معلومة

ما هي استخدامات الإسقاطات الحلزونية في علم الأحياء الإنشائي؟

ما هي استخدامات الإسقاطات الحلزونية في علم الأحياء الإنشائي؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لقد رأيت إسقاطات العجلة الحلزونية المستخدمة لتوضيح الحلزونات الأمفيباثية في البروتينات. هل هناك استخدامات أخرى لهذه النماذج؟


يمكن أن تكون إسقاطات العجلة الحلزونية مفيدة في أي وقت يكون لديك فيه بروتين أو ببتيد مع منطقة حلزونية ألفا أو أكثر. إنها تسمح لك بمعرفة ما إذا كانت أي "خاصية" موجودة على طول جانب واحد من الببتيد. يمكن أن يكون هذا مفيدًا في التعرف على الأشكال المحتملة للتفاعل بين البروتين والبروتين مثل سحابات الليوسين.

تبدو مقالة ويكيبيديا عن "العجلات الحلزونية" أيضًا مكانًا جيدًا لبدء تعلم المزيد حول هذا الموضوع.


يحتوي المجال الطرفي C لصميم البروتين الشحمي A-I على مشغل توافقي حساس للدهون

يمكن أن تتحول البروتينات الدهنية القابلة للتبديل بين الحالات المرتبطة بالدهون والخالية من الدهون. يلعب المجال الطرفي C لصميم البروتين الشحمي البشري A-I (apoA-I) دورًا في كل من الارتباط الدهني والارتباط الذاتي. تم استخدام التحليل الطيفي بالرنين المغنطيسي المغنطيسي الإلكترون الموجه بالموقع لفحص بنية نهاية apoA-I C في الحالات الخالية من الدهون والمرتبطة بالدهون. تم استخدام ملصقات Nitroxide المغزلية الموضوعة في مواقع محددة في جميع أنحاء المحطة C لتحديد العناصر الهيكلية الثانوية المنفصلة. أعطت التفاعلات المغناطيسية بين المجسات المترجمة في المواضع 163 و 217 و 226 في كل من apoA-I المسمى بشكل منفرد ومضاعف معلومات المسافة بين الجزيئات وداخل الجزيئات ، مما يوفر أساسًا لرسم خرائط لهيكل apoA-I الثالث والرباعي. كشفت أطياف apoA-I في HDL المعاد تكوينه عن انتقال مستحث بالدهون لملفات عشوائية وخيوط إلى حلزونات ألفا. يُعد هذا التبديل المطابق مشابهًا للأحداث التي تم تشغيلها في بروتينات الاندماج الفيروسي وقد يعمل كوسيلة للتغلب على حواجز الطاقة لعزل الدهون ، وهي خطوة حاسمة في تدفق الكوليسترول وتجميع HDL.


بروتينات الغشاء: "الغرب المتوحش" للبيولوجيا البنيوية

تاريخيًا ، تعرقلت مهمة تحديد بنية البروتينات الغشائية بسبب الصعوبات التجريبية المرتبطة بمجالاتها المضمنة بالدهون. هنا ، نقدم لمحة عامة عن الأدوات التجريبية والتنبؤية التي تم تطويرها مؤخرًا والتي تعمل على تغيير وجهة نظرنا في هذه المنطقة غير المكتشفة إلى حد كبير - "الغرب المتوحش" لعلم الأحياء البنيوي. يتم استخدام علم البلورات وطرق الجسيم الواحد والفحص المجهري للقوة الذرية لدراسة البروتينات الغشائية الضخمة بتفاصيل متزايدة. توفر استراتيجيات الرنين المغناطيسي النووي للحالة الصلبة قيودًا توجيهية لتحديد بنية حلزونات ألفا عبر الغشاء (TM) وقياسات دقيقة للمسافات داخل الجزيئية ، حتى في الأنظمة شديدة التعقيد. يتم تحديد قيود المسافة الأطول عن طريق الرنين المغنطيسي الإلكترون الموجه بالموقع ، لكن استراتيجيات وضع العلامات الحالية لا تزال تشكل بعض القيود. طرق أخرى ، مثل ثنائية اللون بالأشعة تحت الحمراء الخاصة بالموقع ، تتيح التحليل التوجيهي لـ TM α-helices في طبقات ثنائية متوافقة ، بالإضافة إلى الأدوات الحسابية والتنبؤية الجديدة التي تستخدم بيانات الحفظ التطوري ، يتم استخدامها لتحليل حزم TM α-helical.


هيكل قناة KcsA داخل الخلايا في الحالة المفتوحة

تحفز القنوات الأيونية النقل الانتقائي للأيونات عبر الغشاء استجابةً لمجموعة متنوعة من المحفزات. بوابة القنوات هذه عن طريق التحكم في وصول الأيونات إلى مسام مملوءة بالمياه في موقع مركزي. الهيكل البلوري لـ Streptomyces lividans سمحت قناة البوتاسيوم (KcsA) بالاستكشاف الجزيئي لهذه الآلية. كشفت دراسات الرنين المغنطيسي الإلكترون (EPR) عن تغيرات توافقية كبيرة في النهاية داخل الخلايا من الحلزون عبر الغشاء الثاني (TM2) عند البوابة. لقد استخدمنا وضع العلامات الدورانية الموجهة بالموقع (SDSL) والتحليل الطيفي EPR في محاولة لتحديد الترتيبات الهيكلية لحزمة KcsA TM2 الكامنة وراء الانتقال من الحالة المغلقة إلى الحالة المفتوحة. في ظل الظروف التي تفضل المطابقة المغلقة والمفتوحة ، تم الحصول على 10 مسافات بين الوحدات الفرعية عبر مقاطع TM2 من التركيبات ثنائية الترادف. يشير تحليل هذه البيانات إلى آلية يميل فيها كل حلزون TM2 بعيدًا عن مسار التخلل ، باتجاه مستوى الغشاء ، ويدور حول محوره اللولبي ، مما يدعم حركة من نوع المقص بنقطة محورية بالقرب من المخلفات 107-108. هذه الحركات مصحوبة بزيادة كبيرة في قطر الدهليز أسفل التجويف المركزي المملوء بالماء.


نتائج

المقطع S2 في شاكر تمتد بقايا 278-300 (الشكل 1 ب). في بروتينات الغشاء المتكاملة ذات البنية المعروفة ، تميل البقايا المعرضة للدهون في حلزونات الغشاء إلى أن تكون أكثر كارهة للماء وأقل حفظًا من البقايا التي تواجه الجزء الداخلي من البروتين (Rees et al. ، 1989 Taylor et al. ، 1994 Wallin et al. ، 1997). تبرز مقارنة متواليات S2 في قنوات K + البقايا المتغيرة (الشكل 1 ب) ، والتي عند تعيينها على إسقاط حلزوني تقع في الغالب على وجه واحد (الشكل 1 ج). تسعى التجارب الحالية لاختبار هذا الاقتراح المستند إلى التسلسل من أجل التصرف الحلزوني ألفا لـ S2. ننطلق من فكرة أن استبدال التربتوفان الضخم والمقاوم للماء من المرجح أن يعطل بنية القناة (وبالتالي وظيفة الاستئصال) عند وضعه في مواضع معبأة مقابل أجزاء أخرى من البروتين أكثر من وضعه في المناطق المعرضة للدهون. لذلك قمنا بتحور كل بقايا S2 بشكل فردي إلى التربتوفان (أو التربتوفان الفردي للألانين) ، وتوقعنا أن المواقف المتسامحة وظيفيًا للطفرة سوف تتخللها ، ربما في دورية حلزونية ، مع المواقف التي تميزت بالفشل في التعبير عن K + الحالي. على الرغم من عدم تبريره بشكل صارم ، إلا أن هذا التوقع معقول حيث لوحظت أنماط الاستبدال والتسامح هذه مع العديد من بروتينات الغشاء ، في الأصل مع بقايا منتقاة عشوائيًا (Hinkle et al. ، 1990) ، ومؤخراً مع التربتوفان المُدرج على وجه التحديد (Choe et al. ، 1995 Sharp et al.، 1995 Collins et al.، 1997).

نتائجنا تتعارض مع هذا التوقع. من بين الاستبدالات الـ 23 التي تم إجراؤها ، فشل واحد فقط (R297W) في التعبير عن التيار بـ Xenopus البويضات. تظهر التيارات التمثيلية استجابة لنبضات الجهد المزيلة للاستقطاب في الشكل 2 للقناة من النوع البري واثنين من المسوخ. تعرض هذه القنوات المتحولة الخاصة تبعيات الجهد المتغيرة ، حيث يكون منحنى التنشيط لـ I287W مقلوبًا لليمين بمقدار 27 مللي فولت ، بينما يتم إزاحة منحنى التنشيط لـ E293W بمقدار 22 مللي فولت. يتم تغيير هذين الطافرين بطرق أخرى ينخفض ​​منحدر منحنى التنشيط في I287W ، ويتم إبطاء حركية التنشيط وإلغاء التنشيط لـ E293W بشكل كبير. تم جمع تسجيلات مماثلة للقنوات المتبقية المستبدلة بـ Trp. تم تحليل تأثيرات البدائل باستخدام عدة معاملات تجريبية: Δجيا (طاقة الفتح الخالية من الجهد صفر) ، را (يتم قياس نصف وقت التنشيط عند نصف نقطة على منحنى التنشيط) ، ود (ثابت وقت التعطيل عند 70 مللي فولت). يتم عرض هذه المعلمات في الجدول الأول لجميع القنوات الطافرة. الشكل 3 أ يرسم طاقة استقرار الحالة المفتوحة ΔΔجيا أي الفرق في Δجيا بين النوع الطافر والبرية. إجمالاً ، 13 قناة متحولة لها خصائص فيزيولوجية كهربية مشابهة للنوع البري نحدد هذه البقايا على أنها "منخفضة التأثير" أو "متسامحة" ، مع | ΔΔجيا| & لتر 1 كيلو كالوري / مول. المواضع التسعة المتبقية "عالية التأثير" (E283 و T284 و C286 و I287 و W289 و F290 و E293 و L294 و A300) لها خصائص مختلفة اختلافًا جوهريًا عن النوع البري. هذا القطع الثنائي بين هذين النوعين من المخلفات هو بالطبع تعسفي ، لكنه يقع بشكل طبيعي خارج النتائج التي لا تتغير استنتاجاتنا الإجمالية إذا ضاعفنا أو خفضنا قيمة القطع هذه إلى النصف. في معظم القنوات ذات خصائص تنشيط التوازن المتغيرة ، تم أيضًا تغيير المعلمات الحركية أكبر من ضعفين (الشكل 3 و B و C). نؤكد أن القصد من تحليل البوابات هذا تجريبي ، وليس آليًا: لتحديد المواقف التي تنتج فيها الطفرات تغييرات واضحة وجسيمة في البوابة ، وليس لفهم الخطوات في مسار التنشيط التي يتم تغييرها بواسطة الطفرات.

تحمل معظم المواضع المتسامحة بقايا كبيرة كارهة للماء (الشكل 1) ، وبالتالي فإن تحورها إلى Trp يسبب تغيرات معتدلة فقط في حجم السلسلة الجانبية. لذلك فقد تحدنا هذه المواقف بتغييرات جذرية في كيمياء السلاسل الجانبية. قمنا ببناء مجموعة من بدائل Asn المفردة التي من شأنها تغيير حجم السلسلة الجانبية وقطبية المواضع المتسامحة لـ Trp: L285N و I288N و F292N و V296N و F298N و L299N. من اللافت للنظر أن جميع المسوخات الستة عبرت عن قنوات تظهر خصائص فيزيولوجية كهربية مشابهة لتلك الخاصة بالقناة من النوع البري (الشكل 4 والجدول II).


المواد والأساليب

P. tetraurelia تحضير الوحدة القشرية

اثنين P. tetraurelia تم استخدام سلالات: d4-2 سلالة مرجعية من النوع البري و Δ-CenBP1. نمت الخلايا أضعافًا مضاعفة عند 27 درجة مئوية في تسريب عشب القمح (وسط BHB) ، تم تجفيفه باستخدام الكلبسيلة الرئوية، وتستكمل بـ بيتا-سيتوستيرول (0.4 ميكروغرام / مل). تم طرد الخلايا لمدة دقيقتين عند 137ز باستخدام جهاز الطرد المركزي Sigma 6-15 وغسلها مرتين في منطقة Dryl العازلة لإزالة معظم البكتيريا. تمت إزالة أكياس المثقبيات بواسطة tris CaCl2 عازلة [10 ملم (الرقم الهيدروجيني 7.4) و CaCl2 1 مم] مدعوم بـ 0.025٪ من amino-ethyldextran. تم انتشال الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، و P. tetraurelia تم تحضير القشرة وفقًا لـ (24) مع التعديلات التالية: تم تعليق الخلايا في حجم متساوٍ من المخزن المؤقت للتحلل الذي يحتوي على 0.25 M من السكروز ، و 1 ملي مولار Hepes (الرقم الهيدروجيني 7.2) ، و 5 ملي مولار من مثبطات الأنزيم البروتيني (Roche cOmplete) ونقلها إلى الخالط Potter-Elvehiem ثم غادر لمدة 15 دقيقة على الجليد. كانت هناك حاجة إلى حوالي 400 ضربة يدوية لكسر الفتح و gt95 ٪ من الخلايا. بعد التحلل ، تمت إضافة 1 M K-PIPES (الرقم الهيدروجيني 7.2) للحصول على تركيز نهائي قدره 10 ملي مولار K-PIPES. تم غسل قشرة الخلية مرتين في محلول مؤقت لإعادة التعليق يحتوي على محلول تحلل مع 10 ملي مولار من K-PIPES واستعادته بالطرد المركزي عند 410ز في جهاز طرد مركزي مبرد من إبندورف. تم تعليق قشرة الخلية في 500 ميكرولتر من نفس المخزن المؤقت. للحصول على الوحدات القشرية ، تم صوتنة القشرة لمدة 5 ثوانٍ على الجليد مع نبضة فعالة 1 ثانية وإيقاف مؤقت لمدة 1 ثانية عند 30٪ من السعة باستخدام معالج Vibra-Cell. تم تخزين الوحدات القشرية في 10 ملي مولار K-PIPES 60 ٪ سكروز (وزن / وزن) عند -80 درجة مئوية.

تم التحقق من جودة القشرة والوحدات القشرية عن طريق التألق المناعي بعد الترسيب عند 10000ز لمدة 15 دقيقة في دوار يتأرجح (Beckman JS-13.1) على أغطية زجاجية في أنابيب Corex سعة 15 مل مزودة بمحولات كما هو موضح سابقًا (25). كانت الوحدات القشرية ملطخة باستخدام مضاد لل epiplasmin ، وكانت المريكزات ملطخة باستخدام الأجسام المضادة ID5. نظرًا لأن كلا الجسمين المضادين تم إنتاجهما في الفئران وكلاهما يتعرف على الهياكل المتميزة ، فقد تمت إضافة الأجسام المضادة بالتتابع.

P. tetraurelia Centriole cryo-ET

P. tetraurelia تم تخفيف المريكزات بنسبة 1: 5 في 10 مم K-PIPES مع حبات الذهب الغروية 10 نانومتر (أوريون). تم ترسيب Centrioles على شبكات الكربون ذات 300 شبكة (Electron Microscopy Sciences) ، وتم مسحها من الخلف ، وتم تزجيجها في الإيثان السائل عن طريق التجميد اليدوي. تم نقل الشبكات إلى مجهر إلكتروني للإرسال FEI Titan Krios بقدرة 300 كيلو فولت (مركز التصوير الخلوي و NanoAnalytics ، Biozentrum ، جامعة بازل) المجهز بكاشف الإلكترون المباشر Gatan K2 Summit. تم الحصول على سلسلة إمالة أحادية المحور باستخدام SerialEM (26) ، بزيادات قدرها 2 درجة من -60 درجة تقريبًا إلى + 60 درجة (ثنائية الاتجاه ، مفصولة عند 0 درجة). كان التكبير × 29000 بحجم بكسل جسم 3.45 Å وجرعة تراكمية من 70 إلى 120 إلكترونًا / Å 2.

C.reinhardtii زراعة الخلايا

في الموقع cryo-ET من C.reinhardtii تم تنفيذ المريكزات في mat3-4 سلالة (CC-3994) (27) تم الحصول عليها من مركز موارد Chlamydomonas ، جامعة مينيسوتا ، مينيسوتا. تحتوي هذه السلالة على خلايا أصغر (

بقطر 5 ميكرومتر) ، مما يحسن التزجيج ويزيد من احتمال ضرب مركز بطحن شعاع أيوني مركّز (FIB). نمت الخلايا في وسط تريس-أسيتات-فوسفات ، فقاعات مع جو طبيعي ، وتعرضت لضوء ثابت (

C.reinhardtii تزجيج الخلية والطحن بالتبريد FIB

عندما وصلت مزارع الخلايا إلى مرحلة منتصف السجل ، تم تزجيجها باستخدام Vitrobot Mark 4 (FEI Thermo Fisher Scientific). ثقافة الخلية (4 ميكرولتر من

تم مسح 1000 خلية / ميكرولتر) من المؤخرة على شبكات EM من النحاس ذات 200 شبكة مغلفة بكربون هول (R2 / 1 ، أدوات Quantifoil Micro) وتجميدها في خليط سائل من الإيثان / البروبان. تم إجراء تحضير عينة Cryo-FIB كما هو موضح سابقًا (13) باستخدام إما FEI Scios أو FEI Quanta مزدوج الحزمة FIB / Scanning EM. تم تركيب شبكات EM في حلقات دعم AutoGrid (FEI Thermo Fisher Scientific) ، وتم تحميلها في FIB باستخدام مكوك مبرد ، ثم تم تغليفها بطبقة بلاتين معدني عضوي باستخدام نظام حقن الغاز (FEI Thermo Fisher Scientific). تم ترقق الخلايا في خطوات متعددة باستخدام حزمة أيونات الغاليوم لإنتاجها

أقسام خلوية بسمك 100 إلى 200 نانومتر (lamellas).

C.reinhardtii cryo-ET

تم نقل شبكات EM إلى مجهر إلكتروني للإرسال FEI Titan Krios بقدرة 300 كيلو فولت (قسم البيولوجيا الهيكلية الجزيئية ، معهد ماكس بلانك للكيمياء الحيوية) ، ومجهز بمرشح طاقة بعد العمود (كوانتوم ، جاتان) وكاميرا كاشف مباشر (قمة K2 ، جاتان). باستخدام برنامج SerialEM (26) ، تم الحصول على سلسلة الإمالة بخطوات 2 درجة بين -60 درجة و + 60 درجة (ثنائية الاتجاه ، مفصولة عند -0 درجة أو -20 درجة). بالإضافة إلى ذلك ، تم تنفيذ مخطط الميل المتماثل للجرعة لمجموعة فرعية من المريكزات المكتسبة (28). تم تسجيل إمالات فردية في وضع الفيلم بمعدل 12 إطارًا / ثانية ، بحجم بكسل كائن 3.42 Å وإلغاء ضبط بؤري من 5 إلى −6 ميكرومتر. تراوحت الجرعة الإجمالية المتراكمة لكل سلسلة إمالة بين 80 و 130 إلكترونًا / 2 اعتمادًا على سمك العينة. تم استخدام العديد من ثقافات الخلايا المختلفة وجلسات التصوير لإنتاج مجموعة البيانات. تم الحصول على كل صورة مقطعية في الموقع من منفصلة C.reinhardtii الخلية وبالتالي فهي نسخة بيولوجية وتقنية.

ن. جروبيري ثقافة الخلية والتمايز

ن. جروبيري تم تمييز الخلايا (سلالة NEG المقدمة من C.Fulton ، جامعة برانديز) من الأميبات إلى سوط باستخدام بروتوكول قياسي (29). نمت الأميبات على وسط صلب مع كليبسيلا البكتيريا كمصدر للغذاء بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية حتى تصبح الأطباق

80٪ خالٍ من البكتيريا. تمت إضافة محلول التمايز المثلج البارد [2 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 7.2) و 10 ملي مولار كلوريد الصوديوم] إلى الألواح ، وتم كشط الخلايا باستخدام مفرشة زجاجية وصبها في أنابيب مخروطية بلاستيكية سعة 50 مل. باستخدام جهاز طرد مركزي لشركة المعدات الدولية CLINICAL (طراز IEC CL) تم تعديله بفرامل يدوية ، تم تكوير الأميبات لمدة دقيقة واحدة ثم غسلها سريعًا مرتين باستخدام عازلة تمايز الجليد البارد (تم تعليقها بالدوامة وتكويرها لمدة 45 ثانية) لإزالة البكتيريا. تم بعد ذلك تعليق الأميبات في محلول تمايز 25 درجة مئوية ، والذي تم وضعه في دورق Erlenmeyer سعة 1 لتر ورجه عند 100 هرتز في حمام مائي 25 درجة مئوية. لضمان التمايز المتزامن (الذي تم تأكيده عن طريق الفحص المجهري الطوري للخلايا الملطخة باليود لوغول) ، تم الاحتفاظ بالوقت من كشط الخلايا إلى هزها في الحمام المائي أقل من 10 دقائق.

عزل وتزجيج ن. جروبيري المريكزون

تم عزل Centrioles بين 50 و 100 دقيقة بعد بدء التمايز للحصول على مريكزات في حالات مختلفة من التجمع (30). تتجمع أزواج المريكزات جنبًا إلى جنب ، مع إكمال المريكز الأول التجميع من 5 إلى 10 دقائق قبل المريكز الثاني (31). بين 60 و 70 دقيقة بعد بدء التمايز ، ترسو المريكزات في غشاء البلازما وتبدأ التكوّن الهدبي. بالنسبة لهذه الدراسة حول بنية MTTs ، قمنا فقط بتحليل المريكزات الناضجة التي بدأت في تنمية MTDs للمحاور الهدبية.

تم تكييف بروتوكول عزل المريكز من عدة دراسات سابقة (14, 32, 33). تم إعادة تعليق الخلايا في محلول تحلل [15 ملي تريس (درجة الحموضة 7.5) ، 10 ملي مولار بوكل ، 2 ملي مولار MgSO4، 1.5 مم EGTA ، 1 ملي ديثيوثريتول ، كوكتيل مثبط البروتياز الخالي من EDTA من روش cOmplete ، و 0.1 ٪ Triton X-100] ومحلول مع 5 إلى 10 ضربات في الخالط Dounce (تم تأكيد تحلل الخلية الكامل باستخدام مجهر تباين الطور من قبل إجراء). تمت إزالة النوى وحطام الخلايا الكبيرة عن طريق تدوير المحللة على وسادة سكروز بنسبة 25٪ عند 1000ز لمدة 15 دقيقة. تم تخفيف المادة الطافية والواجهة في المخزن المؤقت للغسيل (محلول تحلل بدون منظف) في أنبوب دائري من نوع Oak Ridge وتم تكويرها في دوار دلو متأرجح Sorvall HB-4 عند 10000ز لمدة 30 دقيقة. تم إعادة تعليق الحبيبات في 10 مل من المخزن المؤقت للغسيل وتحميلها فوق تدرج سكروز متقطع 40٪ / 50٪ في أنبوب أوك ريدج ، والذي تم طرده مركزيًا في دوار HB-4 عند 16000.ز لمدة 90 دقيقة (بدون فرامل). باستخدام إنارة من أسفل الأنبوب وحقنة بإبرة طويلة ،

تم استخلاص 5 مل من السطح البيني بنسبة 40٪ / 50٪ وتعليقه في مخزن مؤقت للغسيل ثم تكوير مرة أخرى في أنبوب Oak Ridge المغزول عند 10000ز لمدة 30 دقيقة. تم تعليق الحبيبات في حجم صغير (

30 ميكرولتر من محلول الغسيل المضاف إليه 10 نانومتر من الذهب الغرواني [تعليق ألبومين مصل البقر (BSA) ، أوريون]. باستخدام Vitrobot Mark 4 (FEI Thermo Fisher Scientific) ، تم مسح 5 ميكرولتر من هذه العينة على شبكات EM نحاسية 200 شبكة مغلفة بكربون هول (R3.5 / 1 ، أدوات Quantifoil Micro) وتم تجميدها في الإيثان السائل / خليط البروبان.

ن. جروبيري cryo-ET

تم نقل شبكات EM كما هو موضح في ملف C.reinhardtii قسم cryo-ET. تم الحصول على سلسلة الميل بالمثل. تم تسجيل إمالات فردية في وضع الفيلم بمعدل 10 إطارات / ثانية ، مع حجم بكسل للكائن يبلغ 4.21 Å وإلغاء ضبط بؤري من 5 إلى −8 ميكرومتر. كانت الجرعة التراكمية لكل سلسلة إمالة

80 إلى 120 إلكترونًا / 2. تم استخدام العديد من ثقافات الخلايا المختلفة وجلسات التصوير لإنتاج مجموعة البيانات. جاء كل زوج من المريكزات من خلية منفصلة وبالتالي يمكن اعتباره تكرارًا بيولوجيًا.

عزل المريكز البشري

تم عزل المريكزات البشرية من خط الخلايا اللمفاوية KE-37 كما هو موصوف سابقًا (25) ولكن تم تعديلها على النحو التالي. بعد ترسيب سنتريول على وسادة سكروز 60٪ بالطرد المركزي ، تمت إزالة الثلث العلوي من حجم زجاجة الطرد المركزي عن طريق الشفط ، تاركًا 20 إلى 25٪ سكروز بحجم 25 مل تقريبًا. تم بعد ذلك إعادة تعليق وسادة السكروز التي تحتوي على 60٪ والتي تحتوي على مريكزات معزولة حتى يصبح السكروز غير مرئي بواسطة الماصات اللطيفة. كان تركيز السكروز النهائي 30٪. تم تجميد قسامات (500 ميكرولتر) في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية. تم التحقق من كفاءة عزل المريكز بواسطة الفلورة المناعية.

Human centriole cryo-ET

كما هو موضح سابقا (14) ، تم إعادة تعليق جزء قسامة 500 ميكرولتر لأول مرة في 1 مل من 10 ملي مولار من الأنابيب K-PIPES (4 درجات مئوية ، ودرجة الحموضة 7.2) ثم طرده بعد ذلك عند 10.400ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.تم إعادة تعليق الحبيبات التي تحتوي على المريكزات في 20 ميكرولتر من 10 ملي مولار من K-PIPES وتم تخفيفها أيضًا بـ 10 ميكرولتر من خرز الذهب الغرواني 10 نانومتر (أوريون). تم بعد ذلك ترسيب خمسة ميكرولتر من العينة على شبكات كربون لاسي ذات 300 شبكة (علوم المجهر الإلكتروني) ، وتم مسحها من الخلف ، وتم تزجيجها في الإيثان السائل عن طريق التجميد اليدوي الغاطس. تم نقل الشبكات كما هو موضح أعلاه. تم الحصول على سلسلة إمالة أحادية المحور باستخدام SerialEM بزيادات 2 درجة مع مخطط ثنائي الاتجاه من حوالي -60 درجة إلى + 60 درجة مفصولة إلى نصفين عند -20 درجة. تم تسجيل إمالات فردية في وضع الفيلم بمعدل 10 إطارات / ثانية. كان التكبير × 42000 مع حجم بكسل كائن 3.42 Å والجرعة التراكمية من

متوسط ​​مخطط فرعي

تمت محاذاة جميع إطارات سلسلة الميل باستخدام MotionCor2 (34) باستخدام إما تصحيحات 3 × 3 أو محاذاة إطار كامل. بعد ذلك ، تم إعادة بناء جميع مخططات التصوير المقطعي من جميع الأنواع باستخدام etomo ، وهو جزء من حزمة IMOD (35). تم تصحيح وظيفة نقل التباين (CTF) للصور المقطعية باستخدام أدوات CTFplotter و CTFphaseflip من IMOD. لإنشاء مخططات فرعية لـ MTTs ، تم اختيار الأنابيب الدقيقة A و C على طول كل MTT ، مما أدى إلى إنشاء تسع مجموعات من الإحداثيات المقترنة من A-C على طول المنطقة المركزية للمركز ، دائمًا من الجانب القريب إلى الجانب البعيد. على أساس دورية لوحظ في تريشونيمفا MTTs القريبة وعلى تحليلنا لدورات المنطقة الوسطى (الشكل S1) ، قررنا استخراج مخططات فرعية كل 17 نانومتر لتقييد التكرار الهيكلي مع الحفاظ على الوحدة الدورية الكاملة. باستخدام برنامج نصي من Python محلي الصنع ، تم استيفاء مواضع الأنابيب الدقيقة B باتباع دورات وتوجهات MTT التي يحددها المستخدم. كانت المعلومات الموضعية مطلوبة لمعرفة إحداثيات استخراج المخطط الفرعي (حيث أن الأنبوب B الدقيق يتوافق تقريبًا مع مركز MTTs) ، وكانت التدويرات مطلوبة لإعادة تنظيم جميع المخططات الفرعية في نفس الاتجاه (بدء زوايا أويلر للمحاذاة). يشار إلى قيم التدوير هذه لاحقًا باسم "معلمات المحاذاة المسبقة". تم تنظيم المخططات الفرعية بتنسيق .tbl ثم تم استخلاصها ومحاذاتها وتوسيطها باستخدام Dynamo (36). كان عدد المخططات الفرعية والأبعاد والمراجع الأولية خاصة بكل نوع.

بالنسبة إلى P. tetraurelia MTTs ، تم استخراج 1693 مخططًا فرعيًا من 288 × 288 × 288 فوكسل من 14 مركزًا غير مضغوط. بالنسبة إلى C.reinhardtii MTTs ، تم استخراج 1546 مخططًا فرعيًا من 296 × 296 × 296 فوكسل من 11 مركزًا. بالنسبة إلى ن. جروبيري MTTs ، تم استخراج 1168 مخططًا فرعيًا من 260 × 260 × 260 فوكسل من سبعة مراكز. تمت محاذاة مجموعات البيانات الثلاث هذه في البداية باستخدام الجسم الحي السابق C.reinhardtii MTTs الأساسية المركزية كمرجع بداية (emd-5252 ، 18). بعد عدة تكرارات ، تمت محاذاةهم مع خرائطهم المتوسطة التي تم إنشاؤها في كل جولة. تم إجراء التكرارات على معطيات ثنائية ، وتم تطبيق قيم التحولات والدوران النهائية التي تم الحصول عليها على مخططات فرعية غير محدودة.

لضمان صحة الهيكل ، تم إجراء إعادة بناء de novo P. tetraurelia و C. renhadtii MTTs. كما يظهر في الشكل. S7 (I to R) ، كلا النهجين (باستخدام مرجع أو متوسط ​​de novo) أدى إلى نفس إعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد (3D). بالنسبة لمتوسط ​​de novo ، تمت إضافة ترجمة عشوائية (تصل إلى 6 نانومتر) إلى ملف ض موضع كل جسيم من المحاذاة الأولية للتأكد من أن المعدل النهائي لم يكن متحيزًا عن طريق الانتقاء الأولي. باستخدام هذه الجسيمات المترجمة ، تم إنشاء متوسط ​​حجم أول بدون أي دورية. بعد ذلك ، تم تقسيم مجموعة البيانات إلى مجموعتين نصفيتين مستقلتين. بالنسبة للخطوات التالية ، كانت معلمات المحاذاة هي نفسها لكلا النصفين. تمت محاذاة الجسيمات في المتوسط ​​الأول حتى تمت محاذاة أفضل عرض لها (مطلوب ثلاثة تكرارات). نظرًا لأنه تم حل المنظر الجانبي بشكل سيئ ، تم وضع قناع على الهيكل الداخلي ، وتمت محاذاة الجسيمات لجولة أخرى. بعد التحقق من إعادة بناء الدورية بشكل أفضل ، تم إجراء تكرار باستخدام قناع يغطي الثلاثي بأكمله. لاحظ أنه بالنسبة لنهج de novo ، تمت محاذاة الجسيمات باستخدام أبعاد bin2 لـ P. tetraurelia و bin4 أبعاد C.reinhardtii. وفقًا لعلاقة فورييه شل (FSC) = معيار 0.143 ، فإن دقة P. tetraurelia إعادة بناء de novo هو 33 ، ودقة C.reinhardtii إعادة بناء دي نوفو هو 47 Å. لاحظ أن تركيزنا ينصب على السقالة الداخلية وأن الميزات الأخرى مثل دورية البروتين الداخلي للأنابيب الدقيقة (MIP) يمكن أن تكون مفروضة من خلال دورية السقالة الداخلية. لذلك ، نحن لا نستنتج أي شيء عن هذه السمات الهيكلية الأخرى.

بالنسبة لـ MTTs البشرية ، تم استخراج 398 مخططًا فرعيًا من 296 × 296 × 296 فوكسل من 12 مركزًا ومحاذاة باستخدام الجسم الحي السابق Cricetulus griseus هيكل MTTs كمرجع بداية (emd-7777 ، 15). كان العدد الصغير من المخططات الفرعية ناتجًا عن الضغط العالي لمجموعة البيانات ، مما أدى إلى عدد أقل من الأنابيب الدقيقة السليمة. لاحظ أن مجموعة البيانات هذه تتكون من مزيج من الأنابيب الدقيقة المزدوجة وثلاثة توائم. اخترنا أيضًا استخدام المخططات الفرعية التي تحتوي على MTDs مع العلم أن الهيكل الداخلي في الإنسان لا يزال مرتبطًا بها (الشكل S2A). يفسر عدم تجانس مجموعة البيانات هذا إعادة بناء الأنابيب الدقيقة C الفقيرة (الشكل S6 و I و J).

للوصلات بين MTTs في صيغة غير مضغوطة P. tetraurelia و C.reinhardtii المريكزات ، تم إنشاء المخططات الفرعية كما كان من قبل ، ولكن ترتيب التقاط النقاط كان أولاً C-microtubules ثم A- microtubules. تم إجراء ذلك لاستيفاء النقاط الموجودة بين اثنين من MTTs بدلاً من النقاط الموضوعة في منتصف MTT كما تم سابقًا. ل P. tetraurelia، تم استخراج 2413 مخططًا فرعيًا كل 8.5 نانومتر من المريكزات التسعة التي تعتبر الأقل ضغطًا (محيط دائري). للتحقق مما إذا كان هناك دورية 17 نانومتر عند التقاطع ، تم استخدام نصف مجموعة البيانات ، لمحاكاة جسيم واحد كل 17 نانومتر. تم إنشاء متوسط ​​أولي من معلمات المحاذاة المسبقة واستخدامه كمرجع أولي. بعد خمسة تكرارات ، لم يقدم المتوسط ​​الناتج أي هياكل دورية 17 نانومتر ، لذلك قررنا استخدام مجموعة البيانات الكاملة مع دورية 8.5 نانومتر. ل C.reinhardtii، تم استخراج 682 مخططًا فرعيًا كل 17 نانومتر من خمسة مريكزات. في هذه الحالة ، كشفت الملاحظات الأولية بالفعل عن دورية حول 16.2 نانومتر (شكل S1T). باتباع نفس الإجراء المتبع في P. tetraurelia، تم إنشاء المرجع الأولي عن طريق حساب متوسط ​​البرامج الفرعية مع معلمات المحاذاة المسبقة الخاصة بهم.

مزيج من الخرائط

لإنشاء خريطة تعرض اثنين من MTTs المجاورتين المرتبطين معًا ، استخدمنا خريطتي MTT وخريطة تقاطع واحدة تم إنشاؤها بواسطة متوسط ​​المخطط الفرعي كما هو موضح أعلاه. تم تسوية شدة البكسل لجميع الخرائط الثلاث أولاً إلى نفس نطاق القيم. تم إعادة توجيه الخرائط الثلاث تقريبًا بأحجام كبيرة بما يكفي لتناسب اثنين من MTTs [شكل. S4M ، أ]. بعد ذلك ، تمت محاذاة حجم الوصلة على أول MTT [شكل. S4M، b] باستخدام SPIDER (37). وبالمثل ، تمت محاذاة MTT الثانية مع حجم التقاطع الجديد [شكل. S4M ، ج]. من كل مجلد ، تم تحديد منطقة الاهتمام في ImageJ ، وتم تجزئة إما MTT أو التقاطع [شكل. S4M ، د]. أخيرًا ، تم ضم المجلدات الثلاثة المقسمة معًا باستخدام أداة "Image Calculator - & gt Add" في ImageJ [شكل. S4M ، هـ]. ملفات البيانات S1 و S2 هي ملفات .tiff النهائية لوحدات التخزين المدمجة لـ P. tetraurelia (ملف البيانات S1) و C.reinhardtii (ملف البيانات S2).

تحليل توزيع السمات الهيكلية

لفهم كيفية توزيع السقالة الداخلية ورابط التيار المتردد على طول المريكز ، استخدمنا ImageJ لاختيار المواضع يدويًا حيث تبدأ الهياكل التالية في الظهور وأين تختفي: سقالة داخلية ورابط A-C و MTTs و MTDs.

التحليل الهندسي

من عند P. tetraurelia، اخترنا 10 مريكزات كانت سليمة (دائرية) قدر الإمكان. لتجنب مشكلة تقلب طول المريكز ، تم تقسيم المريكزات إلى 10 أجزاء. للقيام بذلك ، تم استخدام أداة "Group Z Projection" من ImageJ لتوليد 10 شرائح على طول المركز. في كل شريحة ، تم اختيار إحداثيات الأنابيب الدقيقة A- و B- و C. على طول الطول المركزي ، حددنا مركز المريكزات (O) كمركز باري لجميع إحداثيات الأنابيب الدقيقة. بعد ذلك ، لكل MTT ، تم حساب زاوية الالتواء كزاوية بين المتجه O-A والمتجه A-B (A و B هما مركز الأنابيب الدقيقة A و B ، على التوالي). بالإضافة إلى ذلك ، تم قياس نصف قطر المريكز على أنه المسافة O-A. من 10 centrioles و 9 MTTs و 10 أقسام فرعية ، كان لدينا قيمتان مفقودتان ، مما أدى إلى 898 قياسًا لكل معلمة.

من عند C.reinhardtii، تم استخراج نفس المعلومات من ستة مريكزات. نظرًا لأن هذه المريكزات كانت غير مكتملة بسبب طحن FIB ، لم يكن من الممكن حساب المركز الباري للأنابيب الدقيقة A لكل قسم فرعي. لذلك ، اخترنا أيضًا الموضع الافتراضي لمركز المريكز. تم الحصول على إجمالي عدد القياسات 377.

التحليل الدوراني والتحليلي

في الرسم المقطعي الخام ، تم استخراج مقطع عرضي بسمك 100 نانومتر من مركز من P. tetraurelia. لزيادة تباينه ، تم تقليل الحجم بمعامل 2. بعد ذلك ، تمت إزالة الضوضاء عن طريق الانتشار غير الخطي المتباين باستخدام bsoft وبتطبيق مرشح Gaussian ثلاثي الأبعاد مع Fiji. باستخدام SPIDER ، تم تغيير مستوى الصوت على طول ملف ض محور كل بكسل من −58 إلى +58 (على التوالي ، 41 إلى 41 نانومتر). في نفس الوقت ، تم تدوير الحجم حول ض المحور بمقدار 5 درجات من 0 إلى 360. تمت مقارنة كل حجم مترجم (مع إزاحات ودورات مقترنة) بالحجم الأولي. لاحظ أنه تم حساب الارتباط المتبادل على البنية الأساسية الداخلية فقط. تم إجراء نفس العمليات باستخدام مقطع عرضي للنهائي المعاد بناؤه P. tetraurelia سقالة داخلية.

بطريقة مماثلة ، مقطع عرضي لـ C.reinhardtii تم استخراج المريكز وتحضيره. نظرًا لعدم اكتمال المريكزات التي تم الحصول عليها في طحن FIB ، لا يمكن إجراء تحليل الدوران بشكل موثوق. ومع ذلك ، يمكننا إجراء تحليل متعدية كما هو موضح أعلاه للتصوير المقطعي الخام والصورة النهائية المعاد بناؤها C.reinhardtii سقالة داخلية.

زراعة خلايا الثدييات

نمت الخلايا إما في RPMI-1640 و GlutaMAX (تقنيات الحياة) (KE-37) أو وسيط النسر المعدل من Dulbecco و GlutaMAX [U2OS و HEK293 (الكلية الجنينية البشرية - 293)] ، مكملًا بنسبة 10 ٪ من مصل العجل الجنيني (تقنيات الحياة) والبنسلين والستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل).

استنساخ

بناء pEGFP-C1 – Centrin-2 الذي يعبر عن Centrin-2 البشري (NM_004344.1) تم وصفه في مكان آخر (38). بالنسبة لبناء pEGFP-C2-POC5 ، تسلسل تشفير كامل الطول لـ hPOC5 تم الحصول عليه عن طريق النسخ العكسي لتفاعل البوليميراز المتسلسل (RT-PCR) كما هو موضح في (21) في pEGFP-C2 (مختبرات Clontech). تم الحصول على بناء pmCherry-hPOC5 عن طريق استبدال تسلسل ترميز البروتين الفلوري الأخضر (GFP) في البناء السابق بـ mCherry. لإنشاء بنية GFP-FAM161A ، FAM161A البشري (NM_001201543.2) تم تضخيم PCR من استنساخ الحمض النووي التكميلي DKFZp686O21143Q واستنساخه في pEGFP-C2. تم إنشاء بناء pEGFP-POC1B عن طريق نقل تسلسل تشفير POC1B البشري (NM_172240) من متجه مانح البوابة (ORFeome Collaboration Clones ، متاح من Dharmacon ، المعرف: 100070629) إلى pEGFPC-attR ، ناقل pEGFP-C2 معدل يحتوي على كاسيت استنساخ البوابة. تم الحصول على pmCherry-POC1B بنفس الطريقة باستخدام pmCherryC-attR ، وهو ناقل مشتق من pEGPC-attR عن طريق استبدال تسلسل تشفير GFP بـ mCherry.

تجارب الترسيب الكويمونوبريسي

تم نقل التركيبات التالية في طبق بحجم 10 سم يحتوي على 30 إلى 40 ٪ من خلايا HEK293 المتكدسة باستخدام إما Lipofectamine (Life Technologies) أو كاشف jetPRIME (Polyplus-transfection) باتباع إرشادات الشركة المصنعة: GFP-FAM161A مع mCherry-POC5 ، mCherry-POC5 وحده ، GFP-Centrin-2 مع mCherry-FAM161A و GFP-POC5 مع mcherry-POC1B. بعد 24 ساعة من التعبير ، تمت معالجة الخلايا وفقًا لتعليمات GFP-Trap Kit (Chromotek) باستخدام مقايسة الترسيب المناعي الإشعاعي (RIPA) للتحلل واحتضان المحللة باستخدام حبات مغناطيسية GFP-Trap لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية على الدوران. عجلة. تم تشغيل العينات على هلام متدرج بنسبة 4 إلى 20 ٪ (Bio-Rad) قبل النقل على غشاء polyvinylidene difluoride (PVDF) باستخدام نظام iBlot (Invitrogen / Thermo Fisher Scientific). تم تحضين الأغشية إما بالأجسام المضادة الأولية ضد الفئران GFP (1: 700 Abcam ، ab1218) أو الأرانب mCherry (1: 500 Abcam ، ab167453) ، متبوعة ببيروكسيداز الفجل الماعز (HRP) (1: 1000 من 50٪ جلسرين) مخزون Thermo Fisher Scientific، 31431) أو الماعز المضادة للأرانب HRP (1: 1000 من مخزون 50٪ من الجلسرين Thermo Fisher Scientific ، 31468) من الأجسام المضادة الثانوية. تم تطوير اللقطات باستخدام أفلام أميرشام (GE Healthcare ، 28906836).

إنتاج وتنقية الأجسام المضادة FAM161A

لتوليد الجسم المضاد المضاد لـ FAM161A ، تم إدخال جزء يشفر الأحماض الأمينية من 1 إلى 160 (بناءً على التسلسل NP_001188472) في pGST-Parallel1 وتم التعبير عنه في الإشريكية القولونية. تمت تنقية بروتين الاندماج GST-FAM161A في ظل ظروف أصلية باستخدام Glutathione Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare) ، الذي تم جمعه من الحبيبات بواسطة انشقاق البروتياز TEV (Tobacco Etch Virus) واستخدامه في تحصين الأرانب (Agro-Bio). تم بعد ذلك تنقية تقارب الأجسام المضادة فوق عمود من GST-FAM161A مثبت في Affi-Gel 10 (مختبرات Bio-Rad).

الكواشف والبروتوكول U-ExM

تم وصف كواشف U-ExM في (16) باستثناء البولي- د-ليسين ، الذي تم شراؤه من Thermo Fisher Fisher (A3890401). تم تحضير حلول مونومر U-ExM (U-ExM-MS) على النحو التالي: بالنسبة لجيل واحد ، 25 ميكرولتر من أكريلات الصوديوم (SA) من 38 ٪ (وزن / وزن ، مخفف بمياه خالية من نوكلياز) ، 12.5 ميكرولتر من مادة الأكريلاميد (AA) من محلول مخزون 40٪ ، و 2.5 ميكرولتر من ثنائي أكريلاميد (BIS) من محلول مخزون بنسبة 2٪ ، و 5 ميكرولتر من 10 × محلول ملحي مخزّن بالفوسفات (PBS) تم خلطها مسبقًا وحفظها عند درجة حرارة -20 درجة مئوية . تم تحضير بادئ الجذور الحرة الأمونيوم لكل كبريتات (APS) ومحفز البلمرة رباعي ميثيل إيثيلين ديامين (TEMED) كمحلول مخزون بنسبة 10 ٪ في ماء خالٍ من نوكلياز وتم الاحتفاظ به على شكل قسامات عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة شهر واحد.

تم استخدام الأجسام المضادة الأولية التالية في هذه الدراسة: الأرنب المضاد لتوبيولين (1: 500 ، Abcam ، ab18251) ، سلسلة أرنب متعددة النسيلة المضادة للجلوتامات (PolyE ، IN105) (1: 500 AG-25B-0030-C050 ، AdipoGen) ، الأجسام المضادة التيوبولين AA344 (1: 250: scFv-S11B ، β-tubulin) و AA345 (1: 250 scFv-F2C ، α-tubulin) ، مضاد متعدد النسيلة للأرنب POC1B (1: 250 PA5-24495 ، Thermo Fisher Scientific) ، أرنب polyclonal anti-POC5 (1: 250 A303-341A، Bethyl Laboratories) ، أرنب متعدد النسيلة مضاد لـ FAM161A (1: 250 جسم مضاد محلي الصنع ، هذه الدراسة) ، والفأر وحيد النسيلة مضاد سينترين -2 (1: 250 استنساخ 20H5 ، 04-1624 ، ميرك ميليبور). استخدمنا الأجسام المضادة الثانوية التالية: الماعز المضاد للأرنب Alexa Fluor 488 الغلوبولين المناعي G (IgG) الثقيل + الخفيف (H + L) (1: 400 A11008) ، الماعز المضاد للفأر Alexa Fluor 488 IgG H + L (1: 400 A11029) ) ، الماعز المضاد للفأر Alexa Fluor 568 IgG H + L (1: 400 A11004) (1: 400 Invitrogen ، Thermo Fisher Scientific) ، والماعز المضاد للأرنب Alexa Fluor 568 (1: 400 Thermo Fisher Scientific).

تم تنفيذ بروتوكول U-ExM كما هو موصوف (16). باختصار ، تم تحضين أغطية 12 ملم مع خلايا U2OS غير مثبتة في محلول من الفورمالديهايد (FA) و AA (انظر المواد وطرق التركيز) في برنامج تلفزيوني لمدة 5 ساعات عند 37 درجة مئوية. تمت إضافة TEMED (2.5 ميكرولتر) و APS (2.5 ميكرولتر) (من حلول الأسهم 10 ٪) إلى U-ExM-MS وتم خلطها بسرعة قبل الإضافة إلى الأغطية. تم السماح للجيل بالاستمرار لمدة 5 دقائق على الجليد ثم انتقل إلى 37 درجة مئوية في الظلام لمدة ساعة واحدة. تم تحضين الأغطية مع المواد الهلامية بعد ذلك في المخزن المؤقت للتمسخ (200 ملي مولار SDS ، 200 ملي مول كلوريد الصوديوم ، و 50 ملي تريس في ddH2يا ماء مقطر) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) مع التحريك اللطيف. على التوالي ، تمت إزالة المواد الهلامية من الأغطية واحتضانها بمحلول تمسخ جديد عند 95 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة (ما لم يتم تحديد ذلك ، انظر الشكل S8). بعد التمسخ ، تم غمر المواد الهلامية في ddH2O في RT. بعد ذلك ، تم تحضين المواد الهلامية في ddH2O بين عشية وضحاها للتوسع الكامل. في اليوم التالي ، تم غسل المواد الهلامية في برنامج تلفزيوني مرتين لمدة 15 دقيقة لإزالة الماء الزائد قبل الحضانة بمحلول الجسم المضاد الأولي. تم إجراء الحضانة مع الأجسام المضادة الأولية المخففة في 2 ٪ PBS / BSA عند 37 درجة مئوية ل

3 ساعات ، مع اهتزاز لطيف. تم بعد ذلك غسل المواد الهلامية في PBS و 0.1٪ توين 20 (PBST) ، ثلاث مرات لمدة 10 دقائق مع الرج ، واحتضانها بمحلول جسم مضاد ثانوي مخفف في 2٪ PBS / BSA من أجل

3 ساعات عند 37 درجة مئوية ، مع اهتزاز لطيف. تم بعد ذلك غسل المواد الهلامية في PBST ، ثلاث مرات لمدة 10 دقائق مع الرج ، وأخيراً تم وضعها في أكواب مملوءة بـ ddH2O للتوسع النهائي أولاً لمدة 30 دقيقة ثم بين عشية وضحاها للتوسع الكامل. يتراوح التوسع المتوقع من 4 إلى 4.2 ×. تم إجراء التركيب كما هو موضح (16).

تحسين بروتوكول U-ExM والحصول على الصور

قمنا بتحسين بروتوكول U-ExM الموضح سابقًا (16) للحصول على توسع أفضل للمريكزات داخل الخلايا البشرية. تم تعديل خطوتين على النحو التالي: حل FA / AA [FA 0.7 و 1٪ AA = 1X (16) FA 1.4 و 2٪ AA = 2X و FA 2.1 و 3٪ AA = 3X) ووقت التمسخ (30 و 60 و 90 دقيقة). يتم عرض نتائج التحسين في الشكل. S8 (أ و ب). أسفر بروتوكول 2X جنبًا إلى جنب مع التمسخ لمدة 90 دقيقة عند 95 درجة مئوية عن أفضل توسع واستخدم لمزيد من التحليل.

تم إجراء الفحص المجهري متحد البؤر على Leica TCS SP8 باستخدام هدف زيت بفتحة عددية 63 × 1.4 (NA) ، مع وضع البرق بأقصى دقة لتوليد صور مفككة ، مع المعلمات التالية: البرق بأقصى دقة ، تكيفي كـ "إستراتيجية" و الماء على أنه "متوسط ​​التركيب". ثلاثي الأبعاد ض تم الحصول على مداخن بـ 0.12 ميكرومتر ض فترات و x,ذ حجم البكسل 35 نانومتر. للتين. S8 (A و B) ، تم تصوير المريكزات باستخدام هدف زيت 100 × 1.25 NA N PLAN على مجهر واسع المجال من Leica DM6B ، مزود بكاميرا Leica DFC9000 أحادية اللون مكملة لأشباه الموصلات المعدنية (sCMOS). تم إنشاء الصور المفككة باستخدام وضع الرعد "المقاصة الحسابية الصغيرة الحجم".

قياسات قطر وطول المريكز

تم دائمًا قياس قطر وطول التوبولين وبروتينات السقالة الداخلية من تجارب التلوين المزدوج للحصول على القيم النسبية. يتم محاذاة المريكزات بنهاياتها البعيدة والدانية عموديًا على طول ض تم اختيار المحور لتحليل القطر. تم قياس أقطار توبولين وبروتينات السقالة الداخلية المختلفة في الوسط ض الطائرة باستخدام أدوات مسح خط فيجي وملف تعريف الرسم (39) لقياس المسافة بين قمتي الشدة. لكل مركز ، تم الحصول على أقطار توطين البروتين من متوسط ​​قياسين متعامدين.لتحليل الطول ، فقط المريكزات الموضوعة موازية تقريبًا لـ x,ذ تم اختيار الطائرة لقياس طول التوبولين والبروتينات الأساسية الداخلية المختلفة. لكل مريكز ، تم رسم مسح خطي يغطي العرض الكامل للمريكز على طول صورة إسقاط قصوى تم إنشاؤها من عدد قليل من الطائرات المتوسطة للمريكز. تم بعد ذلك استخدام أداة ملف تعريف مخطط فيجي للحصول على ملف تعريف كثافة التألق لكل من التوبولين والبروتين الأساسي الداخلي من نفس مسح الخط ، وتم قياس الطول على أنه المسافة بين شدة 50 ٪ من أقصى ذروة قريبة وشدة 50 ٪ من أقصى قمة.

لتوليد الرسوم البيانية في الشكل. S8 (C و E و G و I) ، كلاهما x و ذ تم إعادة قياس المحاور إلى وحدات نسبية. لكل ملف تعريف كثافة مضان توبولين ، أعلى قيمة مضان قصوى (x المحور) إلى 1 ، وتم تطبيع جميع القيم الأخرى إليه. علاوة على ذلك ، فإن أطوال كل ملف تعريف شدة مضان (ذ المحور) بين 0 و 1 من خلال تخصيص 0 إلى 5٪ من شدة التألق لأقرب ذروة قريبة و 1 إلى 5٪ من شدة التألق للقمة الأكثر بُعدًا. المقبل ، وملامح كثافة مضان tubulin التي تم إعادة قياسها من

تمت محاذاة 60 مريكزًا من ثلاثة أنواع هلامية مستقلة ومتوسطها معًا لإنشاء منحنى متوسط. تم أيضًا تطبيع ملف شدة التألق لكل بروتين سقالة داخلي وإعادة قياسه من خلال الحد الأقصى من شدته على x وطول ملف تعريف tubulin المقابل من نفس المريكز الموجود على ذ محور. بعد ذلك ، تم حساب متوسط ​​ملامح الكثافة المحاذاة لبروتينات السقالة الداخلية معًا لإنشاء منحنيات متوسطة. تم إعادة قياس ملامح شدة الإسفار باستخدام اللغة R وتم رسمها في GraphPad Prism7.

للحصول على الشكل 4 (K و L) ، تم تطبيع أقطار بروتينات السقالة الداخلية والتوبيولين من كل سنتريول فردي إلى متوسط ​​قياسات التوبولين التي تم الحصول عليها من جميع المريكزات. تم رسم القيم الفردية كدائرة للقطر المقابل والمركز المحاذاة.

التناظر

تم الحصول على صور متناظرة (الشكل 4J) من صور دمج متحد البؤر الموضحة في الشكل 4I (الصور الأولية). تم تكرار كل صورة تسع مرات وتم تدويرها بالتتابع بزاوية 40 درجة في فيجي (39). باستخدام البرنامج المساعد فيجي StackReg ، تمت إعادة ترتيب الصور التي تم تدويرها عن طريق الترجمات إلى الصورة الأصلية فقط. تم بعد ذلك إنشاء إسقاط متوسط ​​الشدة للصور التسع.

سقالة داخلية بدقة U-ExM

كما هو موضح في الشكل. تم إنشاء S9 (F إلى K) ، الإسقاط ثنائي الأبعاد (المتوسط) (الشكل S9F) من خريطة 3D cryo-EM المعاد بناؤها باستخدام Fiji (39). بعد ذلك ، تم إعادة قياس الصورة أكبر أربع مرات لتصل إلى حجم المريكز في U-ExM (قطرها حوالي 800 نانومتر من منتصف MTTs). بعد ذلك ، تم إنشاء صورتين عن طريق حذف إما كثافة السقالة الداخلية (الشكل S9G) أو MTTs (الشكل S9H). تمت معالجة كل صورة بعد ذلك باستخدام ممر نطاق في فضاء فورييه عن طريق تصفية الهياكل الصغيرة حتى 140 نانومتر ، وهو ما يتوافق مع الدقة البؤرية بعد التفكك (الشكل S9 و I و J). تم إنشاء الصورة النهائية بدمج الصورتين المرشحتين (الشكل S9K).

فحص توظيف الأنابيب الدقيقة

تم نقل ستين إلى 80٪ من خلايا U2OS المتكدسة في صفيحة من ستة آبار باستخدام كاشف jetPRIME (Polyplus-transfection) باتباع تعليمات الشركة الصانعة ، مع 2.5 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي للتركيبات التالية: mCherry-FAM161A وحده ، GFP-POC5 وحده ، GFP -POC1B وحده ، GFP – Centrin-2 وحده ، mCherry-FAM161A مع GFP-POC5 ، mCherry-FAM161A مع GFP-POC1B ، mCherry-FAM161A مع GFP – Centrin-2 أو mcherry-POC5 مع GFP – Centrin-2 أو mCherry FAM161A مع كل من mCherry-POC5 و GFP-Centrin-2. تم تغيير الوسيط بعد 4 إلى 6 ساعات من تعداء لتجنب موت الخلايا ، وتم السماح بالتعبير عن بروتينات الانصهار الفلورية لمدة 24 ساعة. تم بعد ذلك إصلاح الخلايا المزروعة على الأغطية لمدة 3 دقائق في MeOH بارد بدرجة حرارة تقل عن 20 درجة مئوية وغسلها مرة واحدة في برنامج تلفزيوني قبل تلطيخها من أجل α- و-tubulins (انظر قسم "كواشف U-ExM" في المواد التكميلية) في PBS / BSA 2 ٪ متبوعًا بجسم مضاد ثانوي STAR RED مضاد للفأر (1: 400 Abberior) ، تم غسله ثلاث مرات في PBS Tween 0.1٪. تم بعد ذلك تركيب Coverslips باستخدام وسط تركيب الجلسرين مع 4 ′ ، 6-Diamidino-2-phenylindole و DABCO 1 ، 4-diazabicyclo (2.2.2) أوكتان (Abcam ، ab188804).


مناقشة

ثبت أن الببتيدات الاصطناعية المشتقة من المجالات الوظيفية لمنتجات الجينات الفيروسية تثبط الفيروسات المقابلة (19-21). على سبيل المثال ، الببتيد 36-aa ، المقابل لتسلسل تكرار سباعي في بروتين سكري عبر غشاء HIV-1 (gp41) ، هو مثبط قوي لانصهار غشاء HIV-1 ودخول الفيروس (20 ، 22 ، 23) وهو الآن في الاستخدام السريري في المرضى المصابين بفيروس HIV-1 (24). ومن المثير للاهتمام ، أن منتج الانقسام المحلل للبروتين N-terminal للببتيد الذي يمتد على موقع الانقسام NS5A-NS5B في HCV يمنع بروتياز HCV NS3 / 4A ، ومركب حلقي كبير ببتيدوميمينتيك يعتمد على هذا الهيكل له نشاط قوي مضاد للفيروسات في المختبر وفي البشر (19). هذه النتائج المماثلة في أنظمة الفيروسات الأخرى (21 ، 25) كانت بمثابة قوة دافعة للدراسات المذكورة هنا.

باستخدام مقايسة تقليل التركيز المعدية لفحص مكتبة الببتيد الاصطناعية المكونة من 441 عضوًا والتي تغطي بروتين HCV متعدد البروتين ، حددنا 13 ببتيدًا يثبط عدوى فيروس التهاب الكبد الوبائي 10 أضعاف على الأقل ، وأكثرها فعالية في منع العدوى و GT100000 ضعف. العديد من هذه الببتيدات لها آليات عمل متنوعة محتملة ، بناءً على موقعها في البروتين المقابل (الشكل 1 ، الجدول SI 3). أقوى هذه الببتيدات ، C5A ، 18 مير مشتق من مجال مرساة الغشاء لبروتين HCV NS5A الذي يحتوي على IC50 في النطاق النانوي ، وهو أقل بمقدار 100 مرة على الأقل من الجرعة السامة الملاحظة في المختبر و في الجسم الحي في الفئران (الجدول SI 4) ، تم اختياره لمزيد من التحليل. الأهم من ذلك ، أن الأيزومر D لـ C5A يكون على الأقل بنفس فعالية الأيزومر L (الشكل 2) ، وهو أقل سمية للخلايا في المختبر (الشكل 2) ، وهو مستقر في الوسط المحتوي على مصل (الشكل 5) ، وغير مناعي في الجسم الحي (البيانات غير ظاهرة). علاوة على ذلك ، يعرض C5A آلية عمل فريدة تمامًا مضادة للفيروسات: فهو يزعزع السلامة الهيكلية الفيروسية وله نشاط تحلل الغشاء الفيروسي ، أي أنه مبيد للفيروسات. وبالتالي ، فليس من المستغرب أن يمنع C5A تمامًا ودائمًا من جديد عدوى HCV وتثبط عدوى HCV المستمرة في الخلايا المنقسمة وغير المنقسمة. مجتمعة ، تشير هذه النتائج إلى أن C5A يثبط عدوى HCV عن طريق زعزعة استقرار فيروسات HCV خارج الخلية وداخل الخلايا المصابة.

يتكون C5A من الأحماض الأمينية 3-20 عند الطرف N من NS5A ، وهو بروتين معدني زنك فسفري مكون أساسي من مركب تكرار HCV (26 ، 27). تعمل الأحماض الأمينية N-terminal 30 من NS5A كمرساة غشائية وتستهدف البروتين إلى الشبكة الإندوبلازمية (ER) (28). يشير التحليل الهيكلي إلى أن هذه المنطقة تشكل حلزون α-amphipathic مدمج في الطائرة في نشرة العصارة الخلوية للطبقة ثنائية الغشاء (13 ، 31). كما هو متوقع ، يكشف تحليل القرص المضغوط أن C5A يعرض بنية حلزونية ألفا في محلول مائي. وبالمثل ، أظهرت إسقاطات العجلة الحلزونية أن بقايا C5A موزعة في نمط أمفيباثي مثالي (SI الشكل 6). ومع ذلك ، فإن النشاط المضاد للفيروسات لـ C5A ليس خاصية عامة لجميع مجالات ارتباط الأغشية ، لأن الببتيدات من مجالات تثبيت الغشاء لبروتينات HCV غير بنائية أخرى [على سبيل المثال ، NS4A و NS4B و NS5B (29)] الموجودة في لوحة فحص الببتيد لا تمنع عدوى التهاب الكبد الفيروسي.

كشف تحليل التركيب والنشاط أن الخصوصية المضادة للفيروسات لـ C5A ترتبط ببنيتها الحلزونية ألفا وقدرتها على نفاذية أغشية الجسيمات الشحمية. تشير هذه النتائج إلى أن C5A يتفاعل مع الغشاء الفيروسي لتعطيل سلامته ، وإطلاق قفيصة فيروسية ، وتعريض الجينوم الفيروسي للنويدات الخارجية للتحلل. بالإضافة إلى ذلك ، كشف تحليل الطفرات أن amphipathicity ضروري لنشاط C5A المضاد للفيروسات. تميز آلية العمل الفريدة هذه C5A عن الببتيدات التي تتداخل مع تفاعل مستقبلات ليجند مضيف الفيروس [على سبيل المثال ، Fuzeon and Virus Inhibitory Peptide (VIRIP) لببتيد HIV EB للأنفلونزا] (20 ، 30 ، 31) والهروب الفيروسي من الجسيمات الداخلية (على سبيل المثال ، HNP1 و HD5 لفيروسات الورم الحليمي البشري) (32). على الرغم من أن كلا من amphipathicity و α-helicality ضروريان للنشاط المضاد للفيروسات C5A ، إلا أنهما ليسا كافيين ، لأن العديد من الببتيدات amphipathic α-helical الأخرى التي لها نشاط مضاد للميكروبات في أنظمة أخرى (33 ، 34) ليست نشطة ضد HCV.

كشف تحليل البنية والنشاط أيضًا أن نشاط C5A المضاد للفيروسات مستقل عن التسلسل ، لأن retropeptides أو الببتيدات مع الأحماض الأمينية المخففة للماء أو المحبة للماء كانت نشطة تمامًا ، مما يشير إلى أن نشاطها المبيد للفيروسات مستقل عن تفاعلات بروتينية غشائية محددة. يتم دعم ذلك من خلال النشاط الكامل المضاد للفيروسات لـ d -isomer لـ C5A ، والذي من غير المحتمل أن يشارك في نفس تفاعلات البروتين الغشائي الببتيد مثل نظيره l -isomer. في المقابل ، كشف تحليل استبدال الأحماض الأمينية أن النشاط المضاد للفيروسات لـ C5A يعتمد على تكوين الأحماض الأمينية ، وأن بقايا السيستين الداخلية تبدو ضرورية وأن متجانساتها الموجبة الشحنة نشطة أيضًا. أظهرت نظائرها الاصطناعية لـ C5A المشتقة من تسلسل النموذج الأولي لستة أنماط وراثية مستقلة لفيروس HCV نشاطًا متغيرًا مضادًا للفيروسات ضد التهاب الكبد C على الرغم من الاحتفاظ بتركيب حلزوني ألفا أمفيباثي ، مما يُفترض أنه يعكس تركيبة الأحماض الأمينية المختلفة.

ومن المثير للاهتمام ، أن النشاط المضاد للفيروسات لـ C5A لا يقتصر على HCV ، لأنه يعرض نشاطًا قويًا مضادًا للفيروسات ضد الأعضاء الآخرين في فلافيفيريدي (فيروس غرب النيل وفيروس الضنك) ، والفيروسات المخاطانية (الحصبة والفيروس المخلوي التنفسي) ، وفيروس نقص المناعة البشرية ، وسيتم الإبلاغ عن تفاصيلها بشكل منفصل. الأهم من ذلك ، يشير التحليل الأولي إلى أن C5A مبيد للفيروسات لحمى الضنك وفيروس نقص المناعة البشرية ، على غرار HCV. تدعم هذه النتائج فكرة أن C5A يستهدف المكونات الخلوية لأغشية الفيروس بدلاً من البروتينات المشفرة بالفيروس. استنادًا إلى اتجاهه داخل الطائرة في نشرة العصارة الخلوية لغشاء ER (13) ، نقترح أن يتعرف C5A على المكونات الخلوية لأغشية الفيروس ، وعلى الأرجح تكوينها الدهني ، والذي من شأنه أن يعكس تكوين الحيز الخلوي الذي يحدث فيه تكوينها. نظرًا لأن HCV وفيروس غرب النيل وفيروس حمى الضنك قد برعموا في ER ، فقد تعكس أغشيتهم تركيبة الدهون المطلوبة لإدخال مرساة غشاء HCV NS5A. في المقابل ، تتبرعم الحصبة ، وفيروس RSV ، وفيروس نقص المناعة البشرية من سطح الخلايا المصابة ، لذلك لا يزال يتعين تحديد أساس تعطيلها بواسطة C5A. من الناحية النظرية ، يمكن أن تتبرعم من خلال طوافات دهنية غنية بالكوليسترول والدهون السفينجولية (35) ، وبالتالي يمكن أن تحتوي على تركيبة دهنية غشائية مماثلة لـ HCV ، والتي ثبت أيضًا أنها مرتبطة بالأغشية المقاومة للمنظفات في الخلية (36 ، 37) ). هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لمعالجة هذه الاحتمالات ، وكذلك أساس مقاومة C5A للفيروسات الأخرى التي تم اختبارها في هذه الدراسة.

في الختام ، حددت هذه الدراسات الغشاء الفيروسي كهدف للتدخل في بعض أنواع العدوى الفيروسية. بالإضافة إلى ذلك ، قاموا بتأسيس C5A كنموذج أولي لفئة من العوامل المضادة للفيروسات التي تركز بشكل خاص على هذا الهدف. على هذا النحو ، يمكن دمج عوامل استهداف الأغشية مثل C5A مع العوامل التي تستهدف الجوانب داخل الخلايا من دورة الحياة الفيروسية. الأهم من ذلك ، يجب ألا تختار هذه العوامل لمتغيرات الهروب ، وإذا تم دمجها مع الأدوية التي تحدد طفرات المقاومة ، فإن طريقة عملها خارج الخلية مبيد للفيروسات يجب أن تمنع انتشار هذه المتغيرات أيضًا.


محتويات

البروتينات عبارة عن سلاسل من الأحماض الأمينية مرتبطة ببعضها البعض بواسطة روابط ببتيدية. العديد من المطابقات لهذه السلسلة ممكنة بسبب دوران السلسلة حول كل ذرة كربون ألفا (ذرة Cα). هذه التغييرات التوافقية هي المسؤولة عن الاختلافات في البنية ثلاثية الأبعاد للبروتينات. كل حمض أميني في السلسلة هو قطبي ، أي أنه يفصل بين المناطق المشحونة الموجبة والسالبة مع مجموعة الكربونيل الحرة ، والتي يمكن أن تكون بمثابة متقبل لرابطة الهيدروجين ومجموعة NH ، والتي يمكن أن تعمل كمانح رابطة الهيدروجين. لذلك يمكن أن تتفاعل هذه المجموعات في بنية البروتين. ال [ أي؟ ] يمكن تصنيف 20 من الأحماض الأمينية وفقًا لكيمياء السلسلة الجانبية التي تلعب أيضًا دورًا هيكليًا مهمًا. يتخذ الجلايسين مكانة خاصة ، حيث يحتوي على أصغر سلسلة جانبية ، ذرة هيدروجين واحدة فقط ، وبالتالي يمكنه زيادة المرونة المحلية في بنية البروتين. من ناحية أخرى ، يمكن أن يتفاعل السيستين مع بقايا سيستين أخرى وبالتالي يشكل رابطًا متقاطعًا يعمل على استقرار الهيكل بأكمله. [ بحاجة لمصدر ]

يمكن اعتبار بنية البروتين كسلسلة من عناصر البنية الثانوية ، مثل α helices و sheet ، والتي تشكل معًا التكوين العام ثلاثي الأبعاد لسلسلة البروتين. في هذه الهياكل الثانوية ، تتشكل الأنماط المنتظمة من روابط H بين الأحماض الأمينية المجاورة ، وللأحماض الأمينية زوايا Φ و متشابهة. [ بحاجة لمصدر ]

يؤدي تكوين هذه الهياكل إلى تحييد المجموعات القطبية على كل حمض أميني. يتم تعبئة الهياكل الثانوية بإحكام في قلب البروتين في بيئة كارهة للماء. تحتوي كل مجموعة جانبية من الأحماض الأمينية على حجم محدود لتشغله وعدد محدود من التفاعلات الممكنة مع سلاسل جانبية أخرى قريبة ، وهي حالة يجب أن تؤخذ في الاعتبار في النمذجة الجزيئية والمحاذاة. [1]

Α اللولب تحرير

الحلزون α هو النوع الأكثر وفرة من البنية الثانوية في البروتينات. يحتوي الحلزون α على 3.6 من الأحماض الأمينية في كل دورة مع رابطة H مكونة بين كل رابع بقايا متوسط ​​الطول 10 أحماض أمينية (3 لفات) أو 10 Å ولكنه يختلف من 5 إلى 40 (1.5 إلى 11 دورة). تخلق محاذاة الروابط H لحظة ثنائية القطب للحلزون مع شحنة موجبة جزئية ناتجة في النهاية الأمينية للحلزون. لأن هذه المنطقة خالية من NH2 سوف تتفاعل مع مجموعات سالبة الشحنة مثل الفوسفات. الموقع الأكثر شيوعًا لحلزونات ألفا هو على سطح نوى البروتين ، حيث توفر واجهة مع البيئة المائية. يميل الجانب المواجه للداخل من اللولب إلى احتواء الأحماض الأمينية الكارهة للماء والأحماض الأمينية المحبة للماء الخارجية. وبالتالي ، فإن كل ثلث الأحماض الأمينية الأربعة على طول السلسلة يميل إلى أن يكون كارهًا للماء ، وهو نمط يمكن اكتشافه بسهولة تامة. في شكل سحاب leucine ، فإن النمط المتكرر من leucines على الجوانب المواجهة لاثنين من الحلزونات المتجاورة هو أمر تنبئي للغاية للعنصر. يمكن استخدام مخطط العجلة الحلزونية لإظهار هذا النمط المتكرر. تتميز حلزونات α الأخرى المدفونة في لب البروتين أو في الأغشية الخلوية بتوزيع أعلى وأكثر انتظامًا للأحماض الأمينية الكارهة للماء ، وهي تنبئ بدرجة كبيرة بمثل هذه الهياكل. تحتوي الحلزونات المكشوفة على السطح على نسبة أقل من الأحماض الأمينية الكارهة للماء. يمكن أن يكون محتوى الأحماض الأمينية تنبئيًا لمنطقة α-helical. المناطق الأكثر ثراءً في الألانين (A) ، وحمض الجلوتاميك (E) ، والليوسين (L) ، والميثيونين (M) والأكثر فقرًا في البرولين (P) ، والجليسين (G) ، والتيروزين (Y) ، والسيرين (S) تميل إلى التكوّن حلزون α. يعمل البرولين على زعزعة استقرار أو كسر حلزون ألفا ولكن يمكن أن يكون موجودًا في الحلزونات الأطول ، مما يشكل منعطفًا.

Β ورقة تحرير

تتشكل β صفائح بواسطة روابط H بين متوسط ​​5-10 أحماض أمينية متتالية في جزء واحد من السلسلة مع 5-10 أخرى أسفل السلسلة. قد تكون المناطق المتفاعلة متجاورة ، مع وجود حلقة قصيرة بينهما ، أو متباعدة ، مع بنى أخرى بينهما. قد تعمل كل سلسلة في نفس الاتجاه لتشكيل صفيحة متوازية ، وقد تعمل كل سلسلة أخرى في الاتجاه الكيميائي العكسي لتشكيل صفيحة متوازية مضادة ، أو قد تكون السلاسل متوازية ومضادة للتوازي لتشكيل صفيحة مختلطة. يختلف نمط الترابط H في التكوينات المتوازية والمضادة. يشكل كل حمض أميني في الخيوط الداخلية للورقة رابطتين H مع الأحماض الأمينية المجاورة ، بينما يشكل كل حمض أميني على الخيوط الخارجية رابطة واحدة فقط مع حبلا داخلي. عند النظر عبر الورقة بزاوية قائمة على الخيوط ، يتم تدوير الخيوط البعيدة قليلاً عكس اتجاه عقارب الساعة لتشكيل التفاف باليد اليسرى. تتناوب ذرات Cα أعلى وأسفل الصفيحة في بنية مطوية ، وتتناوب المجموعات الجانبية R للأحماض الأمينية أعلى وأسفل الطيات. تختلف زاويتا Φ و للأحماض الأمينية في الأوراق اختلافًا كبيرًا في منطقة واحدة من مؤامرة راماشاندران. من الصعب التنبؤ بموقع صفائح β مقارنةً بمواقع α-helices. يتحسن الوضع إلى حد ما عندما يتم أخذ تباين الأحماض الأمينية في محاذاة التسلسل المتعدد في الاعتبار.

حلقات التحرير

تحتوي بعض أجزاء البروتين على بنية ثلاثية الأبعاد ثابتة ، ولكنها لا تشكل أي هياكل منتظمة. لا ينبغي الخلط بينها وبين الأجزاء المضطربة أو غير المطوية من البروتينات أو الملف العشوائي ، وهي سلسلة متعددة الببتيد غير مطوية تفتقر إلى أي بنية ثلاثية الأبعاد ثابتة. غالبًا ما تسمى هذه الأجزاء "الحلقات" لأنها تربط صفائح β و α-helices. عادة ما توجد الحلقات على سطح البروتين ، وبالتالي يكون من السهل تحمل الطفرات في بقاياها. قد يكون وجود المزيد من الاستبدالات والإدراجات والحذف في منطقة معينة من محاذاة التسلسل مؤشرًا على وجود حلقة. قد ترتبط مواقع الإنترونات في الحمض النووي الجينومي بمواقع الحلقات في البروتين المشفر [ بحاجة لمصدر ]. تميل الحلقات أيضًا إلى احتواء الأحماض الأمينية القطبية المشحونة وغالبًا ما تكون أحد مكونات المواقع النشطة.

يمكن تصنيف البروتينات وفقًا لكل من التشابه الهيكلي والتسلسل. بالنسبة للتصنيف الهيكلي ، تتم مقارنة الأحجام والترتيبات المكانية للهياكل الثانوية الموضحة في الفقرة أعلاه في الهياكل ثلاثية الأبعاد المعروفة. كان التصنيف على أساس تشابه التسلسل تاريخياً أول من استخدم. في البداية ، تم إجراء التشابه بناءً على محاذاة التسلسلات الكاملة. في وقت لاحق ، تم تصنيف البروتينات على أساس حدوث أنماط الأحماض الأمينية المحفوظة. تتوفر قواعد البيانات التي تصنف البروتينات بواحد أو أكثر من هذه المخططات. عند التفكير في مخططات تصنيف البروتين ، من المهم مراعاة العديد من الملاحظات. أولاً ، قد يتم طي تسلسلين بروتينين مختلفين تمامًا من أصول تطورية مختلفة في بنية مماثلة. على العكس من ذلك ، قد يكون تسلسل الجين القديم لبنية معينة قد تباعد بشكل كبير في الأنواع المختلفة مع الحفاظ في نفس الوقت على نفس السمات الهيكلية الأساسية. قد يكون التعرف على أي تشابه في التسلسل المتبقي في مثل هذه الحالات مهمة صعبة للغاية. ثانيًا ، هناك بروتينان يشتركان في درجة كبيرة من تشابه التسلسل إما مع بعضهما البعض أو مع تسلسل ثالث يشتركان أيضًا في أصل تطوري ويجب أن يتشاركا بعض الميزات الهيكلية أيضًا.ومع ذلك ، قد يؤدي تكرار الجينات وإعادة الترتيب الجيني أثناء التطور إلى ظهور نسخ جينية جديدة ، والتي يمكن أن تتطور بعد ذلك إلى بروتينات ذات وظيفة وبنية جديدة. [1]

المصطلحات المستخدمة لتصنيف هياكل البروتين وتسلسله تحرير

يتم سرد المصطلحات الأكثر استخدامًا للعلاقات التطورية والهيكلية بين البروتينات أدناه. يتم استخدام العديد من المصطلحات الإضافية لأنواع مختلفة من السمات الهيكلية الموجودة في البروتينات. يمكن العثور على أوصاف لهذه المصطلحات على موقع CATH على الويب ، وموقع الويب للتصنيف الهيكلي للبروتينات (SCOP) ، وبرنامج تعليمي لشركة Glaxo Wellcome على موقع الويب السويسري للمعلوماتية الحيوية Expasy.

الموقع النشط هو مزيج موضعي من المجموعات الجانبية للأحماض الأمينية داخل البنية الثلاثية (ثلاثية الأبعاد) أو الرباعية (الوحدة الفرعية البروتينية) التي يمكن أن تتفاعل مع ركيزة كيميائية محددة والتي توفر للبروتين نشاطًا بيولوجيًا. قد تنثني البروتينات ذات تسلسل الأحماض الأمينية المختلفة جدًا في بنية تنتج نفس الموقع النشط. العمارة هي التوجهات النسبية للهياكل الثانوية في هيكل ثلاثي الأبعاد بغض النظر عما إذا كانت تشترك في بنية حلقة مماثلة أم لا. أضعاف (طوبولوجيا) نوع من العمارة التي لديها أيضًا بنية حلقة محفوظة. الكتل هي نمط تسلسل حمض أميني محفوظ في عائلة من البروتينات. يشتمل النمط على سلسلة من التطابقات المحتملة في كل موضع في التسلسلات الممثلة ، ولكن لا توجد أي مواضع مُدرجة أو محذوفة في النمط أو في التسلسلات. على النقيض من ذلك ، تعد ملفات تعريف التسلسل نوعًا من مصفوفة التسجيل التي تمثل مجموعة مماثلة من الأنماط التي تتضمن عمليات الإدراج والحذف. صنف مصطلحًا يستخدم لتصنيف مجالات البروتين وفقًا لمحتواها الهيكلي الثانوي وتنظيمها. تم التعرف على أربعة فصول في الأصل من قبل Levitt and Chothia (1976) ، وتمت إضافة العديد من الفئات الأخرى في قاعدة بيانات SCOP. يتم إعطاء ثلاث فئات في قاعدة بيانات CATH: بشكل أساسي- α ، بشكل رئيسي- β ، و α ، مع الفئة α β بما في ذلك الهياكل المتناوبة α / و α + β. قلب الجزء من جزيء البروتين المطوي الذي يشتمل على الجزء الداخلي الكارهة للماء من α-helices و-sheet. يجمع الهيكل المضغوط مجموعات جانبية من الأحماض الأمينية على مقربة كافية بحيث يمكن أن تتفاعل. عند مقارنة هياكل البروتين ، كما هو الحال في قاعدة بيانات SCOP ، فإن اللب هو المنطقة المشتركة لمعظم الهياكل التي تشترك في حظيرة مشتركة أو الموجودة في نفس العائلة الفائقة. في تنبؤ الهيكل ، يتم تعريف اللب أحيانًا على أنه ترتيب الهياكل الثانوية التي من المحتمل أن يتم حفظها أثناء التغيير التطوري. المجال (سياق التسلسل) جزء من سلسلة بولي ببتيد يمكن طيها في بنية ثلاثية الأبعاد بغض النظر عن وجود أجزاء أخرى من السلسلة. قد تتفاعل المجالات المنفصلة لبروتين معين على نطاق واسع أو قد يتم ضمها فقط بطول سلسلة بولي ببتيد. قد يستخدم بروتين متعدد المجالات هذه المجالات للتفاعلات الوظيفية مع الجزيئات المختلفة. الأسرة (سياق التسلسل) هي مجموعة من البروتينات ذات الوظيفة البيوكيميائية المتشابهة والتي تكون أكثر من 50٪ متطابقة عند المحاذاة. لا يزال مصدر معلومات البروتين (PIR) يستخدم هذا الحد. تشتمل عائلة البروتين على بروتينات لها نفس الوظيفة في كائنات مختلفة (متواليات تقويم العظام) ولكنها قد تشتمل أيضًا على بروتينات في نفس الكائن الحي (تسلسلات متماثلة) مشتقة من تكرار الجينات وإعادة ترتيبها. إذا كشفت محاذاة تسلسل متعدد لعائلة بروتينية عن مستوى شائع من التشابه في جميع أطوال البروتينات ، يشير PIR إلى العائلة على أنها عائلة متجانسة الشكل. يشار إلى المنطقة المتوافقة على أنها مجال متماثل الشكل ، وقد تشتمل هذه المنطقة على عدة مجالات تماثل أصغر يتم مشاركتها مع عائلات أخرى. يمكن تقسيم العائلات إلى فصائل فرعية أو تجميعها في عائلات فائقة بناءً على مستويات أعلى أو أقل من تشابه التسلسل. تشير قاعدة بيانات SCOP إلى 1296 عائلة وقاعدة بيانات CATH (الإصدار 1.7 بيتا) ، وتبلغ عن 1846 عائلة. عندما يتم فحص تسلسل البروتينات التي لها نفس الوظيفة بمزيد من التفصيل ، يتبين أن بعضها يشترك في تشابه تسلسل عالٍ. من الواضح أنهم أعضاء في نفس العائلة وفقًا للمعايير المذكورة أعلاه. ومع ذلك ، وجد البعض الآخر أن لديهم تشابهًا ضئيلًا جدًا ، أو حتى غير مهم ، في التسلسل مع أفراد الأسرة الآخرين. في مثل هذه الحالات ، غالبًا ما يمكن إثبات العلاقة الأسرية بين فردين بعيدين من العائلة A و C من خلال العثور على فرد إضافي من العائلة B يشترك في تشابه كبير مع كل من A و C. وبالتالي ، يوفر B رابطًا بين A و C. هو فحص المحاذاة البعيدة للمباريات المحفوظة للغاية. عند مستوى هوية 50٪ ، من المحتمل أن يكون للبروتينات نفس البنية ثلاثية الأبعاد ، كما أن الذرات المتطابقة في محاذاة التسلسل ستتراكب أيضًا في حدود 1 تقريبًا في النموذج الهيكلي. وبالتالي ، إذا كانت بنية أحد أفراد الأسرة معروفة ، فيمكن إجراء تنبؤ موثوق به لعضو ثانٍ من العائلة ، وكلما ارتفع مستوى الهوية ، كان التنبؤ أكثر موثوقية. يمكن إجراء النمذجة الهيكلية للبروتين عن طريق فحص مدى ملاءمة بدائل الأحماض الأمينية في قلب الهيكل ثلاثي الأبعاد. الأسرة (السياق الهيكلي) كما هو مستخدم في قاعدة بيانات FSSP (عائلات البروتينات المتشابهة هيكليًا) وموقع الويب DALI / FSSP ، وهما هيكلان لهما مستوى كبير من التشابه الهيكلي ولكن ليس بالضرورة تشابه تسلسل مهم. يتضمن الطي المشابه للعنصر الهيكلي مجموعة أكبر من الوحدات الهيكلية الثانوية في نفس التكوين. وبالتالي ، فإن البروتينات التي تشترك في نفس الطية لها نفس التركيبة من الهياكل الثانوية التي ترتبط بحلقات متشابهة. مثال على ذلك هو طية روسمان التي تتكون من عدة حلزونات ألفا متناوبة وخيوط متوازية. في قواعد بيانات SCOP و CATH و FSSP ، تم تصنيف هياكل البروتين المعروفة إلى مستويات هرمية من التعقيد الهيكلي مع الطية كمستوى أساسي من التصنيف. المجال المتماثل (سياق التسلسل) نمط تسلسل ممتد ، يتم العثور عليه عمومًا بواسطة طرق محاذاة التسلسل ، والذي يشير إلى أصل تطوري مشترك بين التسلسلات المتوافقة. مجال التماثل بشكل عام أطول من الزخارف. قد يشمل المجال كل تسلسل بروتين معين أو جزء فقط من التسلسل. بعض المجالات معقدة وتتكون من عدة مجالات تماثل أصغر أصبحت مرتبطة لتشكيل مجال أكبر أثناء التطور. يسمى المجال الذي يغطي تسلسلًا كاملاً المجال المتماثل بواسطة PIR (مصدر معلومات البروتين). الوحدة النمطية وهي منطقة من أنماط الأحماض الأمينية المحفوظة التي تشتمل على واحد أو أكثر من الأشكال وتعتبر وحدة أساسية للبنية أو الوظيفة. كما تم استخدام وجود وحدة لتصنيف البروتينات إلى عائلات. Motif (سياق التسلسل) نمط محفوظ من الأحماض الأمينية الموجود في بروتينين أو أكثر. في كتالوج بروسايت ، يمثل الشكل نمطًا من الأحماض الأمينية موجودًا في مجموعة من البروتينات التي لها نشاط كيميائي حيوي مماثل ، وغالبًا ما تكون بالقرب من الموقع النشط للبروتين. أمثلة على قواعد بيانات نموذج التسلسل هي كتالوج Prosite وقاعدة بيانات Stanford Motifs. [2] الحافز (السياق الهيكلي) مزيج من عدة عناصر هيكلية ثانوية ناتجة عن طي المقاطع المجاورة لسلسلة البولي ببتيد في تكوين ثلاثي الأبعاد محدد. مثال على ذلك هو شكل الحلزون الحلزوني. يشار إلى الزخارف الهيكلية أيضًا باسم الهياكل والطيات الفائقة الثانوية. مصفوفة التسجيل الخاصة بالموقع (سياق التسلسل ، المعروف أيضًا باسم مصفوفة الوزن أو الدرجات) تمثل منطقة محفوظة في محاذاة تسلسل متعددة بدون فجوات. يمثل كل عمود مصفوفة التباين الموجود في عمود واحد لمحاذاة التسلسل المتعدد. مصفوفة التسجيل الخاصة بالموضع — يمثل ثلاثي الأبعاد (السياق الهيكلي) تباين الأحماض الأمينية الموجود في محاذاة البروتينات التي تقع في نفس الفئة الهيكلية. تمثل أعمدة المصفوفة تباين الأحماض الأمينية الموجود في موضع حمض أميني واحد في الهياكل المتوافقة. الهيكل الأساسي هو تسلسل الأحماض الأمينية الخطية للبروتين ، وهو كيميائيًا عبارة عن سلسلة بولي ببتيد تتكون من أحماض أمينية مرتبطة بروابط ببتيدية. الملف الشخصي (سياق التسلسل) مصفوفة تسجيل تمثل محاذاة تسلسل متعدد لعائلة بروتينية. عادة ما يتم الحصول على ملف التعريف من منطقة محفوظة جيدًا في محاذاة متعددة التسلسل. الملف الشخصي في شكل مصفوفة مع كل عمود يمثل موضعًا في المحاذاة وكل صف واحد من الأحماض الأمينية. تعطي قيم المصفوفة احتمال وجود كل حمض أميني في الموضع المقابل في المحاذاة. يتم نقل ملف التعريف على طول التسلسل الهدف لتحديد أفضل مناطق التسجيل بواسطة خوارزمية برمجة ديناميكية. يُسمح بالفجوات أثناء المطابقة ويتم تضمين عقوبة الفجوة في هذه الحالة كدرجة سلبية في حالة عدم مطابقة الأحماض الأمينية. يمكن أيضًا تمثيل ملف تعريف التسلسل بنموذج ماركوف المخفي ، المشار إليه باسم ملف تعريف HMM. الملف الشخصي (السياق الهيكلي) مصفوفة تسجيل تمثل الأحماض الأمينية التي يجب أن تتناسب جيدًا والتي يجب أن تتناسب بشكل سيئ في المواضع المتسلسلة في بنية بروتينية معروفة. تمثل أعمدة الملف الشخصي مواضع متسلسلة في الهيكل ، وتمثل صفوف الملف الشخصي الأحماض الأمينية العشرين. كما هو الحال مع ملف تعريف التسلسل ، يتم نقل ملف التعريف الهيكلي على طول تسلسل مستهدف للعثور على أعلى درجة محاذاة ممكنة بواسطة خوارزمية برمجة ديناميكية. قد يتم تضمين الثغرات والحصول على عقوبة. توفر النتيجة الناتجة مؤشراً على ما إذا كان البروتين المستهدف قد يعتمد مثل هذا الهيكل أم لا. هيكل رباعي التكوين ثلاثي الأبعاد لجزيء بروتين يشتمل على العديد من سلاسل عديد الببتيد المستقلة. البنية الثانوية التفاعلات التي تحدث بين مجموعات C و O و NH على الأحماض الأمينية في سلسلة بولي ببتيد لتشكيل حلزونات α و ولفافات وحلقات وأشكال أخرى ، والتي تسهل الطي إلى ثلاثي الأبعاد بنية. العائلة الفائقة هي مجموعة من العائلات البروتينية لها نفس الأطوال أو ذات أطوال مختلفة مرتبطة بتشابه تسلسل بعيد ولكن يمكن اكتشافه. وبالتالي فإن أفراد الأسرة الفائقة لديهم أصل تطوري مشترك. في الأصل ، حدد دايهوف الحد الأقصى لحالة الأسرة الفائقة بأنه فرصة ألا تكون التسلسلات مرتبطة بـ 10 6 ، على أساس درجة المحاذاة (دايهوف وآخرون 1978). يتم وضع البروتينات ذات الهويات القليلة في محاذاة التسلسلات ولكن مع عدد مشترك مقنع من السمات الهيكلية والوظيفية في نفس العائلة الفائقة. على مستوى البنية ثلاثية الأبعاد ، ستشترك بروتينات العائلة الفائقة في السمات الهيكلية المشتركة مثل الطية المشتركة ، ولكن قد تكون هناك أيضًا اختلافات في عدد وترتيب الهياكل الثانوية. يستخدم مورد PIR المصطلح العائلات الفائقة متجانسة الشكل للإشارة إلى العائلات الفائقة التي تتكون من متواليات يمكن محاذاتها من طرف إلى آخر ، مما يمثل مشاركة في مجال تجانس تسلسل واحد ، وهي منطقة تشابه تمتد خلال المحاذاة. قد يشتمل هذا المجال أيضًا على مجالات تماثل أصغر يتم مشاركتها مع عائلات البروتين الأخرى والعائلات الفائقة. على الرغم من أن تسلسل بروتين معين قد يحتوي على مجالات موجودة في العديد من العائلات الفائقة ، مما يشير إلى تاريخ تطوري معقد ، فسيتم تخصيص التسلسلات لعائلة واحدة متماثلة الشكل بناءً على وجود تشابه خلال محاذاة تسلسل متعدد. قد تتضمن محاذاة العائلة الفائقة أيضًا مناطق لا تتم محاذاتها داخل أو في نهايات المحاذاة. في المقابل ، تتطابق التسلسلات في نفس العائلة جيدًا خلال المحاذاة. البنية الفائقة الثانوية مصطلح له معنى مشابه لعنصر بنيوي. الهيكل الثلاثي هو هيكل ثلاثي الأبعاد أو كروي يتكون من التعبئة معًا أو طي الهياكل الثانوية لسلسلة بولي ببتيد. [1]

التنبؤ بالهيكل الثانوي عبارة عن مجموعة من التقنيات في المعلوماتية الحيوية التي تهدف إلى التنبؤ بالتركيبات الثانوية المحلية للبروتينات بناءً على معرفة تسلسل الأحماض الأمينية الخاصة بها فقط. بالنسبة للبروتينات ، يتألف التنبؤ من تعيين مناطق من تسلسل الأحماض الأمينية على أنها حلزونات ألفا محتملة ، أو خيوط بيتا (غالبًا ما يشار إليها على أنها مطابقة "ممتدة") ، أو المنعطفات. يتم تحديد نجاح التنبؤ من خلال مقارنته بنتائج خوارزمية DSSP (أو ما شابه ذلك مثل STRIDE) المطبقة على التركيب البلوري للبروتين. تم تطوير خوارزميات متخصصة للكشف عن أنماط محددة محددة جيدًا مثل الحلزونات الغشائية والملفات الملفوفة في البروتينات. [1]

تم الادعاء بأن أفضل الطرق الحديثة للتنبؤ بالبنية الثانوية في البروتينات تصل إلى دقة 80٪ بعد استخدام التعلم الآلي ومحاذاة التسلسل [3] تسمح هذه الدقة العالية باستخدام التنبؤات كميزة تعمل على تحسين التعرف على الطيات والتنبؤ بهيكل البروتين من البداية ، وتصنيف الزخارف الهيكلية ، وصقل محاذاة التسلسل. يتم تقييم دقة طرق التنبؤ بالبنية الثانوية الحالية للبروتين في معايير أسبوعية مثل LiveBench و EVA.

تحرير الخلفية

ركزت الطرق المبكرة للتنبؤ بالهيكل الثانوي ، التي تم تقديمها في الستينيات وأوائل السبعينيات ، [4] [5] [6] [7] [8] على تحديد حلزونات ألفا المحتملة واستندت أساسًا إلى نماذج انتقال اللولب الحلزوني. [9] تم تقديم تنبؤات أكثر دقة بشكل ملحوظ والتي تضمنت أوراق بيتا في السبعينيات واعتمدت على التقييمات الإحصائية بناءً على معلمات الاحتمالية المستمدة من الهياكل المعروفة التي تم حلها. هذه الطرق ، المطبقة على تسلسل واحد ، عادة ما تكون دقيقة بنسبة 60-65 ٪ على الأكثر ، وغالبًا ما تكون غير متوقعة على أوراق بيتا. [1] يمكن استغلال الحفظ التطوري للهياكل الثانوية من خلال التقييم المتزامن للعديد من المتواليات المتجانسة في محاذاة متعددة التسلسل ، عن طريق حساب ميل البنية الثانوية الصافية لعمود محاذي من الأحماض الأمينية. بالتنسيق مع قواعد بيانات أكبر لهياكل البروتين المعروفة وطرق التعلم الآلي الحديثة مثل الشبكات العصبية وآلات ناقلات الدعم ، يمكن لهذه الطرق تحقيق دقة إجمالية تصل إلى 80٪ في البروتينات الكروية. [10] يبلغ الحد الأعلى النظري للدقة حوالي 90٪ ، [10] ويرجع ذلك جزئيًا إلى الخصائص المميزة في تعيين DSSP بالقرب من نهايات الهياكل الثانوية ، حيث تختلف المطابقات المحلية في ظل الظروف الأصلية ولكن قد تضطر إلى افتراض تشابه واحد في البلورات بسبب لقيود التعبئة. علاوة على ذلك ، لا تأخذ طرق التنبؤ بالهيكل الثانوي النموذجي في الحسبان تأثير البنية الثلاثية على تكوين بنية ثانوية على سبيل المثال ، قد يظل التسلسل المتوقع على أنه حلزون محتمل قادرًا على تبني تشكّل بيتا إذا كان موجودًا داخل بيتا. منطقة ورقة البروتين وسلاسلها الجانبية تتناسب بشكل جيد مع جيرانها. يمكن أن تؤدي التغييرات التوافقية الدرامية المتعلقة بوظيفة البروتين أو بيئته أيضًا إلى تغيير البنية الثانوية المحلية.

المنظور التاريخي تحرير

حتى الآن ، تم تطوير أكثر من 20 طريقة مختلفة للتنبؤ بالهيكل الثانوي. كانت إحدى الخوارزميات الأولى هي طريقة Chou-Fasman ، والتي تعتمد بشكل أساسي على معاملات الاحتمالية المحددة من الترددات النسبية لظهور كل حمض أميني في كل نوع من الهياكل الثانوية. [11] إن معلمات Chou-Fasman الأصلية ، التي تم تحديدها من عينة صغيرة من الهياكل التي تم حلها في منتصف السبعينيات ، تنتج نتائج سيئة مقارنة بالطرق الحديثة ، على الرغم من تحديث المعلمات منذ نشرها لأول مرة. طريقة Chou-Fasman دقيقة تقريبًا بنسبة 50-60٪ في توقع الهياكل الثانوية. [1]

البرنامج الملحوظ التالي كان طريقة GOR هي طريقة قائمة على نظرية المعلومات. يستخدم الأسلوب الاحتمالي الأكثر قوة للاستدلال البايزي. [12] لا تأخذ طريقة GOR في الحسبان فقط احتمال أن يكون لكل حمض أميني بنية ثانوية معينة ، ولكن أيضًا الاحتمال الشرطي للحمض الأميني بافتراض كل بنية بالنظر إلى مساهمات جيرانها (لا تفترض أن الجيران لديهم نفس الهيكل). يعتبر هذا النهج أكثر حساسية وأكثر دقة من نهج Chou و Fasman لأن الميول الهيكلية للأحماض الأمينية قوية فقط لعدد صغير من الأحماض الأمينية مثل البرولين والجليسين. يمكن أن تؤدي المساهمات الضعيفة من كل من الجيران إلى تأثيرات قوية بشكل عام. كانت طريقة GOR الأصلية دقيقة بنسبة 65٪ تقريبًا وهي أكثر نجاحًا بشكل كبير في توقع حلزونات ألفا من صفائح بيتا ، والتي غالبًا ما يتم وصفها بشكل خاطئ على أنها حلقات أو مناطق غير منظمة. [1]

خطوة كبيرة أخرى إلى الأمام ، كانت استخدام أساليب التعلم الآلي. تم استخدام طرق الشبكات العصبية الاصطناعية الأولى. كمجموعات تدريب ، يستخدمون الهياكل التي تم حلها لتحديد الأشكال المتسلسلة المشتركة المرتبطة بترتيبات معينة للهياكل الثانوية. هذه الأساليب دقيقة بنسبة تزيد عن 70٪ في تنبؤاتها ، على الرغم من أن خيوط بيتا لا تزال غير متوقعة في كثير من الأحيان بسبب نقص المعلومات الهيكلية ثلاثية الأبعاد التي من شأنها أن تسمح بتقييم أنماط الترابط الهيدروجينية التي يمكن أن تعزز تشكيل التشكل الموسع المطلوب لوجود ورقة بيتا كاملة. [1] PSIPRED و JPRED من أكثر البرامج المعروفة التي تعتمد على الشبكات العصبية للتنبؤ بالبنية الثانوية للبروتين. بعد ذلك ، أثبتت آلات ناقلات الدعم أنها مفيدة بشكل خاص للتنبؤ بمواقع المنعطفات ، والتي يصعب تحديدها باستخدام الأساليب الإحصائية. [13] [14]

تحاول امتدادات تقنيات التعلم الآلي التنبؤ بخصائص محلية أكثر دقة للبروتينات ، مثل زوايا العمود الفقري ثنائية السطوح في المناطق غير المخصصة. تم تطبيق كل من SVMs [15] والشبكات العصبية [16] على هذه المشكلة. [13] في الآونة الأخيرة ، يمكن التنبؤ بدقة بزوايا الالتواء ذات القيمة الحقيقية بواسطة SPINE-X واستخدامها بنجاح في تنبؤ البنية الأولية. [17]

تحسينات أخرى تحرير

يُذكر أنه بالإضافة إلى تسلسل البروتين ، يعتمد تكوين البنية الثانوية على عوامل أخرى. على سبيل المثال ، تم الإبلاغ عن أن اتجاهات البنية الثانوية تعتمد أيضًا على البيئة المحلية ، [18] إمكانية الوصول إلى المذيبات للمخلفات ، [19] فئة بنية البروتين ، [20] وحتى الكائن الحي الذي يتم الحصول على البروتينات منه. [21] بناءً على هذه الملاحظات ، أظهرت بعض الدراسات أنه يمكن تحسين التنبؤ بالهيكل الثانوي عن طريق إضافة معلومات حول فئة بنية البروتين ، [22] مساحة السطح التي يمكن الوصول إليها البقايا [23] [24] وكذلك معلومات رقم الاتصال. [25]

أصبح الدور العملي لتنبؤ بنية البروتين الآن أكثر أهمية من أي وقت مضى. [26] يتم إنتاج كميات هائلة من بيانات تسلسل البروتين عن طريق جهود تسلسل الحمض النووي الحديثة واسعة النطاق مثل مشروع الجينوم البشري.على الرغم من الجهود المبذولة على مستوى المجتمع في علم الجينوم البنيوي ، فإن ناتج الهياكل البروتينية المحددة تجريبيًا - عادةً عن طريق التصوير البلوري بالأشعة السينية أو التحليل الطيفي بالأشعة السينية أو التحليل الطيفي للأشعة السينية - الذي يستغرق وقتًا طويلاً وباهظ التكلفة نسبيًا - يتخلف كثيرًا عن إنتاج تسلسل البروتين.

لا يزال التنبؤ ببنية البروتين مهمة صعبة للغاية وغير محسومة. المشكلتان الرئيسيتان هما حساب الطاقة الخالية من البروتين وإيجاد الحد الأدنى العالمي من هذه الطاقة. يجب أن تستكشف طريقة التنبؤ ببنية البروتين مساحة الهياكل البروتينية المحتملة الكبيرة بشكل فلكي. يمكن تجاوز هذه المشكلات جزئيًا في أساليب النمذجة "المقارنة" أو التماثل والتعرف على الطيات ، حيث يتم تقليم مساحة البحث من خلال افتراض أن البروتين المعني يتبنى بنية قريبة من البنية المحددة تجريبياً لبروتين متماثل آخر. من ناحية أخرى ، يجب أن تحل طرق التنبؤ ببنية بروتين de novo هذه المشكلات بشكل صريح. تمت مراجعة التقدم والتحديات في التنبؤ ببنية البروتين بواسطة Zhang. [27]

قبل النمذجة تحرير

تم تحسين معظم طرق نمذجة البنية الثلاثية ، مثل Rosetta ، لنمذجة البنية الثلاثية لمجالات البروتين الفردي. خطوة تسمى تحليل المجال، أو توقع حدود المجال، عادة ما يتم إجراؤه أولاً لتقسيم البروتين إلى مجالات هيكلية محتملة. كما هو الحال مع بقية تنبؤات البنية الثلاثية ، يمكن عمل ذلك نسبيًا من الهياكل المعروفة [28] أو البداية مع التسلسل فقط (عادةً عن طريق التعلم الآلي ، بمساعدة التباين). [29] يتم ربط هياكل المجالات الفردية معًا في عملية تسمى تجميع المجال لتشكيل الهيكل الثالثي النهائي. [30] [31]

البداية تحرير نمذجة البروتين

الطرق القائمة على الطاقة والشظايا تحرير

بداية- أو من جديد- تسعى طرق نمذجة البروتين إلى بناء نماذج بروتينية ثلاثية الأبعاد "من نقطة الصفر" ، أي تستند إلى مبادئ فيزيائية بدلاً من (مباشرة) على هياكل تم حلها سابقًا. هناك العديد من الإجراءات الممكنة التي إما تحاول تقليد طي البروتين أو تطبيق بعض الأساليب العشوائية للبحث عن الحلول الممكنة (على سبيل المثال ، التحسين العالمي لوظيفة طاقة مناسبة). تميل هذه الإجراءات إلى طلب موارد حسابية ضخمة ، وبالتالي لم يتم تنفيذها إلا لبروتينات دقيقة. للتنبؤ ببنية البروتين من جديد بالنسبة للبروتينات الأكبر حجمًا ، سيتطلب ذلك خوارزميات أفضل وموارد حسابية أكبر مثل تلك التي توفرها إما أجهزة الكمبيوتر العملاقة القوية (مثل Blue Gene أو MDGRAPE-3) أو الحوسبة الموزعة (مثل Folding @ home و Human Proteome Folding Project و Rosetta @ Home). على الرغم من أن هذه الحواجز الحسابية واسعة ، إلا أن الفوائد المحتملة لعلم الجينوم البنيوي (بالطرق المتوقعة أو التجريبية) تحقق ذلك البداية التنبؤ الهيكلي مجال بحث نشط. [27]

اعتبارًا من عام 2009 ، يمكن محاكاة بروتين مكون من 50 بقايا ذرة تلو ذرة على كمبيوتر عملاق لمدة 1 مللي ثانية. [٣٢] اعتبارًا من عام 2012 ، يمكن أخذ عينات حالة مستقرة قابلة للمقارنة على سطح مكتب قياسي باستخدام بطاقة رسومات جديدة وخوارزميات أكثر تعقيدًا. [33] يمكن تحقيق نطاقات زمنية للمحاكاة أكبر بكثير باستخدام النمذجة الخشنة الحبيبات. [34] [35]

التباين التطوري لتوقع جهات الاتصال ثلاثية الأبعاد تحرير

نظرًا لأن التسلسل أصبح أكثر شيوعًا في التسعينيات ، استخدمت العديد من المجموعات محاذاة تسلسل البروتين للتنبؤ بالطفرات المرتبطة وكان من المأمول استخدام هذه البقايا المشتركة للتنبؤ بالهيكل الثالث (باستخدام القياس إلى قيود المسافة من الإجراءات التجريبية مثل NMR). الافتراض هو عندما تكون طفرات البقايا المفردة ضارة قليلاً ، فقد تحدث طفرات تعويضية لإعادة استقرار تفاعلات البقايا والبقايا. استخدم هذا العمل المبكر ما يعرف باسم محلي طرق لحساب الطفرات المرتبطة من تسلسل البروتين ، ولكنها عانت من الارتباطات الخاطئة غير المباشرة التي تنتج عن معالجة كل زوج من البقايا على أنها مستقلة عن جميع الأزواج الأخرى. [36] [37] [38]

في عام 2011 مختلف وهذه المرة عالمي أظهر النهج الإحصائي أن المخلفات المتصاعدة المتوقعة كانت كافية للتنبؤ بالطي ثلاثي الأبعاد للبروتين ، بشرط وجود تسلسلات كافية متاحة (هناك حاجة إلى 1000 تسلسل متماثل). [39] لا تستخدم الطريقة EVfold نمذجة متجانسة أو خيوط أو أجزاء هيكلية ثلاثية الأبعاد ويمكن تشغيلها على جهاز كمبيوتر شخصي قياسي حتى بالنسبة للبروتينات التي تحتوي على مئات البقايا. تم الآن إثبات دقة جهات الاتصال التي تم التنبؤ بها باستخدام هذا النهج والأساليب ذات الصلة في العديد من الهياكل المعروفة وخرائط الاتصال ، [40] [41] [42] بما في ذلك التنبؤ ببروتينات الغشاء غير المحلولة تجريبياً. [43]

تحرير نمذجة البروتين المقارن

تستخدم نمذجة البروتين المقارنة هياكل تم حلها مسبقًا كنقاط بداية أو قوالب. هذا فعال لأنه يبدو أنه على الرغم من أن عدد البروتينات الفعلية كبير ، إلا أن هناك مجموعة محدودة من الأشكال الهيكلية من الدرجة الثالثة التي تنتمي إليها معظم البروتينات. لقد تم اقتراح وجود حوالي 2000 طية بروتين مميزة في الطبيعة ، على الرغم من وجود العديد من الملايين من البروتينات المختلفة. يمكن أن تتحد نمذجة البروتين المقارن مع التباين التطوري في تنبؤ الهيكل. [44]

يمكن أيضًا تقسيم هذه الطرق إلى مجموعتين: [27]

    يعتمد على افتراض معقول بأن بروتينين متماثلين سيشتركان في بنى متشابهة جدًا. نظرًا لأن طية البروتين يتم الحفاظ عليها تطوريًا أكثر من تسلسل الأحماض الأمينية ، يمكن نمذجة التسلسل المستهدف بدقة معقولة على قالب ذي صلة بعيدة جدًا ، شريطة أن يتم تمييز العلاقة بين الهدف والقالب من خلال محاذاة التسلسل. لقد تم اقتراح أن عنق الزجاجة الأساسي في النمذجة المقارنة ينشأ من صعوبات في المحاذاة بدلاً من أخطاء في تنبؤ الهيكل بالنظر إلى محاذاة جيدة معروفة. [45] مما لا يثير الدهشة ، أن نمذجة التماثل تكون أكثر دقة عندما يكون للهدف والقالب تسلسلات متشابهة. [46] بمسح تسلسل الأحماض الأمينية لبنية غير معروفة مقابل قاعدة بيانات الهياكل المحلولة. في كل حالة ، يتم استخدام وظيفة تسجيل النقاط لتقييم توافق التسلسل مع الهيكل ، وبالتالي إنتاج نماذج ثلاثية الأبعاد ممكنة. يُعرف هذا النوع من الطريقة أيضًا باسم التعرف على أضعاف 3D-1D نظرًا لتحليل التوافق بين الهياكل ثلاثية الأبعاد وتسلسل البروتين الخطي. أدت هذه الطريقة أيضًا إلى ظهور طرق تؤدي إلى البحث للطي العكسي من خلال تقييم توافق بنية معينة مع قاعدة بيانات كبيرة من التسلسلات ، وبالتالي التنبؤ بالتسلسلات التي لديها القدرة على إنتاج حظيرة معينة.

نمذجة مطابقة السلسلة الجانبية تحرير

يمثل التغليف الدقيق للسلاسل الجانبية للأحماض الأمينية مشكلة منفصلة في تنبؤ بنية البروتين. تتضمن الطرق التي تعالج على وجه التحديد مشكلة التنبؤ بهندسة السلسلة الجانبية التخلص من نهايات الطريق المسدود وطرق المجال المتوسط ​​المتسقة ذاتيًا. عادة ما يتم تحديد مطابقة السلسلة الجانبية ذات الطاقة المنخفضة على العمود الفقري الصلب متعدد الببتيد وباستخدام مجموعة من مطابقة السلسلة الجانبية المنفصلة المعروفة باسم "الروتامير". تحاول الطرق تحديد مجموعة الدوارات التي تقلل الطاقة الإجمالية للنموذج.

تستخدم هذه الطرق مكتبات rotamer ، وهي مجموعات من المطابقات المفضلة لكل نوع من المخلفات في البروتينات. قد تحتوي مكتبات Rotamer على معلومات حول التشكل وتواترها والانحرافات المعيارية حول متوسط ​​الزوايا ثنائية الأضلاع ، والتي يمكن استخدامها في أخذ العينات. [٤٧] تُشتق مكتبات Rotamer من المعلوماتية الحيوية الهيكلية أو غيرها من التحليلات الإحصائية لتوافقات السلسلة الجانبية في الهياكل التجريبية المعروفة للبروتينات ، مثل تجميع المطابقات المرصودة للكربون رباعي السطوح بالقرب من التدرج (60 درجة ، 180 درجة ، -60 درجة) القيم.

يمكن أن تكون مكتبات Rotamer مستقلة عن العمود الفقري أو تعتمد على البنية الثانوية أو تعتمد على العمود الفقري. لا تشير مكتبات rotamer المستقلة عن العمود الفقري إلى تشكيل العمود الفقري ، ويتم حسابها من جميع السلاسل الجانبية المتاحة من نوع معين (على سبيل المثال ، المثال الأول لمكتبة rotamer ، قام به Ponder and Richards في Yale في عام 1987). [48] ​​المكتبات المعتمدة على البنية الثانوية تقدم زوايا ثنائية الأضلاع و / أو ترددات دوارة مختلفة ل α -helix ، β -sheet ، أو هياكل ثانوية للملف. [49] تقدم مكتبات الروتامر المعتمدة على العمود الفقري مطابقة و / أو ترددات تعتمد على تشكيل العمود الفقري المحلي كما هو محدد بواسطة زوايا العمود الفقري ثنائية السطوح ϕ < displaystyle phi> و ψ < displaystyle psi> ، بغض النظر عن البنية الثانوية. [50]

يتم تقديم الإصدارات الحديثة من هذه المكتبات كما هو مستخدم في معظم البرامج كتوزيعات متعددة الأبعاد للاحتمال أو التردد ، حيث تتوافق القمم مع مطابقة زاوية ثنائية الأضلاع التي تعتبر دوارات فردية في القوائم. تعتمد بعض الإصدارات على بيانات منظمة بعناية وتستخدم بشكل أساسي للتحقق من صحة البنية ، [51] بينما يؤكد البعض الآخر على الترددات النسبية في مجموعات بيانات أكبر بكثير وهي النموذج المستخدم في المقام الأول للتنبؤ بالبنية ، مثل مكتبات Dunbrack rotamer. [52]

تعد طرق التعبئة ذات السلسلة الجانبية أكثر فائدة لتحليل النواة الكارهة للماء للبروتين ، حيث تكون السلاسل الجانبية معبأة بشكل أكثر قربًا وتواجه صعوبة أكبر في معالجة القيود الأكثر مرونة ومرونة أعلى لبقايا السطح ، والتي غالبًا ما تشغل العديد من المطابقات الدوارة بدلاً من واحدة فقط. [53] [54]

في حالة المجمعات المكونة من بروتينين أو أكثر ، حيث تكون هياكل البروتينات معروفة أو يمكن التنبؤ بها بدقة عالية ، يمكن استخدام طرق الالتحام بالبروتين والبروتين للتنبؤ ببنية المركب. تساعد المعلومات الخاصة بتأثير الطفرات في مواقع محددة على تقارب المجمع في فهم البنية المعقدة وتوجيه طرق الالتحام.

يوجد عدد كبير من أدوات البرمجيات للتنبؤ ببنية البروتين. تشمل المناهج نمذجة التماثل ، وخيوط البروتين ، البداية الطرق والتنبؤ بالهيكل الثانوي والتنبؤ باللولب الغشائي وببتيد الإشارة. تتضمن بعض الأساليب الناجحة الحديثة القائمة على تجارب CASP I-TASSER و HHpred و AlphaFold. للحصول على قائمة كاملة انظر المقال الرئيسي.

تقييم خوادم التنبؤ بالهيكل الآلي تحرير

CASP ، التي تعني التقييم النقدي لتقنيات التنبؤ ببنية البروتين ، هي تجربة على مستوى المجتمع للتنبؤ ببنية البروتين تجري كل عامين منذ عام 1994. توفر CASP فرصة لتقييم جودة المنهجية البشرية غير الآلية المتاحة ( فئة الإنسان) والخوادم التلقائية للتنبؤ بهيكل البروتين (فئة الخادم ، المقدمة في CASP7). [55]

يقوم خادم CAMEO3D Continuous Automated Model EvaluatiOn Server بتقييم خوادم التنبؤ الآلي لبنية البروتين على أساس أسبوعي باستخدام تنبؤات عمياء لهياكل البروتين التي تم إصدارها حديثًا. تنشر CAMEO النتائج على موقعها على الإنترنت.


البروتينات المتحولة: بروتينات جانوس للبيولوجيا الهيكلية

إن النموذج الهيكلي الذي يشفره تسلسل البروتين لطية أصلية فريدة ثلاثية الأبعاد لا يعترف باللدونة الجوهرية المغلفة في المناظر الطبيعية الخالية من الطاقة المطابقة. البروتينات المتحولة هي فئة تم اكتشافها مؤخرًا من الجزيئات الحيوية التي توضح هذه اللدونة من خلال الانطواء إلى اثنين على الأقل من هياكل الحالة الأصلية المتميزة ذات الاستقرار المماثل في غياب الروابط أو العوامل المساعدة لتسهيل تبديل الطيات. تُظهر القائمة الموسعة للبروتينات المتحولة بوضوح أن هذه البروتينات ليست مجرد انحرافات في تطور البروتين ، ولكنها قد تكون في الواقع نتيجة لأنماط مميزة في ضغط الاختيار مثل تلك الموجودة في التطور المشترك بين الفيروس والمضيف. في هذه المراجعة ، قمنا بوصف العلاقات الهيكلية والوظيفة التي لوحظت في أنظمة البروتين المتحولة المدروسة جيدًا ، مع التركيز بشكل خاص على كيفية عزل البقايا الوظيفية أو كشفها في طيات البروتين. نناقش أيضًا آثار التحول على تطور البروتين والجهود الجارية للتنبؤ بالأنظمة المتحولة من خصائص التسلسل وحدها.

1 المقدمة

إن فرضية التسلسل الأحادي التركيب - الوظيفة هي المحور الرئيسي الذي أبقى عجلات البيولوجيا الهيكلية تدور لعقود بعد أن حل جون كيندرو وزملاؤه أول بنية بلورية للميوجلوبين في عام 1958 [1]. تنص هذه الفرضية على أن تسلسل الأحماض الأمينية لرموز البروتين لهيكل الحالة الأصلية الفريد ، والذي يؤدي بعد ذلك وظيفة مميزة. في العقدين الماضيين ، كان هناك عدد من الاكتشافات التي تحدت هذه الفرضية ، لدرجة جعلها عفا عليها الزمن. على سبيل المثال ، نحن نعلم الآن وجود بروتينات مضطربة جوهريًا [2-5] ، وهي سلاسل متعددة الببتيد بدون بنية ثانوية أو ثالثة مستقرة ، ولكنها مع ذلك تؤدي وظائف حيوية من خلال مجموعة متنوعة من الآليات مثل الطي عند الارتباط [6] أو اكتساب الهيكل بعد التعديلات اللاحقة للترجمة [7]. لقد عثرنا على البروتينات الإضافية [8،9] القادرة على أداء أكثر من وظيفة واحدة باستخدام نفس تسلسل عديد الببتيد. نحن نفهم الآن أيضًا أن الوظيفة الجزيئية الحيوية لا تمليها فقط البنية ، كما افترضنا في الأصل ، ولكن أيضًا من خلال الديناميكيات الجزيئية الحيوية التي تحدث على نطاقات زمنية متعددة [10،11]. أخيرًا ، رأينا ظهور البروتينات المتحولة ، القادرة على الانطواء في أكثر من طوبولوجيا هيكلية فريدة [12]. في الأساطير الرومانية القديمة ، كان يانوس إله التحولات والازدواجية ، البداية والنهاية ، الحرب والسلام ، والوصول والمغادرة. تجسدت طبيعته المزدوجة في تصويره كإله برأسين متقابلين في اتجاهين متعاكسين. نظرًا لقدرتها على تبني اثنين أو أكثر من هياكل الحالة الأصلية المتميزة ، فإن البروتينات المتحولة هي بروتينات جانوس للبيولوجيا الهيكلية.

توجد البروتينات المتحولة في اثنين أو أكثر من الهياكل المحددة جيدًا في غياب الروابط أو العوامل المساعدة (الشكل 1) [13-15]. هذا يميزهم عن البروتينات التي تخضع لإعادة الترتيب التوافقي بعد أحداث الربط. في حين أن عدم التجانس الهيكلي هو السمة المميزة للبروتينات المتحولة ، فإننا لا نعتبر البروتين متحولًا لمجرد أنه يتبنى مجموعة غير متجانسة. على سبيل المثال ، البروتينات المضطربة جوهريًا ، والتي تتحول سريعًا بين عدد من التوافقات المتشابهة ، لا تعتبر بروتينات متحولة لأنها تفتقر إلى بنى ثلاثية الأبعاد مستقرة. في إطار هذا التعريف ، ومع ذلك ، هناك تباين كبير في ميزات البروتينات المتحولة المعروفة حاليًا. على سبيل المثال ، في حالة lymphotactin [16] و IscU [17] ، يمكن للهيكلين التحويل المتبادل بشكل عكسي خلال 1 ثانية تقريبًا ولهما أيضًا شركاء ربط متميزون داخل الخلية. في حالات أخرى مثل KaiB [18] و Mad2 [19] ، يستغرق الأمر ساعات حتى يتم التحويل البيني للتطابقين ، ويحتوي أحد الهياكل فقط على مكون ربط المصب. توضح البروتينات المتحولة القابلية للتطويع المتأصلة في المناظر الطبيعية للطاقة الخالية من البروتين وهي أمثلة كتابية لسبب وجوب النظر إلى ما وراء الهياكل الجزيئية الحيوية الثابتة الفردية إذا أردنا فهم الوظيفة والخلل في مجملها.

الشكل 1. المناظر الطبيعية للطاقة الحرة التوافقية التمثيلية للبروتين الذي يطوي في هيكل واحد (أحادي الشكل ، أ) وبروتين متحول ينقسم إلى بنيتين متميزتين (ب). يحتوي البروتين أحادي الشكل في هذه الحالة على وظيفة بيولوجية واحدة ، بينما يمكن للبروتين المتحولة استخدام عدم تجانسه التوافقي لأداء أكثر من وظيفة بيولوجية واحدة.

في هذه المراجعة ، وصفنا أولاً السمات الرئيسية لخمسة أنظمة بروتينية متحولة تم وصفها هيكليًا حتى الآن: lymphotactin و KaiB و IscU و Mad2 و RfaH. نحن نركز على هياكل المطابقتين وكيف أن التسلسل الفردي قادر على استيعاب حالتين أصليتين. نحدد أيضًا كيف أن الهيكل قادر على إبلاغ الوظيفة. هذه المجموعة من البروتينات المتحولة ليست شاملة ، والبروتينات الأخرى التي تم وصفها بأنها متحولة تشمل selecase [20] و MinE [21] و CLIC [22] و HIV-1 العكسي [23]. بعد هذا الوصف لخمسة بروتينات متحولة ، نقوم بتفصيل العلاقة المثيرة بين البروتينات المتحولة وتطور البروتين ، بالإضافة إلى الجهود التي تم بذلها للتنبؤ بالبروتينات المتحولة باستخدام معلومات التسلسل وحدها. أخيرًا ، نشير إلى المجموعة التآزرية للطرق التي عززت فهمنا الحالي للبروتينات المتحولة.

2. تبديل الطيات وعواقبه في أنظمة البروتين المتحولة الهامة

2.1. ليمفوتكتين

من أوائل البروتينات التي تم التعرف على أنها متحولة كان الليمفوتكتين البشري المكون من 93 بقايا [16] (الشكل 2) (Ltn ، المعروف أيضًا باسم XCL1). Ltn هو عضو في عائلة XC من الكيموكينات وهو غير معتاد في وجود بقايا N-terminal Cys واحدة فقط ورابطة ثاني كبريتيد داخل الجزيء ، على عكس أفراد عائلات CC و CXC و CX3C ، التي تحتوي على أربعة Cys و 2 سندات ثنائي كبريتيد كل [24،25].

الشكل 2. (أ) يوجد Lymphotactin (Ltn) في حالة توازن بين طية chemokine α + (Ltn10 ، PDB ID: 1J8I) وطي جديد كامل الأبعاد (Ltn40 ، PDB ID: 2JP1). (ب) تظهر العناصر الهيكلية الثانوية لطيات Ltn10 و Ltn40 كدالة في التسلسل. (ج) يتم تثبيت واجهة Ltn40 dimer (أسفل) بثلاثة صفوف من المخلفات الكارهة للماء (تظهر في المجالات الزرقاء والحمراء والخضراء) التي تعمل بشكل عمودي على مستوى المونومر. غالبًا ما تتعرض هذه البقايا للمذيبات في Ltn10 (أعلى) ، في حين أن البقايا الموجودة في قلب Ltn10 (مثل Phe39 و Val59 و Val60 ، كما هو موضح على شكل أعواد صفراء) معرضة للمذيبات في Ltn40. (د) (أعلى) 1 H-15 N أطياف الارتباط الكمي أحادي النواة (HSQC) لـ Ltn عند 10 درجات مئوية / 200 ملي مول كلوريد الصوديوم (يسار) ، 37 درجة مئوية / 150 ملي كلوريد الصوديوم (وسط) و 40 درجة مئوية / بدون ملح (يمين) ) ، حيث يوجد Ltn كـ Ltn10 ، خليط من Ltn10 و Ltn40 و Ltn40 على التوالي. يمكن رؤية صدى العمود الفقري Phe39 و Cys48 و Ala49 الناشئ عن كل من Ltn10 و Ltn40 في الطيف الأوسط مما يؤكد التعايش بين المطابقتين عند درجة الحرارة هذه. (أسفل) طيف تبادل مغنطة 15 نيوتن من Ltn عند 37 درجة مئوية / 150 ملي كلوريد الصوديوم ، يظهر قمم متقاطعة (سوداء) تربط Ltn10 (برتقالي) و Ltn40 (سماوي) Trp55 صدى NH الرنين. يوضح وجود هذه القمم المتقاطعة أن Ltn10 و Ltn40 يحولان بينيًا على مقياس الوقت بالمللي ثانية. لوحة (د) بإذن من توينسترا وآخرون. [16].

يرافق تبديل الطي لـ Ltn إعادة ترتيب توافقية دراماتيكية من الطية الكيميائية α + (Ltn10) [26] ، حيث يوجد Ltn كمونومر ، إلى الرواية ثنائية الأبعاد الشاملة (Ltn40) (الشكل 2)أ,ب) [16،27]. يتكون هيكل Ltn10 من ثلاثة خيوط ، Ile24 – Thr30 ، Ala36 – Thr41 و Lys46 Asp50 ، بالإضافة إلى C-terminal α-helix من Thr54 – Lys66 و 310 الحلزون (Val21 – Arg23) ، في حين أن أول 23 بقايا طرفي N والذيل الطرفي C (Ser67 - Gly93) مضطربان. أثناء التحول إلى Ltn40 ، تتكشف α-helix ، بينما تتشكل-strand جديدة عند الطرف N بين المخلفات 11-14 ، مما يؤدي إلى طية مفتاح يوناني 4 تقطعت بهم السبل (الشكل 2أ,ب). تقريبًا كل روابط الهيدروجين بين الخيوط بين 2 3 و 3 β4 تعيد تنظيمها لتلائم β1 الجديد ، مما يتسبب في حدوث تحول في تسجيل الخيوط β2 3 و 3 β4 [16]. يتم تثبيت واجهة dimer لـ Ltn40 بثلاث طبقات مهيبة من المخلفات الكارهة للماء (Val12 ، Ile38 ، Val47) ، (Leu14 ، Ile40 ، Leu45) و (Ile29 ، Ala36 ، Ala49) مرتبة بشكل متعامد على مستوى المونومر ، معظمها مذيب- مكشوفة في Ltn10 (الشكل 2ج). على النقيض من ذلك ، فإن النواة الكارهة للماء لـ Ltn10 تشتمل على بقايا Tyr27 و Phe39 و Val59 و Val60 التي ينتهي بها الأمر إلى التعرض للمذيبات في Ltn40. يعطي هذا الانعكاس في درجة التعرض للمذيبات لبقايا Ltn انطباعًا بأن البروتين قد تم قلبه من الداخل إلى الخارج أثناء تبديل الطيات.

يتم ملء طية الكيموكين عند 10 درجات مئوية و 200 ملي مولار كلوريد الصوديوم ، بينما يفضل الهيكل الشامل عند 40 درجة مئوية في غياب الملح (الشكل 2د). من المثير للاهتمام ، في ظل الظروف الفسيولوجية (37 درجة مئوية و 150 ملي مولار كلوريد الصوديوم) ، أن Ltn10 و Ltn40 مأهولان بالسكان بشكل متساوٍ ، ويتحولان سريعًا وعكسًا بين بعضهما البعض بمعدل ثابت يقارب 1 ثانية -1. يُعتقد أن الزيادة في القوة الأيونية تفضل تحويل Ltn40 إلى Ltn10 عن طريق تمزيق جسر ملح رئيسي بين Lys25 و Glu31 الذي يعمل على استقرار الحالة ثنائية الأبعاد. يظهر التبادل بين Ltn10 و Ltn40 في تجارب نقل المغنطة 15 N (الشكل 2د، bottom) [16] ويؤكد أن الشكلين ليسا نتيجة لعدم التجانس الثابت في العينة.

يُعد Ltn مرشحًا غير محتمل إلى حد كبير لبروتين متحول لأنه يحتوي على رابطة ثنائي كبريتيد داخل الجزيئية بين Cys11 و Cys48 التي تقيد الحرية المطابقة. في الواقع ، يؤدي ارتباط ثنائي الكبريتيد هذا إلى إنشاء بولي ببتيد دائري يمتد إلى بقايا 11-47 ، على خلفية يحدث تبديل الطي. لا تزال الآلية التي يحدث بها تبديل الطية Ltn مجالًا للبحث النشط. تشير إعادة التشكيل الواسعة للروابط الهيدروجينية والتفاعلات الكارهة للماء التي تحدث أثناء تبديل الطيات إلى أن "الحالة غير المطوية" المرتبطة بثاني كبريتيد يجب أن تكون وسيطة بين الحالتين. تكشف القياسات الحركية المكتشفة عن طريق التألق المتوقف عن الاعتماد على درجة الحرارة للتكشف والتحويل عن قيم متشابهة جدًا للإنثالبي والإنتروبيا في التنشيط للعملية ، مما يؤكد فكرة أن التحويل البيني يجب أن يستمر من خلال "حالة غير مكشوفة" [28]. قام المؤلفون أيضًا بقياس ثوابت معدل الانكشاف بين 0.5 و 5 ثوانٍ -1 لـ Ltn 40 و Ltn10. ومع ذلك ، لماذا تتكشف ثوابت المعدل بهذه السرعة عندما كش تكون قيم البروتينات الأخرى ذات الحجم المماثل عمومًا أصغر بمرتين أو درجتين من حيث الحجم [29] ، أو حتى الشكل البنيوي "للحالة غير المطوية" المرتبطة بثاني كبريتيد على المسار ، لا يزال غير واضح. على عكس التجارب ، اقترحت نماذج Go الأصلية [30] بالإضافة إلى محاكاة تبادل النسخ المتماثلة [31] أن التفتح قد لا يكون ضروريًا للتبديل الطي ، وأن التحويل البيني بين Ltn10 و Ltn40 يمكن أن يحدث عبر وسيطة مكشوفة جزئيًا والتي تختلف في أنماط الرابطة الهيدروجينية للورقة β.

تتمتع حالات Ltn10 و Ltn40 من lymphotactin بوظائف بيولوجية مميزة ضمن دورها ككيماوكين ، مما يجعل Ltn بروتينًا متحولًا حقًا [16 ، 32]. الكيموكينات هي جزيئات إشارات مُفرزة تنظم هجرة الكريات البيض كجزء من الاستجابة المناعية للالتهاب. في تحقيق هذا الهدف ، لا ترتبط الكيماويات فقط بمستقبلات البروتين المقترنة G (GPCRs) على سطح الكريات البيض وتحفز الهجرة ، ولكن أيضًا بالجليكوزامينوجليكان (GAGs) من أجل إنشاء تدرج تركيز لحدوث الانجذاب الكيميائي [24]. ومع ذلك ، فإن الارتباطات الهيكلية والوظيفة صعبة الإنشاء في Ltn بسبب التعايش والتحول القابل للانعكاس بين الهيكلين. باستخدام أساليب هندسة البروتين الأنيقة ، أنشأ فولكمان وزملاؤه طفرات مع رابطة ثاني كبريتيد إضافية مقفلة إما في Ltn10 (V21C / V59C، CC3-Ltn) [33] أو تشابه Ltn40 (A36C / A49C، CC5-Ltn) [32 ]. في حين أن CC3-Ltn غير قادر على ربط GAGs بإحكام ، فهو ناهض فعال لـ XCR1 من ناحية أخرى ، يربط CC5-Ltn بين GAGs ذات التقارب العالي.

عند وضعها في سياق أفراد عائلتها ، تبدو الخصائص الهيكلية والوظيفية لـ Ltn محيرة. تتناقص الكيميائيات بشكل روتيني مع الاحتفاظ بطياتها الكيميائية [25] ، لكن Ltn تتحول إلى بنية جديدة شاملة عند تكوين جهاز homodimer. علاوة على ذلك ، ترتبط الكيموكينات بكل من GAGs و GPCRs باستخدام نفس الطية الكيميائية ، ولكن يبدو أن شكل Ltn10 من lymphotactin وحده قد فقد القدرة على ربط GAGs ، ولم يعد شكل Ltn40 ناهضًا وظيفيًا لـ XCR1. لا يزال سبب تطور الليمفوتكتين مثل هذا السلوك المتحول لفصل وظائف تنشيط GAG و GPCR إلى اثنين من المطابقات المتشابكة غير واضح. ومع ذلك ، ظهرت بعض القرائن من الدراسات التي أجريت على دور الكيماويات كدفاع ضد الفيروسات ، والتي تظهر أن الليمفوتكتين يقع في قلب ساحة معركة شرسة وسريعة التطور بين الفيروسات ومضيفيها. على سبيل المثال ، طور جينوم الفيروس المضخم للخلايا للجرذان القدرة على ترميز كيموكين شبيه بـ Ltn والذي يكون أيضًا قادرًا على تحفيز الانجذاب الكيميائي للخلايا البيضاء في الفئران [34،35]. بالإضافة إلى ذلك ، Ltn هو مثبط واسع الطيف لفيروس HIV-1 ويمنع دخول الفيروس إلى الخلايا من خلال آلية تتطلب الرواية الشاملة [36 ، 37]. تعد المجموعة المشحونة إيجابياً في المجموعة الكاملة التي تشتمل على بقايا Lys42 و Arg43 و Arg18 و Arg35 و Lys46 ضرورية لربط بروتين سكري مغلف HIV-1 gp120 ، مما يزيد من الاحتمال المثير للاهتمام بأن السمات المتحولة في Ltn قد تكون قد تطورت كدفاعات في الذراعين سباق ضد العدوى الفيروسية.

2.2. كايب

إن بروتين KaiB ذو البكتيريا الزرقاء هو البروتين المتحول الوحيد الذي تم تحديده حتى الآن في إيقاعات الساعة البيولوجية. يتكون مذبذب الساعة البيولوجية في البكتيريا الزرقاء من ثلاثة بروتينات ، KaiA و KaiB و KaiC ، والتي تولد إيقاعات 24 ساعة في فسفرة KaiC من خلال تفاعلاتها التي تعتمد على الوقت مع بعضها البعض (الشكل 3)أ) [38-40]. KaiC هو شكل سداسي ذو حلقة مزدوجة ، يتكون من مجالين متماثلين AAA + ATPase ، CI و CII [41]. في بداية اليوم ، لم يتم تعديل Thr432 و Ser431 من مجال CII الخاص بـ KaiC. في حوالي الظهيرة ، يتم فسفرة Thr432 (S / pT) في هذه الحالة ، ترتبط KaiA بـ KaiC من خلال حلقات A الموجودة في الطرف C من KaiC لتحفيز الفسفرة الذاتية [42]. بمجرد فسفرة Ser431 (pS / pT) ، تتكدس حلقات CI و CII على بعضها البعض لفضح موقع ربط لـ KaiB (يسمى حلقة B) على مجال KaiC CI [43-45]. ثم يرتبط KaiB ليس فقط بـ KaiC ولكن أيضًا بـ KaiA لتشكيل مجمع ثلاثي (الشكل 3أ) ، وعزل KaiA من KaiC وبدء ذراع نزع الفسفرة للتذبذب اليومي [46-48].

الشكل 3. (أ) الدورة اليومية الزرقاء البكتيرية. KaiC (اللون الرمادي) هو بروتين ثنائي النطاق (CI و CII) ينظم في شكل سداسي. تساعد الفسفرة في مجال CII لـ KaiC (كما هو موضح في الماء) في Thr432 و Ser431 في تحديد فترة 24 ساعة من الدورة. عند الظهيرة ، ترتبط KaiA (باللون البرتقالي) بحلقات A وتحفز عملية الفسفرة الذاتية KaiC. KaiB ، الذي يوجد كتوازن بين رباعي التتراميريك (أخضر) ، ثنائي الأبعاد (أخضر) والتشكيلات أحادية التبديل ذات الطية (الأرجواني) ، ترتبط بحلقات B من مجال CI لـ KaiC من خلال طية KaiBfs التي تشبه thioredoxin ، مما يؤدي إلى نزع الفسفرة بنفس الترتيب عند الغسق. بعد إزالة الفسفرة على حد سواء Thr432 و Ser431 بالتتابع ، تتكرر الدورة. (ب) في الحالة الأرضية ، KaiB المجاني عبارة عن رباعي الأبعاد من ثنائيات غير متماثلة (ملونة باللونين الأصفر والأزرق ، معرف PDB: 2QKE). (ج) يتم تثبيت الواجهة البينية غير المتماثلة بشكل أساسي عن طريق المخلفات الكارهة للماء مثل Ala15 و Val47 و Ile59 و Ile88 (تظهر على شكل كرات وملونة باللونين الأخضر والوردي). (د) ينتج عن التبديل المطوي لـ KaiB تحويل KaiBgs (المونومر الظاهر على اليسار ، قوس قزح الملون) إلى KaiBfs (معرف PDB: 5JYT ، يمين ، ملون مثل KaiBgs) ، والذي يتبنى طية ثيوردوكسين. بينما لا يزال المقطع N-terminal في KaiB يحتفظ بالهيكل الثانوي βαβ في كلا الطيتين ، فإن المنطقة الطرفية C تعيد ترتيبها من βααβ في KaiBgs إلى αββα في KaiBfs. (ه) التركيب البلوري لمركب KaiC الوظيفي (مجال CI) - مجمع KaiBfs (معرف PDB: 5JWO). يتم تلوين مجال CI الخاص بـ KaiC باللون الرمادي ، بينما تظهر المنطقة الثابتة لـ KaiB باللون الوردي ومنطقة تبديل الطيات باللون السماوي. يتكون السطح البيني KaiC – KaiB بشكل أساسي من المنطقة الطرفية C في KaiB التي تخضع للتبديل المطوي. (F) الدورة الزمنية لربط KaiB المسمى الفلورسنت ومتغيراته بـ KaiC ، متبوعًا بتباين التألق. Thermosynechococcus elongatus (تي) تم استخدام البروتينات في هذه الدراسة. S431E عبارة عن طفرة فوسفورية في KaiC تسهل الارتباط بـ KaiB. يعتبر ربط وزن KaiBgs أحادي الطور ويحدث على مدار 24 ساعة. نظرًا لزيادة جزء KaiBfs عند التوازن من خلال الطفرات ، يصبح الارتباط ثنائي الطور. تتوافق المرحلة السريعة مع الارتباط السريع لـ KaiBfs الموجودة مسبقًا بـ KaiC ، بينما تتوافق المرحلة البطيئة مع إعادة ترتيب KaiBgs إلى KaiBfs ، متبوعًا بالربط. تشير هذه التجارب إلى أن تبديل طي KaiB يحدد معدل الارتباط بـ KaiC. لوحة (F) بإذن من Chang وآخرون. [18].

في الشكل الحر (يشار إليه بالحالة الأرضية ، gs) ، يوجد KaiBgs على شكل رباعي رباعي مكون من اثنين من ثنائيات غير متماثلة (الشكل 3ب، ثنائيات الثنائيات) [49]. يتبنى كل من المونومرات في الرباعي طية جديدة تتكون من أربعة خيوط وثلاثة حلزونات α مرتبة بالترتيب βαββααβ. يعمل 1 و 2 بالتوازي مع بعضهما البعض ، بينما β4 مرتبط بالهيدروجين ومضاد متوازي لـ β1. β3 عبارة عن خيط قصير يشكل جزءًا من واجهة dimer جنبًا إلى جنب مع الحلقة التي تربط β2 و 3 ، والمقطع N-terminal من β4 والجزء C الطرفي لـ β1. الواجهة هي في الغالب كارهة للماء بطبيعتها وتشتمل على مخلفات مثل Ala15 و Val47 و Ile59 و Ile88 (الشكل 3ج) حذف المخلفات 95-108 وتحوير Tyr8 إلى Ala و Tyr94 في وقت واحد إلى Ala في رباعي KaiB يولد ثنائيًا حيث يكون للمونومرات نفس KaiBgs أضعاف. في نظيرتها المتحولة ، يوجد KaiB كمونومر منظم في ثنية ثيوردوكسين بترتيب هيكلي ثانوي βαβαββα (الشكل 3د) [18]. لا تتغير β1 و α1 و 2 في النصف N-terminal من KaiB بشكل كبير في التشكل من الحالة الأرضية (الانحراف الزوجي للجذر المتوسط ​​التربيعي (RMSD) لـ Cα بين بنيتي 1.3 Å) ، بينما الطرف C النصف يخضع لعملية إعادة تصميم كبيرة أثناء حدث تبديل الطية. ومن المثير للاهتمام ، أن معظم البقايا البينية للديمر غير المتماثل تقع في المنطقة الطرفية C في KaiB ، والتي تخضع لأكبر التغييرات التوافقية عند تبديل الطية ، مما يشير إلى أن رباعي KaiBgs غير المتماثل يجب أن ينهار قبل أن يحدث تبديل الطي.

التركيب البلوري لـ KaiC (مجال CI) في مجمع مع KaiB (الشكل 3ه) [50] يكشف أن الواجهة بين KaiBfs و KaiC تتكون من العديد من المخلفات الرئيسية مثل Ala15 و Val47 و Ile59 و Leu60 التي يتم عزلها في الواجهة البينية غير المتماثلة في KaiBgs. تصبح هذه البقايا مكشوفة في KaiBfs التي تشبه thioredoxin ، وبالتالي فهي متاحة لربط KaiC ، مما يعطي الانطباع بأن البروتين قد تحول من الداخل إلى الخارج. يعد نظام KaiB المتحولة مثالًا قاطعًا آخر على كيفية تعديل إمكانية الوصول إلى المذيبات للمخلفات الوظيفية من خلال الاستفادة من الإحباط المشفر في المناظر الطبيعية الخالية من الطاقة المطابقة من أجل تغيير الوظيفة في مطابقة مختلفة من نفس البروتين.

لا يُعرف سوى القليل جدًا عن آلية التحويل البيني بين KaiBfs و KaiBgs. تحدث إعادة الترتيب التوافقي بين الدولتين ببطء شديد ويساهم وقت الانتظار الممتد المطلوب لـ KaiBgs للتحول إلى KaiBfs في التأخير الزمني اللازم للحفاظ على فترة 24 ساعة يوميًا [18]. تم تقدير حركية تبديل الطيات بشكل غير مباشر فقط عن طريق التحقق من ارتباط KaiB ومتغيراته بـ KaiC. من المعروف أن KaiBfs هو الوحيد الذي يربط KaiC. النوع البري المسمى الفلورسنت KaiB موجود أساسًا باسم KaiBgs (K.مكافئ(gs – fs) = 0.08) وارتباطه بـ KaiC يمكن وصفه بمرحلة حركية واحدة مع ثابت زمني يبلغ حوالي 12 ساعة [18]. في المقابل ، يوجد G89A / D91R KaiB في الغالب في KaiBfs (K.مكافئ(gs – fs) = 6.7) ويظهر طور انفجار بالإضافة إلى طور بطيء عند ربط KaiC. يتم تفسير المرحلة السريعة على أنها ارتباط KaiC بجزيئات KaiBfs المختصة بالربط الموجودة عند التوازن ، بينما تتوافق المرحلة البطيئة مع التحويل البيني لـ KaiBgs الموجودة مسبقًا إلى KaiBfs وربطها اللاحق بـ KaiB. نظرًا لأن مرحلة الرشقة أسرع بكثير من الطور البطيء ، فإن تقريب خطوة تحديد المعدل لتكون تبديل KaiBgs-KaiBfs يوفر تقديرًا لثابت معدل التحويل البيني بترتيب 12 ساعة. ثلاثة روابط Xaa-Pro محفوظة ، Thr62 – Pro63 ، Leu69 – Pro70 و Pro71 – Pro72 تتحول من التشكل المتحولي في KaiBgs إلى رابطة الدول المستقلة في KaiBfs ، وقد يكون هذا التشابه الملزم أحد الأسباب التي تجعل التبديل المطوي بطيئًا جدًا في KaiB.

2.3 IscU

الإشريكية القولونية يقدم IscU تباينًا آخر لموضوع البروتينات المتحولة ، حيث يتم تنظيم أحد المطابقين والآخر غير منظم جزئيًا ، لكن كلاهما يؤدي وظائف متميزة. IscU هو عضو في مسار التكوين الحيوي لعنقود الكبريت والحديد المعتمد على ATP والذي يعمل في البكتيريا وفي الميتوكوندريا [17]. IscU هو بروتين سقالة يتم تجميع مجموعات Fe-S عليه قبل النقل من خلال نظام Hsp70 / Hsp40 متخصص إلى البروتينات المستقبلة.

يمكن رؤية وجود اثنين من المطابقات IscU في التوازن الحراري بوضوح من طيف الارتباط الكمي الأحادي النوى 1 H-15 N (HSQC) من IscU (الشكل 4أ، يسار) ، والذي يعرض مجموعتين من الرنين في التبادل البطيء على مقياس زمن التحول الكيميائي للرنين المغناطيسي النووي للعديد من المخلفات ، بما في ذلك السلسلة الجانبية NH من Trp الوحيد في IscU [51]. تُظهر تجارب تبادل المغنطة 15 N بشكل لا لبس فيه أن الشكلين يتحولان بشكل عكسي مع ثوابت المعدل كSD = 0.8 ث -1 و كDS = 2.0 ثانية -1 عند 25 درجة مئوية (الشكل 4أ، أسفل) [52]. ثباتات الأشكال المنظمة والمضطربة متساوية تقريبًا عند 37 درجة مئوية (صس = 0.4, صد = 0.6 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، الرقم الهيدروجيني 8) ، بينما IscU-S مستقر إلى أقصى حد عند 25 درجة مئوية [53]. يتكون الشكل المهيكل لـ IscU (IscU-S) من ورقة ثلاثية الجديلة عند الطرف N وحزمة ذات أربعة لولب في اتجاه مجرى النهر ترسو على الورقة β (الشكل 4ب) [54]. ثلاثة من الحلزونات الأربعة قصيرة (دورتان) ، بينما اللولب الطرفي C طويل بسبع لفات. يتكون اللب المقاوم للماء من البروتين بشكل أساسي من مخلفات Ile و Leu و Val مع عدد قليل من Ala المتداخل. ومن المثير للاهتمام أن الأحماض الأمينية العطرية الستة في IscU معرضة بشكل كبير للمذيبات ولا يشارك أي منها في اللب (الشكل 4ب، يسار) من IscU-S. في حين أن طيف الرنين المغناطيسي النووي في IscU-S مشتت جيدًا ، فإن جزءًا كبيرًا من القمم التي تنتمي إلى IscU-D يتردد صداها عند التحول الكيميائي للملف العشوائي ، مما يشير إلى أن IscU-D به مناطق مضطربة ومرتبة (الشكل 4أ، اليسار). هذه الملاحظة مدعومة بقيم تعزيز الزفير النووي غير المتجانس (NOE) 1 H-15 N ، والتي تعتبر سلبية بالنسبة للمخلفات الواقعة في منطقة الملف العشوائي والإيجابية بخلاف ذلك [53].

الشكل 4. (أ) (أعلى) 1 H - 15 N أطياف HSQC لـ IscU (يسار) تُظهر قممًا مكررة لسلسلة Trp76 الجانبية الوحيدة (الصندوق المنقط) التي تشير إلى التعايش بين شكلين في العينة. تُظهر تراكبات الأطياف (الوسط) لـ IscU في وجود 3 مم Zn 2+ (أحمر) أو D39A IscU (أخضر) مع apo بالوزن IscU (أسود) أن الرنين الجانبي الصغير لـ Trp يختفي في كلتا الحالتين. يشير هذا إلى أن طفرة Zn 2+ و D39A تثبتان نفس التشكل (IscU-S). (أسفل) 15 نيوتن من طيف التبادل المغنطيسي لـ apo wt IscU الذي يُظهر القمم المتقاطعة (باللون الأحمر) بين الرنين الجانبي المائل الناشئ من Trp76 في المطابقتين المتشاركتين لـ IscU. يوضح ظهور هذه القمم المتقاطعة أن IscU-S و IscU-D يتحولان بشكل عكسي على مقياس الوقت بالمللي ثانية. (ب) تمثيل كارتون لهيكل NMR لـ IscU-S (معرف PDB: 2L4X). تظهر بقايا Pro الأربعة في IscU-S على شكل أعواد حمراء ، في حين أن البقايا العطرية ملونة باللون الأرجواني. من الغريب أن معظم المخلفات العطرية معرضة للمذيبات ولا تساهم في نواة مسعور IscU-S. إن IscU-S المنظم في حالة توازن على مقياس الوقت ms-s مع شكل غير منظم جزئيًا ، IscU-D. اثنان من روابط Xaa-Pro في IscU-D و Asn13 – Pro14 و Pro100 – Pro101 متطابقان مع رابطة الدول المستقلة ، في حين أن جميع روابط Xaa-Pro الأربعة في IscU-S هي في صيغة التحويل. (ج) دور بروتين السقالة IscU في دورة التكوّن الحيوي لعنقود Fe-S الوظيفية. (1) يوجد IscU في شكلين ، IscU-S و IscU-D. (2) يحفز إنزيم IscS المعتمد على الفوسفات البيريدوكسال (PLP) تحويل Cys إلى Ala ويولد بدوره الكبريتيدات على IscU-D عن طريق الارتباط التفضيلي به. بمجرد إدخال Fe في هذا المركب (3) ، يحدث تبديل الطي ويتم تثبيت حالة IscU بواسطة مجموعة Fe-S. يتعرف المساعد المساعد في المجال J ، HscB ، على IscU-S ويسهل تجميع ونقل مجموعة Fe-S إلى بروتين متقبل المصب (5-9). خلال هذه العملية ، يتم نقل IscU إلى Hsp70 مثل HscA ، والذي يعمل على استقرار شكل IscU-D المضطرب جزئيًا من IscU. عند التحرير من HscA ، تتم معايرة IscU المجانية مرة أخرى في أشكال مرتبة ومفتوحة جزئيًا لإعادة ضبط الدورة. لوحات (أ) و (ج) بإذن من ماركلي وآخرون. [17].

بصرف النظر عن انتقال اضطراب الترتيب الجزئي ، فإن التغيير الهيكلي الأبرز الذي يحدث أثناء التبديل الطي لـ IscU هو التغيير في الكيمياء المجسمة لروابط Xaa-Pro لمتبقي Pro14 و Pro101 المحفوظين من trans (IscU-S) إلى رابطة الدول المستقلة (IscU-D) (الشكل 4ب) [53]. بالنظر إلى أن Pro14 يقع في الطرف N المضطرب لـ IscU-S ، فإننا لا نفهم بعد طبيعة التفاعلات التي تثبته في شكل رابطة الدول المستقلة في IscU-D.من الممكن أن تقوم رابطة رابطة الدول المستقلة Asn13 – Pro14 بتقريب الطرف N أقرب إلى بقية البروتين ودفن مساحة السطح الكارهة للماء لتثبيت شكل رابطة الدول المستقلة Pro14. على عكس KaiB ، حيث من المحتمل أن تؤدي أزمرة Pro cis – trans لثلاثة روابط Xaa-Pro إلى إبطاء التبديل الطي إلى النطاق الزمني للساعات ، تحدث أزمرة اثنين من هذه الروابط في IscU في غضون ثانية. بالنظر إلى أن ثابت المعدل لأزمرة Pro cis – trans وحيد يحدث عادة 1-2 أوامر من حيث الحجم أبطأ في نموذج الببتيدات [55] مما هو عليه في IscU ، فإن سبب هذه التسريع في IscU لا يزال غير واضح.

للحالتين المتحولة من IscU وظائف مميزة تمامًا كما هو الحال في حالة اللمفوتكتين (الشكل 4ج). يرتبط IscU-D بشكل انتقائي بـ cysteine ​​desulfurase [52] ، IscS ، وهو إنزيم يعتمد على البيريدوكسال الفوسفات الذي يولد وينقل الكبريت إلى مخلفات Cys في IscU لتشكيل البير كبريتيد. يؤدي التكوين اللاحق لمجموعة Fe-S إلى تبديل الطية عن طريق تثبيت الشكل المرتب لـ IscU ، والذي يهاجر من IscS إلى HscB (يشبه DnaJ Hsp40) في نفس التشكل. يبقى IscU في الحالة المهيكلة حتى يتم ترحيل مجموعة Fe-S إلى البروتين المستقبلي ويتم نقل IscU-S مرة أخرى إلى HscA / ATP عبر HscB. تعتبر السقالة الهيكلية ضرورية لتحقيق الاستقرار في مجموعة Fe-S الناشئة قبل نقلها إلى البروتين [17]. من ناحية أخرى ، نظرًا لأن HscA (مثل DnaK-like Hsp70) يربط الأنواع المضطربة والمرتبة جزئيًا ، فإن التبديل IscU من IscU-S إلى IscU-D ويتم إطلاقه مرة أخرى في مسار التكوين الحيوي Fe-S في التشكل المضطرب. وهكذا ، في حين أن IscU-S يربط IscS و HscB بحكم هيكله ، يتفاعل IscU مع HscA في نموذج IscU-D المرتب جزئيًا بسبب القيود التي يفرضها جيب الربط لـ HscA ، مما يوفر سياقًا وظيفيًا للسلوك المتحولي.

2.4 جنون 2

يلعب تحول Mad2 دورًا أساسيًا في إنشاء تفاعلات البروتين والبروتين التي تشكل جزءًا من آلية مراقبة دورة الخلية تسمى مجمع نقطة تفتيش المغزل [56،57]. أثناء انقسام الخلية الانقسامية ، تحدث محاذاة الكروموسومات في لوحة الطور الطوري عن طريق ربط kinetochore في كل كروماتيد أخت بالأنابيب الدقيقة التي تنشأ من أقطاب المغزل المتعارضة. يمكن أن يؤدي التعلق غير الكامل للكروماتيدات الشقيقة بالمغازل الانقسامية أثناء الطور الاستوائي إلى اختلال الصيغة الصبغية في الخلايا الوليدة ، ويتم منع ذلك عن طريق نقطة تفتيش تجميع المغزل (SAC). يتم التوسط في الانتقال من الطور الطور إلى الطور بواسطة APC / C المعزز الطور ، وهو عبارة عن ubiquitin ligase الذي يعمل على بوليوبيكويتين وسيكورين وسيكلين ب. في المقابل ، تعمل التكوينات الحركية غير المرتبطة في لوحة الطور الطوري على تنشيط SAC ، مما يثبط APC / C ويؤخر بداية الطور.

يمكن القول إن أول بروتين متحول يتم اكتشافه ، وهو 25 كيلو دالتون Mad2 ، هو مكون مركزي لـ SAC يتحول إلى مجال HORMA (سمي على اسم هوp1p ، صev7 و أماهبروتينات d2) [58]. يحتوي الهيكل الأساسي لـ Mad2 على ثلاث حلزونات α ودبوس شعر β بين الحلزونات A و B ، بالإضافة إلى صفائح β متوازية ثلاثية الشرائط (الشكل 5)أ). يتم الحفاظ على هذا اللب أثناء الانتقال المتحولة بين C-Mad2 [59] و O-Mad2 [60] ، حيث يتحرك دبوس الشعر الثاني من جانب واحد من الورقة إلى الجانب الآخر. دبوس الشعر C-terminal ، الذي يتكون من خيوط 7 و 8 ، روابط هيدروجينية مع حبلا 6 في O-Mad2 (الشكل 5أ، يسار) ، في حين أن الطرف N للبروتين يشكل خيطًا قصيرًا يتماشى مع الخيط 5. عند التحويل البيني التوافقي ، فإن دبوس الشعر الطرفي C (المسمى بالخيوط 8 ′ و 8) يزيح الطرف N β- حبلا إلى رابطة الهيدروجين مع حبلا 5 ، في حين أن الطرف N- حبلا يعيد ترتيبها إلى دورتين إضافيتين من الحلزون A (الشكل 5أ، حق). وبالتالي ، هناك تغيير جذري في شبكة الروابط الهيدروجينية في محيط البروتين ، على غرار ما لوحظ في Ltn.

الشكل 5. (أ) طرق عرض متعامدة (أعلى وأسفل) لتمثيل الرسوم المتحركة لـ O-Mad2 (يسار ، معرف PDB: 1DUJ) ، I-Mad2 (وسط ، معرف PDB: 3GMH) و C-Mad2 (يمين ، معرف PDB: 1S2H). تظهر المناطق الطرفية N و C التي تمر بتبديل الطي باللونين الأزرق والأخضر ، على التوالي ، بينما يُشار إلى القلب الذي يظل دون تغيير باللون الأصفر الباهت. يتم الإشارة إلى الخيوط واللوالب بالأرقام والأحرف الكبيرة ، على التوالي. يُظهر المنظر السفلي أن اتجاه اللولب لـ I-Mad2 يشبه اتجاه C-Mad2 ، على الرغم من أن الطية الإجمالية مشابهة لتلك الموجودة في O-Mad2. (ب) الدورة الوظيفية لـ Mad2 داخل مجمع نقطة تفتيش المغزل. يوجد Mad2 الحر الذي تم تصنيعه بشكل أساسي كـ O-Mad2 ، بينما يوجد C-Mad2 في الخلايا كمجمع ضيق مع Mad1. يتم تجنيد مجمع Mad1 – C-Mad2 إلى kinetochores غير المصاحبة ويشكل C-Mad2 نموذجًا متماثلًا غير متماثل مع O-Mad2. هذا التفاعل C-Mad2 – O-Mad2 يحول O-Mad2 إلى I-Mad2 ثم ينشطه للتعرف على شريك الربط المشابه ، Cdc20. يمنع عزل Cdc20 APC / C ubiquitin ligase ويمنع الفصل المبكر للكروماتيدات الشقيقة.

في حين أن الكثير من الأساس الهيكلي الكامن وراء الطي والتحويل البيني في تحول Mad2 لا يزال بحاجة إلى توضيح ، فقد بدأت تظهر لمحات من التعقيد في عملية الطي. على غرار KaiB ، تحدث إعادة ترتيب O-Mad2-C-Mad2 ببطء شديد ، على مقياس زمني لعدة ساعات ، مع رد الفعل الأمامي يستغرق 9 ساعات ، ورد الفعل الخلفي 6 مرات أطول [59]! يعتبر C-Mad2 أكثر استقرارًا بمقدار 10 أضعاف تقريبًا من O-Mad2 [59] ، على الرغم من أن العدد الدقيق يختلف اعتمادًا على المصدر ويصعب تحديده جزئيًا بسبب عدم إمكانية الرجوع في تجارب التمسخ الحراري ، وجزئيًا بسبب الأوقات الطويلة ضروري لذراع O-Mad2-C-Mad2 للوصول إلى التوازن [61]. في تناقض حاد مع حركيات التحويل البيني البطيئة ، أظهرت قياسات التدفق المتوقف المكتشفة عن طريق التألق أن طي وفتح O-Mad2 و C-Mad2 يحدثان في نطاق زمني من الثواني (كF(C-Mad2) = 11 ث -1 ، كF(O-Mad2) = 6 ث -1 ، كش(C-Mad2) = 0.046 ث -1 ، كش(O-Mad2) = 0.086 ث -1) [61]. تدعم هذه التجارب الفكرة القائلة بأن التحويل البيني بين O- و C-Mad2 يحدث من خلال الانكشاف المحلي أو العالمي لتشكل طاقة عالية ، متبوعًا بالتقسيم الحركي وإعادة الطي إلى شكلي O- أو C-Mad2 [62].

يجسد Mad2 التطور الذي يمكن ملاحظته في حركية طي البروتين والديناميكا الحرارية والمسارات ، وكيف يمكن للخلايا استخدام هذه التعقيدات. على سبيل المثال ، أحد أكثر الأسئلة إثارة حول البروتينات المتحولة هو الفرز بين تركيبات البروتين البديلة التي تصاحب طي بروتين دي نوفو. تقريبًا كل خلايا Mad2 المجانية الموجودة داخل الخلايا الموجودة داخل الخلايا O-Mad2 غير النشطة المحاصرة حركيًا والتي تم إنشاؤها نتيجة لطي بروتين de novo وغير قادر على التحويل إلى C-Mad2 بسبب التحويل البيني البطيء بين الشكلين [19،59]. لذلك ، يبدو أن نظام C-Mad2 / O-Mad2 داخل الخلايا موجود في حالة عدم توازن (الشكل 5ب). على النقيض من ذلك ، تم العثور على C-Mad2 الخلوي مرتبطًا بإحكام بـ Mad1 في kinetochores عند تنشيط نقطة التفتيش واستعادة التألق بعد التبييض الضوئي (FRAP) أظهرت بيانات أن هناك القليل من دوران هذا المركب أو معدومه [63-66]. بالنظر إلى أن الهدف المصب لـ Mad2 ، Cdc20 ، يرتبط في نفس الموقع مثل المنشط المنبع ، Mad1 [67،68] ، فإن النماذج التي تصف التعرف على Cdc20 بواسطة Mad2 تواجه لغزًا: من ناحية ، فإن Cdc20 - مختص بالربط يشبه التشكل C-Mad2 ، ويتم عزل جميع جزيئات C-Mad2 بواسطة Mad1 من ناحية أخرى ، يتم احتجاز كل Mad2 الحر في تشكل O-Mad2 غير النشط الذي لا يتحول إلى C-Mad2 في النطاق الزمني لتنشيط نقطة التفتيش. أظهر العمل الأنيق من العديد من المعامل أن هذا اللغز يتم حله من خلال قدرة مجمع Mad1-C-Mad2 على تحفيز تحويل O-Mad2 الكامن إلى C-Mad2 وبالتالي تنشيط Mad2 لربط Cdc20 [60،66،68– 73]. في الآونة الأخيرة ، تم حل السمات الهيكلية لمركب C-Mad2-I-Mad2 الوسيط باستخدام مزيج من علم البلورات بالأشعة السينية والتحليل الطيفي للرنين المغناطيسي النووي [74] الذي يكشف كيف يحتفظ I-Mad2 بطية O-Mad2 ولكن له قلب و اتجاه حزمة اللولب الذي يشبه C-Mad2 (الشكل 5أ، وسط) ، مما يزيد من الاحتمال المثير للاهتمام أن I-Mad2 قد يكون وسيطًا على المسار يربط بين O- و C-Mad2.

تقدم التعديلات اللاحقة للترجمة داخل البيئة الخلوية طريقة أخرى لتعديل التوازن المطابق في البروتينات المتحولة ، كما رأينا في حالة Mad2. فسفرة Mad2 في Ser195 ، وكذلك طفرة الفوسفومتيك S195D ، تمنع الانتقال التوافقي لـ O-Mad2 إلى C-Mad2 كما لوحظ من أطياف 1D NMR المعتمدة على الوقت لبروتين الوزن ومتغيراته [75]. تتمثل النتيجة الوظيفية لهذا التثبيط في أن S195D Mad2 لا يربط رابطه المشابه Cdc20 ، وينتج عن التعبير عن هذا المتغير داخل الخلايا أوجه قصور في تنظيم نقطة تفتيش المغزل.

2.5 رفاه

ال بكتريا قولونية عامل الفوعة RfaH هو مثال كتابي لكيفية تفاعلات المجالات التي يمكن أن تعدل تكوين البروتين (الشكل 6أ,ب). RfaH هو Paralog لـ NusG وكلا البروتينين لهما نطاقات N-terminal متشابهة هيكليًا (NTDs) ترتبط بـ RNA polymerase (RNAP) وتحولها إلى وضع معالجة مقاوم للإيقاف المؤقت [76،77]. المجال الطرفي C (CTD) لـ NusG هو برميل يظل مستقلاً عن NTD ويتفاعل مع عامل إنهاء النسخ Rho [78-80]. في المقابل ، فإن CTD من RfaH المجاني (RfaHج) تطوي في دبوس شعر حلزوني ألفا (الشكل 6أ) التي ترتبط بـ NTD وتحبس فكرة التعرف على RNAP (الشكل 6ج) [81]. عندما يربط RfaH الحمض النووي ، ينفصل NTD و CTD عن بعضهما البعض ، مما يمكّن NTD من الارتباط بـ RNAP [81،82]. في الوقت نفسه ، يعيد CTD ترتيبًا تلقائيًا من دبوس شعر حلزوني ألفا إلى برميل بيتا خماسي الجديلة (الشكل 6ب) التي تشبه إلى حد كبير CTD لـ NusG [83]. ثم يتفاعل CTD المعاد تشكيله لـ RfaH مع الريبوسوم لتنشيط الترجمة (الشكل 6د) ، وإنشاء جسر يجمع بين النسخ والترجمة. التبديل القابل للطي الذي يحدث عند RfaHج يُظهر الانفصال عن NTD أهمية التفاعلات بين المجالات في تثبيت الطية الحلزونية ألفا لـ CTD [82].

الشكل 6. (أ) تمثيل كارتون لهيكل الأشعة السينية للوزن الكامل RfaH (معرف PDB: 2OUG). يظهر المجال N-terminal (NTD) باللون الرمادي ، في حين أن المجال الطرفي C (CTD) هو قوس قزح ملون. في RfaH كامل الطول المجاني ، يكون CTD حلزونيًا. (ب) تم الحصول على الهيكل الشامل للورق CTD لـ RfaH باستخدام التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (معرف PDB: 2LCL). مخطط الألوان مطابق لـ CTD في (أ). (ج) تظهر المخلفات في NTD (اللون الوردي الباهت) المهمة لربط بوليميراز الحمض النووي الريبي على شكل أعواد على بنية RfaH والأصفر الملون. يتم عزل معظم هذه البقايا بواسطة CTD الحلزوني (سماوي) في شكل حر من RfaH ، ولكنها تصبح مكشوفة عند التبديل الطي وفصل CTD من NTD. (د) تظهر المخلفات في CTD (السماوي) المهمة لربط بروتين الريبوسوم S10 على شكل كرات خضراء في كل من المطابقات الحلزونية (العلوية) والصفيحة لـ CTD. يتم أيضًا دفن معظم هذه البقايا في واجهة NTD-CTD ولكنها تصبح متاحة للربط S10 عندما يتفاعل NTD مع بوليميريز RNA.

يقدم نظام RfaH أيضًا تباينًا آخر لموضوع البروتينات المتحولة لأنه يتضمن بروتينًا متعدد المجالات حيث يعمل أحد المجالات كسقالة لتحول المجال الآخر [83]. على غرار Ltn ، هناك تغيير توافقي عالمي في RfaHج لأنه ينتقل من التشكل α-helical المثبط الذاتي إلى شكل ورقة β النشط وظيفيًا. يحتوي تشكيل ورقة β على خمسة جدائل مرتبة بالترتيب β5 (F158 – K160) 1 (K115 – I118) –2 (Q127 – F130) –3 (R138 – N144) 4 (E149 – K155). رفاهج في حد ذاته موجود في التشكل-sheet. من أجل إثبات أن تبديل الطيات يحدث أيضًا في سياق RfaH كامل الطول ، ابتكر Rösch وزملاؤه متغيرًا E47S ، حيث يتم تعطيل الارتباط الكهروستاتيكي الرئيسي بين Glu47 و Arg138 الذي يربط NTD و CTD [83]. يمكن رؤية القمم الناشئة عن المطابقات α-helical و مع نسبة شدة تقارب 1: 1 في طيف 1 H-15 N HSQC من E47S RfaH ، مما يدل على أن الهياكل الحلزونية والصفائح يمكن أن تتعايش.

بينما تفتقر الدراسات التجريبية التي تبحث في التحويل البيني للأشكال الحلزونية والورقية لـ RfaH ، هناك عدد من الدراسات الحسابية التي تتناول هذا السؤال باستخدام طرق مثل الديناميات الجزيئية المستهدفة [84] ، ونمذجة حالة ماركوف [85] ، وتبادل النسخ المتماثلة [86- 88] والاستيفاء شبه المستمر [89] ، والمحاكاة الحبيبية الخشنة [90] ، والنماذج القائمة على بنية الحوض المزدوج [91] ومحاكاة السحب [92]. هناك اتفاق عام على أن التحويل البيني يتم تشغيله عن طريق اهتراء اللولب N-terminal α-helix. اقترحت بعض الدراسات أن إعادة النمذجة اللاحقة تحدث من خلال مجموعة عالية الطاقة من التطابقات المضطربة [85-87،89] التي تشكل ورقة خماسية الجديلة في الوقت المناسب من خلال سلسلة من الحالات مع واحد أو أكثر من دبابيس الشعر. ومع ذلك ، يتنبأ النموذج المعتمد على البنية الخشنة الحبيبات بوجود وسيطين على المسار يسهلان تبديل الطيات ، أحدهما يشبه الحلزوني والآخر ، مطابقة الصفيحة [91].

3. الأهمية التطورية لأنظمة البروتين المتحولة

تعتبر دراسة البروتينات المتحولة ذات صلة ليس فقط لأن هذه البروتينات تستفيد من المناظر الطبيعية المعقدة للطاقة الحرة التوافقية للوظيفة ، ولكن أيضًا بسبب الرؤى التي يعدون بتقديمها في تطور البروتين. بالنظر إلى هذه العدسة التطورية ، تعتبر البروتينات المتحولة مهمة من ثلاث نواحٍ. أولاً ، تقدم البروتينات المتحولة دليلاً على المستوى الجزيئي للهروب من الصراع التكيفي (EAC) [93] نموذج تطور البروتين [94-96]. الصراع التكيفي هو لغز أساسي في التطور الجزيئي يصف الصعوبة التي يواجهها البروتين في التكيف مع وظيفة جديدة مع الاحتفاظ بوظيفة أسلافه. في نماذج مثل الوظيفة الوظيفية الجديدة ، يحدث التكيف بعد حدث الازدواج الجيني ، حيث تحتفظ نسخة جينية واحدة بوظيفة الأسلاف وتتطور النسخة الثانية لأداء الوظيفة الجديدة [97]. من ناحية أخرى ، يعتبر EAC نموذجًا تسهل فيه البروتينات متعددة الوظائف (أو التي تعمل على ضوء القمر) العمليات التكيفية قبل وبعد تكرار الجينات [98]. مع اكتشاف البروتينات المتحولة ، نعلم الآن أن البروتينات يمكن أن تتبنى طيات متميزة هيكليًا ولكنها قابلة للانعكاس فيما بينها والتي تؤدي مباشرة إلى تعدد الوظائف. وبالتالي ، يمكن لمثل عدم التجانس المطابق هذا تمكين تطور البروتين من خلال توسيع الذخيرة الوظيفية لمجموعة محدودة من متواليات البروتين [99-103].

ثانيًا ، البروتينات المتحولة عبارة عن جسور بين طيات بروتينية متميزة وتمثل حالات وسيطة في مسارات طفرة تربط بين الطبولوجيتين البنيويتين. في هذا السياق ، تم وضعهم بشكل فريد كنظم نموذجية للدراسات الحسابية والتجريبية [105] للآليات الكامنة وراء الديناميكيات التطورية ، ودور ضغط الاختيار وتأثير الطفرات.

أخيرًا ، كيف تطورت البروتينات المتحولة وكيف بدا أسلافها ، في حد ذاته ، سؤال رائع. في دراسة حديثة أنيقة [106] ، تناول فولكمان وزملاؤه بعض هذه الأسئلة باستخدام طرق إعادة بناء الأسلاف النشوء والتطور لتوليد متواليات من أسلاف Ltn وتوصيفها باستخدام التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي. تطور Ltn من سلف لديه طية كيموكين. كان فقدان ارتباط ثاني كبريتيد المحفوظ الموجود في الكيماويات أحد الأحداث المبكرة في تطوره ، على الرغم من أن هذا لم يكن كافيًا لظهور التحول. كان الأسلاف اللاحقون متحولين ، لكن التعداد المتماثل للطيتين كان أحد الأحداث الأخيرة التي حدثت في تطور Ltn. واحدة من الاستنتاجات الأكثر إثارة للدهشة حول هذا التقرير هي أن Ltn لا يبدو أنه انتقال وسيط تطوري من طية الكيموكين إلى رواية dimeric Ltn40 ، ولكن يبدو أنه تطور ليظل متحولة. يشير هذا إلى أن البروتينات المتحولة لا يجب بالضرورة أن تكون مفقودة في تطور البروتين ، ولكن يمكن أن تمثل نقاط النهاية في التطور أيضًا.

4. التنبؤ القائم على التسلسل للبروتينات المتحولة

أثارت التحديات الكامنة في تحديد البروتينات المتحولة بشكل منهجي باستخدام الأساليب التجريبية ، على عكس اكتشافها المصادفة ، سؤالًا مثيرًا للاهتمام حول ما إذا كان يمكن التنبؤ بالتحول بناءً على تسلسل البروتين وحده. على الرغم من صعوبة معالجة هذا السؤال نظرًا لوجود عدد قليل جدًا من متواليات البروتين المتحولة حقًا ، فقد تم اعتماد نهجين متميزين لتطوير مثل هذه الخوارزميات الحسابية.

الأسلوب الأول يستخدم نموذجًا بيولوجيًا فيزيائيًا كارهًا للماء - قطبي لتقطيع تسلسل البروتينات الخشنة [104]. يتم التعامل مع تسلسل البروتين كسلاسل من 18 خرزة يمكن أن تكون كارهة للماء أو قطبية. يوصف تشكيل هذه السلسلة على أنها نزهة ذاتية التجنب على شبكة شعرية ثنائية الأبعاد. يتم تخصيص طاقة مواتية لكل اتصال داخل السلسلة بين أزواج من الخرزات الكارهة للماء والتي تعمل على دفع طي هذه السلسلة. يتم بعد ذلك تعريف انحطاط الحالة الأصلية للتسلسل على أنه عدد الحالات الأصلية التي لها نفس عدد جهات الاتصال الكارهة للماء. ضمن هذا التعريف ، يتم تصنيف التسلسلات ذات قيمة الانحلال الأكبر من 1 على أنها متحولة (أو ثنائية الاستقرار). باستخدام هذا التعريف ، حدد تشان وزملاؤه [104] 181 بروتينًا ثنائي الاستقرار في قاعدة البيانات المطابقة للبروتين [107] ، وهي عبارة عن مجموعة من البروتينات من PDB تم الإبلاغ عن أكثر من بنية واحدة لها. مرشح مثير للاهتمام من بين هذه المجموعة المتوقعة هو السبانخ كلوروبلاست ثيوردوكسين (رقم تعريف PDB: 1FB6 [108] ، 1GL8 [109]) ، حيث يتم ثني الجزء N من اللولب الثاني α-helix في 1FB6 إلى قسمين 310 حلزونات في 1GL8 موجهة عند 110 درجة و 90 درجة تقريبًا إلى النصف C الطرفية من اللولب. من المعروف بالفعل أن ثنية الثيوردوكسين متورطة في تحول KaiB [18] ، على الرغم من أن الحلزون الأول في KaiB لا يزال دون تغيير في التشكل في ثنايا KaiB. على النقيض من ذلك ، فإن هذا اللولب منظم بشكل مختلف في التحولات المتوقعة للثيوريدوكسين السبانخ ، مما يشير إلى أن ثنية الثيوردوكسين القديمة ربما خضعت لأكثر من تحول متحولة أثناء التطور.

تعتمد الفئة الثانية من الأساليب على فرضية أن البروتينات المتحولة يجب أن تخلط بين خوارزميات التنبؤ بالبنية الثانوية [110-112].من المتوقع أن يكون ناتج خوارزميات التنبؤ بالهيكل الثانوي المستند إلى التسلسل غامضًا لمناطق البروتينات المتحولة التي تقوم بتبديل التشكل في الطيتين ، وقد تم الاستفادة من هذا الغموض للتنبؤ بتحول البروتين. استخدم Porter & amp Looger [110] تنبؤات بنية ثانوية غير متسقة ، جنبًا إلى جنب مع وجود وحدات قابلة للطي مستقلة داخل البروتينات (تم تحديدها باستخدام خوارزمية تكافؤ الطاقة الهيكلية للنطاقات (SEED)) لاكتشاف ما يقرب من 100 بروتين تبديل أضعاف مسجلة في PDB ، بالإضافة إلى ما يقرب من 100 بروتين آخر يحتوي على بنية واحدة فقط محلولة ، ولكن من المتوقع مع ذلك تبديل الطيات. وبالمثل ، قام وانج وزملاؤه [112] ببناء نموذج تم تدريبه على 201 بنية متحولة و 136 بنية بروتينية أحادية الشكل من PDB ، وهذا النموذج يصنف البروتينات على أنها أحادية الشكل أو متحولة بناءً على التسلسل. وتجدر الإشارة إلى أن هاتين الدراستين تعرفان جميع بروتينات تبديل الطيات على أنها متحولة ، بينما توجد البروتينات المتحولة الموصوفة في هذه المقالة في حالات مطوية متعددة في غياب الروابط أو العوامل المساعدة. في حين أن المعدل الإيجابي الخاطئ للتنبؤ القائم على التسلسل للبروتينات المتحولة لا يزال مرتفعًا (10-30 ٪) ، فإن هذه الخوارزميات تمثل خطوات أولى مهمة في معالجة هذه المشكلة الصعبة. المرشحون المثيرون للاهتمام الذين ظهروا من هذا النهج الثاني هم عدد من البروتينات الفيروسية مثل العاثية T7 والبروتينات السكرية لـ SARS ، بالإضافة إلى السموم المكونة للمسام التي تدخل في الأغشية ، على الرغم من عدم وجود التحقق التجريبي من هذه التنبؤات حتى الآن.

5. طرق دراسة البروتينات المتحولة

لقد شكل التعايش بين المطابقات المتعددة في التوازن تحديًا كبيرًا في اكتشاف وتوصيف البروتينات المتحولة. يتم تحسين خطوط أنابيب تحديد البنية البلورية والرنين المغناطيسي النووي بشكل عام للتخلص من مثل هذه الأنظمة غير المتجانسة ، وقد يكون هذا التحيز الضمني في تحضير العينة هو السبب في بقاء قائمة البروتينات المتحولة المعروفة قصيرة جدًا. منذ أن تم تأسيس وجود بروتينات ذات مطابقة مطوية متعددة ، ومع ذلك ، فقد اجتمع عدد من الأدوات التجريبية والحاسوبية لتعزيز فهمنا لأنظمة البروتين المتحولة. تشمل الأسئلة الرئيسية التي تم تناولها هياكل المطابقين ، وآلية التحويل البيني ، والتحقيق في وظائف المطابقات المختلفة ، وبعض اللمحات المحيرة في تطور البروتينات المتحولة.

أثبت كل من علم البلورات بالأشعة السينية والتحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي أنهما مهمان بنفس القدر في توضيح هياكل البروتينات المتحولة المغلقة في شكل معين. بينما هياكل Ltn10 [26] و Ltn40 [16] و KaiBfs [18] و O-Mad2 [60] و C-Mad2 [59] و IscU-S [51] و IscU-D [52] و RfaH (الكل -) [83] باستخدام التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي ، تم تحديد هياكل KaiBgs [49] و RfaH (all-α) [81] باستخدام علم البلورات بالأشعة السينية. كما تم تحديد السمات الهيكلية في هذه الأنظمة والتحقق من صحتها باستخدام طرق تكميلية مثل قياس الطيف الكتلي [113-115]. كان التحليل الطيفي متعدد الأبعاد بالرنين المغناطيسي النووي في طليعة الأبحاث في هذا المجال نظرًا لقدرته على توفير معلومات الدقة الذرية للأنظمة التي تظهر عدم التجانس الثابت والديناميكي [116-118]. كان الرنين المغناطيسي النووي محوريًا في إثبات وجود العديد من المطابقات في جميع البروتينات المتحولة الموصوفة في هذه المراجعة ، وكذلك في إظهار التحويل البيني القابل للانعكاس لهذه المطابقات في Ltn و IscU. علاوة على ذلك ، نتوقع أن منهجية الرنين المغناطيسي النووي التي تم تطويرها حديثًا للتوصيف الهيكلي للتشكيلات الجزيئية الحيوية المتناثرة وعابرة السكان [10] ، مثل نقل التشبع بالتبادل الكيميائي [119،120] وتشتت الاسترخاء [121،122] ، ستساعد في زيادة فهمنا للآليات الكامنة وراء التحويل البيني التوافقي في هذه الأنظمة.

ظلت الدراسات الآلية التي تبحث في التفاصيل الذرية لتبديل الطيات حتى الآن في المقام الأول ضمن مجال الأساليب الحسابية. الحجم الصغير (حوالي 100 بقايا) للعديد من هذه البروتينات يجعلها قابلة للطرق الديناميكية الجزيئية المعقدة دون وضع عبء ثقيل على الموارد الحسابية. كانت عمليات المحاكاة الحبيبية الخشنة وكذلك الديناميكيات الجزيئية (MD) مفيدة في رسم خرائط لمشهد الطاقة الحرة والمسارات الحركية لـ Ltn [114] و Mad2 [123] و RfaH (انظر أعلاه). ومع ذلك ، فإن التنبؤات المتضاربة من الأساليب الحسابية في حالة RfaH أوضحت أن مثل هذه الدراسات الآلية ستستفيد من القياسات التجريبية. من المثير للدهشة أن طرق الجزيء المفرد لم يتم استخدامها على نطاق واسع لاستكشاف البروتينات المتحولة. من ناحية أخرى ، كشف قياس الطيف الكتلي للتنقل الأيوني لـ Ltn أن Ltn10 أكثر مرونة بكثير من Ltn40 [114].

كما تم استخدام عدد من طرق هندسة البروتين المبتكرة لتشريح وظائف طيتين لأنظمة البروتين المتحولة. تكون الدراسات الوظيفية محفوفة بالصعوبة عندما يتحول اثنان من المطابقات بسرعة وبصورة عكسية ، حيث يصبح من الصعب إسناد تفاعل بروتين - بروتين أو بروتين - ليجند إلى أحد المطابقات. قام فولكمان وزملاؤه ببناء نسخ مقفلة من Ltn10 [33] و Ltn40 [32] من خلال دمج روابط ثاني كبريتيد إضافية لتثبيت أحد المطابقات الأخرى ، وبالتالي إنشاء حاجز حركي اصطناعي للتحويل البيني. تتوفر أيضًا الطفرات الموجهة بالبنية التي تعمل على تثبيت شكل واحد بشكل انتقائي لجميع أنظمة البروتين المتحولة الأخرى التي تمت مناقشتها هنا ، مما يوفر ترسانة من المتغيرات لفهم العلاقات بين البنية والوظيفة.

6. الخلاصة ووجهات النظر

تعتبر ديناميكيات البروتين أساسية للوظيفة وقد تورطت في حدوث خلل وظيفي ومرض. إن عدم التجانس المطابق الذي لوحظ في البروتينات هو نتيجة للإحباط المتأصل في مناظر الطاقة الحرة المطابقة للبروتين. لا يوجد نظام آخر يوضح مرونة هذه المناظر الطبيعية بشكل أفضل من البروتينات المتحولة ، التي تطورت لملء طيتين هيكليتين متميزتين من الدرجة الثالثة قادرة على التعامل مع وظائف مختلفة.

ينبع فهمنا الحالي للبروتينات المتحولة من المناهج الهيكلية والتطورية التكميلية التي تتراوح من التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي وعلم البلورات بالأشعة السينية إلى محاكاة الديناميات الجزيئية وإعادة بناء الأسلاف. لقد تمكنا من توضيح هياكل ووظائف المطابقات المختلفة وأيضًا إنشاء ، في بعض الحالات ، التحويل البيني العكسي. يتضح من البيانات المتاحة أن دراسة البروتينات المتحولة أمر بالغ الأهمية ليس فقط لفهم العلاقات بين البنية والوظيفة ، ولكن أيضًا لأن البروتينات المتحولة هي أنظمة نموذجية ممتازة في مجالات متنوعة مثل البيولوجيا الهيكلية والتطورية.

ومع ذلك ، فإن مجال البروتينات المتحولة لا يزال في مهده بعد 12 عامًا من المقالة المؤثرة لمورزين التي صاغ فيها مصطلح "البروتين المتحول" [12]. تُظهر البروتينات المتحولة النموذجية التي تم تمييزها حتى الآن حالتين تشكيليتين فقط في حالة توازن. ما إذا كان هذا قيدًا على المنهجية المتوفرة لدينا تحت تصرفنا للكشف عن العديد من المطابقات المختلفة ، أو إذا كان هناك قيد متأصل يفرضه مشهد الطاقة الخالي من البروتين ، فلا يزال غير واضح ، ودرجة اللدونة الهيكلية التي يمكن إظهارها بواسطة البروتين المتحول لا يزال سؤالا مفتوحا. في الواقع ، هناك اقتراحات في الأدبيات بأن النسخ العكسي لفيروس HIV-1 يمكن أن يتبنى ثلاثة تراكيب مختلفة [23]. هناك حاجة ملحة لتطوير تنبؤات قوية قائمة على التسلسل لأنظمة البروتين المتحولة التي يمكن بعد ذلك وصفها تجريبيًا. سيمهد هذا الطريق لزيادة قائمة البروتينات المتحولة وإجراء دراسات منهجية للتعرف على الموضوعات والأنماط. كما أننا لا نفهم سوى القليل جدًا عن آلية التحويل البيني للهياكل المتميزة وكيف يتم تحويل التوافقات المطوية المدمجة بكفاءة وقابلية للانعكاس دون تجميع. أخيرًا ، أين تتلاءم البروتينات المتحولة في النسيج العريض لتطور البروتين؟ هل هي وسيطة متورطة في الفعل ، أم أنها نقاط نهاية تطورية متطورة منحوتة بضغط الاختيار لتفضيل التطابقات المطوية المتعددة؟ هذه بعض الأسئلة المثيرة التي يواجهها مجال البروتينات المتحولة ، والإجابات التي ستزيد من سعينا للحصول على رؤى أعمق في البنية الجزيئية الحيوية وديناميكياتها وتطورها.


حدث خطأ أثناء تعيين ملف تعريف ارتباط المستخدم الخاص بك

يستخدم هذا الموقع ملفات تعريف الارتباط لتحسين الأداء. إذا كان متصفحك لا يقبل ملفات تعريف الارتباط ، فلا يمكنك عرض هذا الموقع.

إعداد المستعرض الخاص بك لقبول ملفات تعريف الارتباط

هناك العديد من الأسباب لعدم تعيين ملف تعريف الارتباط بشكل صحيح. فيما يلي الأسباب الأكثر شيوعًا:

  • لديك ملفات تعريف الارتباط معطلة في متصفحك. تحتاج إلى إعادة تعيين متصفحك لقبول ملفات تعريف الارتباط أو أن تسألك عما إذا كنت تريد قبول ملفات تعريف الارتباط.
  • يسألك متصفحك ما إذا كنت تريد قبول ملفات تعريف الارتباط ورفضت. لقبول ملفات تعريف الارتباط من هذا الموقع ، استخدم زر الرجوع واقبل ملف تعريف الارتباط.
  • متصفحك لا يدعم ملفات تعريف الارتباط. جرب متصفحًا مختلفًا إذا كنت تشك في ذلك.
  • التاريخ الموجود على جهاز الكمبيوتر الخاص بك في الماضي. إذا أظهرت ساعة الكمبيوتر لديك تاريخًا قبل 1 يناير 1970 ، فسينسى المتصفح ملف تعريف الارتباط تلقائيًا. لإصلاح ذلك ، قم بتعيين الوقت والتاريخ الصحيحين على جهاز الكمبيوتر الخاص بك.
  • لقد قمت بتثبيت تطبيق يراقب أو يمنع تعيين ملفات تعريف الارتباط. يجب عليك تعطيل التطبيق أثناء تسجيل الدخول أو مراجعة مسؤول النظام لديك.

لماذا يتطلب هذا الموقع ملفات تعريف الارتباط؟

يستخدم هذا الموقع ملفات تعريف الارتباط لتحسين الأداء من خلال تذكر أنك قمت بتسجيل الدخول عندما تنتقل من صفحة إلى أخرى. لتوفير الوصول بدون ملفات تعريف الارتباط ، سيتطلب الموقع إنشاء جلسة جديدة لكل صفحة تزورها ، مما يؤدي إلى إبطاء النظام إلى مستوى غير مقبول.

ما الذي يتم تخزينه في ملف تعريف الارتباط؟

لا يقوم هذا الموقع بتخزين أي شيء سوى معرف الجلسة الذي يتم إنشاؤه تلقائيًا في ملف تعريف الارتباط ولا يتم التقاط أي معلومات أخرى.

بشكل عام ، يمكن فقط تخزين المعلومات التي تقدمها ، أو الخيارات التي تقوم بها أثناء زيارة موقع ويب ، في ملف تعريف ارتباط. على سبيل المثال ، لا يمكن للموقع تحديد اسم بريدك الإلكتروني إلا إذا اخترت كتابته. إن السماح لموقع ويب بإنشاء ملف تعريف ارتباط لا يمنح هذا الموقع أو أي موقع آخر إمكانية الوصول إلى بقية جهاز الكمبيوتر الخاص بك ، ويمكن فقط للموقع الذي أنشأ ملف تعريف الارتباط قراءته.


شاهد الفيديو: ازاى تتخلص من جرثومة المعدة البكتيريا الحلزونية فى أسبوعين فقط! (ديسمبر 2022).