنظمة الاندماج الجيني لتسهيل عزل بروتين معين مشفر بواسطة إدراج مستنسخ. تعتمد إجراءات العزل على تنقية كروماتوجرافيا التقارب لبروتين الاندماج من خلال استغلال خصائص الارتباط والربط الفريدة للبروتين المشفر بالناقل (الجدول 4.2).

شيء # V. 1 -β-Galactosidase واختيار أزرق أو أبيض:

تضع نسخة واحدة من نواقل التعبير عن بروتين الاندماج موقع الاستنساخ في نهاية منطقة ترميز البروتين β-galactosidase ، بحيث يتم ربط بروتين الاندماج بـ β-galactosidase ويمكن استعادته عن طريق تنقية β-galactosidase نشاط.

بدلاً من ذلك ، فإن وضع موقع الاستنساخ داخل منطقة ترميز β-galactosidase يعني أن الإدخالات المستنسخة تعطل تسلسل الأحماض الأمينية β-galactosidase ، مما يؤدي إلى تعطيل نشاطه الأنزيمي. تم استغلال هذه الخاصية في تطوير بروتوكول الفحص البصري الذي يميز تلك الحيوانات المستنسخة في المكتبة التي تحمل إدخالات من تلك التي تفتقر إليها.

الخلايا التي تم تحويلها باستخدام مكتبة cDNA للتعبير عن β-galactosidase القائمة على البلازميد (أو المصابة بمكتبة مماثلة تم إنشاؤها في ناقل اندماج β-galactosidase القائم على البكتيريا) مطلية على وسائط تحتوي على 5-برومو-4-كلورو -3 -indolyl-β-D-galactopyranoside أو X-gal (الشكل 4.18).

X-gal عبارة عن ركيزة كروموجينية ، وهي مادة عديمة اللون تنتج منتجًا ملونًا عند التفاعل الإنزيمي. بعد التحريض باستخدام IPTG ، تؤوي المستعمرات البكتيرية (أو اللويحات) نواقل يكون فيها جين β-galactosidase سليمًا (تلك النواقل التي تفتقر إلى الإدخالات) تعبر عن β-galactosidase النشط الذي يشق X-gal ، مما يحرر 5-bromo-4-chloro- indoxyl ، والتي تتضاءل لتشكيل منتج أزرق نيلي.

تمثل هذه المستعمرات الزرقاء (أو اللوحات) المستنسخات التي تفتقر إلى الإدخالات. يتم تعطيل جين P-galactosidase في الحيوانات المستنسخة التي تحتوي على إدخالات ، لذا فإن تلك المستعمرات (أو اللويحات) المتبقية & # 8220 white & # 8221 (في الواقع ، عديمة اللون) هي مستنسخات معادة الارتباط.


شاهد الفيديو: How to Count and Pick Colonies (قد 2022).