معلومة

25.1: استنساخ الحمض النووي - علم الأحياء

25.1: استنساخ الحمض النووي - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

الفصل 25.1: استنساخ الحمض النووي

25.1.7 المراجع


25.1.1 استنساخ الحمض النووي هو شبه محافظ

قدم توضيح بنية اللولب المزدوج بواسطة James Watson و Francis Crick في عام 1953 تلميحًا حول كيفية نسخ الحمض النووي أثناء عملية تكرار الحمض النووي. في نموذج واحد ، النسخ المتماثل شبه المحافظ, ينفصل خيوط اللولب المزدوج أثناء تكرار الحمض النووي ، ويعمل كل خيط كقالب يتم من خلاله نسخ الخيط التكميلي الجديد. كان هناك نموذجان متنافسان تم اقتراحهما أيضًا: تحفظا و مشتت، والتي تظهر في الشكل 25.1.1

الشكل 25.1.1 ثلاثة نماذج لتكرار الحمض النووي. في ال نموذج متحفظ ظلت خيوط DNA الأبوية (الزرقاء) مرتبطة بجزيء DNA واحد بينما ظلت خيوط الابنة الجديدة (باللون الأحمر) مرتبطة بجزيئات DNA حديثة التكوين. في ال نموذج شبه محافظ تم فصل الخيوط الأبوية وتوجيه تركيب خيط الابنة ، حيث يكون كل جزيء DNA ناتجًا هجينًا من حبلا الوالدين وحبلا الابنة. في ال نموذج مشتت، تحتوي جميع خيوط الحمض النووي الناتجة على مناطق من الحمض النووي للوالدين مزدوج الشريطة ومناطق من DNA الابنة مزدوج الشريطة.

الشكل بواسطة باركر ، ن. ، وآخرون. (2019) أوبنستاكس


ابتكر ماثيو ميسلسون وفرانكلين ستال تجربة في عام 1958 لاختبار أي من هذه النماذج يمثل بشكل صحيح تكرار الحمض النووي (الشكل 25.1.2). لقد نما البكتيريا ، الإشريكية القولونية لعدة أجيال في وسط يحتوي على نظير "ثقيل" من النيتروجين (15N) التي تم دمجها في القواعد النيتروجينية ، وفي النهاية ، في الحمض النووي. هذا المسمى الحمض النووي للوالدين. ال بكتريا قولونية ثم تحولت الثقافة إلى وسط يحتوي على 14N ويسمح لها بالنمو لجيل واحد. تم حصاد الخلايا وعزل الحمض النووي. تم فصل الحمض النووي عن طريق التنبيذ الفائق ، حيث شكل الحمض النووي العصابات وفقًا لكثافته. نمت في الحمض النووي 15من المتوقع أن يشكل N نطاقًا عند موضع كثافة أعلى من تلك التي نمت فيها 14لاحظ N. Meselson و Stahl أنه بعد جيل واحد من النمو في 14N ، كان النطاق الفردي الذي تمت ملاحظته وسيطًا في الموضع بين الحمض النووي للخلايا التي نمت حصريًا فيها 15ولا 14N. اقترح هذا إما وضع شبه محافظ أو مشتت للنسخ المتماثل. تم السماح لبعض الخلايا بالنمو لجيل آخر في 14N ونسج مرة أخرى. يتم حصاد الحمض النووي من الخلايا التي نمت على مدى جيلين في 14شكل N شريطين: كان شريط DNA واحد في الموضع الوسيط بينهما 15ن و 14N ، والآخر يتوافق مع نطاق 14N DNA. لا يمكن تفسير هذه النتائج إلا إذا تكرر الحمض النووي بطريقة شبه محافظة. لذلك ، تم استبعاد النموذجين الآخرين. نتيجة لهذه التجربة ، نعلم الآن أنه أثناء تكرار الحمض النووي ، يعمل كل من الخيطين اللذين يشكلان الحلزون المزدوج كقالب تُنسخ منه خيوط جديدة. سيكون الخيط الجديد مكملًا للضفيرة الأبوية أو "القديمة". جزيئات الحمض النووي الناتجة لها نفس التسلسل وتنقسم بالتساوي إلى خليتين ابنتيتين.

الشكل 25.1.2 جرب ميزلسون وستال بكتريا قولونية نمت أولاً في النيتروجين الثقيل (15N) ثم في 14ن. نمت في الحمض النووي 15كان N (الشريط الأزرق) أثقل من الحمض النووي المزروع فيه 14N (شريط أحمر) ، وترسّبت إلى مستوى أدنى عند التنبيذ الفائق. بعد جولة واحدة من النسخ المتماثل ، ترسب الحمض النووي في منتصف الطريق بين 15ن و 14مستويات N (النطاق الأرجواني) ، مع استبعاد النموذج المحافظ للنسخ المتماثل. بعد جولة ثانية من النسخ المتماثل ، تم استبعاد النموذج المشتت للنسخ المتماثل. دعمت هذه البيانات نموذج النسخ المتماثل شبه المحافظ.

الشكل بواسطة باركر ، ن. ، وآخرون. (2019) أوبنستاكس


فكر في الأمر

  • ماذا كانت النتيجة التي توصلت إليها تجربة ميسيلسون وستال إذا وجدوا ، بعد الجيل الأول ، حزمتين من الحمض النووي؟

25.1.2 تكرار الحمض النووي في بدائيات النوى

تمت دراسة تكاثر الحمض النووي جيدًا في البكتيريا بشكل أساسي بسبب صغر حجم الجينوم والطفرات المتوفرة. بكتريا قولونية يحتوي على 4.6 مليون زوج أساسي (Mbp) في كروموسوم دائري واحد ويتكرر كل ذلك في حوالي 42 دقيقة ، بدءًا من واحد أصل النسخ المتماثل والاستمرار حول الدائرة باتجاهين (أي في كلا الاتجاهين) (الشكل 25.1.3). هذا يعني أنه يتم إضافة ما يقرب من 1000 نيوكليوتيد في الثانية. هذه العملية سريعة جدًا وتحدث مع القليل من الأخطاء. القولونية لديه واحد أصل النسخ المتماثل، مسمى oriC، على كروموسومه الواحد. يبلغ أصل النسخ المتماثل حوالي 245 زوجًا قاعديًا وهو غني بتسلسلات الأدينين - الثايمين (AT).

الشكل 25.1.3 تكرار الحمض النووي بدائية النواة. يبدأ تكرار الحمض النووي في بدائيات النوى من أصل واحد للنسخ المتماثل ، كما هو موضح في الشكل إلى اليسار ، ويستمر بطريقة ثنائية الاتجاه حول الكروموسوم الدائري حتى اكتمال النسخ المتماثل. تخلق الطبيعة ثنائية الاتجاه للنسخ المتماثل شقين للنسخ المتماثل يتوسطان بنشاط في عملية النسخ المتماثل. يوضح الشكل الأيمن نموذجًا ديناميكيًا لهذه العملية. تمثل النقاط الحمراء والزرقاء دمج نيوكليوتيدات حبلا الابنة أثناء عملية النسخ المتماثل.

شخصيات من: دانيال يوين في مشتقات ديفيد ترايب وكاثرين ، 228


نظرة عامة على النسخ المتماثل

تسمى المناطق المفتوحة للحمض النووي التي تخضع للنسخ المتماثل شوكات النسخ المتماثل. تتجمع جميع البروتينات المشاركة في تكرار الحمض النووي في شوكات النسخ المتماثل لتشكيل مجمع النسخ المتماثل يسمى أ ريبيزوم (الجدول 25.1.1 والشكل 25.1.4). تكرار الحمض النووي في الكائن الحي النموذجي بكتريا قولونية تمت دراسته على نطاق واسع ، مما يوفر أساسًا لفهم الآليات المتنوعة لتكرار الجينوم الذي تستخدمه جميع الكائنات الحية. في بكتريا قولونية، يبدأ تكرار الحمض النووي في oriC (الشكل 25.1.3). oriC "ذاب" بفعل بروتين البادئ DnaA لفضح اثنين من خيوط قالب ssDNA التي تعمل كمنصات لتحميل النسخ المتماثل هليكس DnaB. يتم تحميل سداسي DnaB كامل واحد على كل خيط ssDNA بمساعدة ملف محمل هيليكس ، DnaC. يتم تغليف ssDNA المكشوف الإضافي بسرعة بواسطة بروتين رابط ssDNA (SSB)، الذي يحمي الحمض النووي ويمنع تحميل هليكس DnaB الإضافي. يتم تجنيد كل DnaB hexamer بريماز (DnaG) ، الذي يصنع مواد أولية من الحمض النووي الريبي المستخدمة لبدء تخليق الحمض النووي ، جنبًا إلى جنب مع الوحدات الفرعية التي تشكل التكاثر أنزيم بوليميريز الدنا الثالث (PolIII HE). تشكل هذه البروتينات العناصر الأساسية التي تنسخ بكتريا قولونية الجينوم. بمجرد تجميعها ، تتكاثر عمليات إعادة التجميع ثنائية الاتجاه بعيدًا عن oriC حتى ، من الناحية المثالية ، يخضعون للتفكيك المبرمج في منطقة النهاية ، حيث يواجهون ثالثا مواقع ملزمة بروتينات توس التي تخلق "مصائد شوكة النسخ المتماثل". بعد الانتهاء من تكرار الحمض النووي ، يتم فصل الجينومات المركبة حديثًا وفصلها إلى الخلايا الوليدة.

الجدول 25.1.1 الإنزيمات المشاركة في تكرار الحمض النووي في بدائيات النوى ، الإشريكية القولونية

الشكل 25.1.4 نظرة عامة عامة على شوكة النسخ المتماثل للحمض النووي. في أصل النسخ المتماثل ، يقوم توبويزوميراز II بإرخاء الكروموسوم فائق الالتواء. يتم تشكيل اثنين من شوكات النسخ عن طريق فتح الحمض النووي مزدوج الشريطة في الأصل ، ويفصل الهليكاز خيوط الحمض النووي ، والتي يتم تغليفها ببروتينات ربط أحادية السلسلة للحفاظ على فصل الخيوط. يحدث تكرار الحمض النووي في كلا الاتجاهين. يتم تصنيع RNA التمهيدي التكميلي للحبلة الأبوية بواسطة RNA primase ويتم استطالة بواسطة DNA polymerase III من خلال إضافة النيوكليوتيدات إلى نهاية 3′-OH. على الخيط الرئيسي ، يتم تصنيع الحمض النووي بشكل مستمر ، بينما على الشريط المتأخر ، يتم تصنيع الحمض النووي في امتدادات قصيرة تسمى شظايا أوكازاكي. تتم إزالة بادئات الحمض النووي الريبي داخل الشريط المتأخر بواسطة نشاط نوكلياز خارجي لبوليميراز الحمض النووي I ، ويتم ربط شظايا أوكازاكي بواسطة DNA ligase.

الشكل بواسطة باركر ، ن. ، وآخرون. (2019) أوبنستاكس

جمعية بريموسوم

كما هو مذكور أعلاه ، يبدأ تكرار الكروموسوم البكتيري في أوريج حيث يرتبط البروتين البادئ ، DnaA ، لبدء تجميع آلة إعادة الحشو الإنزيمي. تتضمن المراحل الأولى من هذه العملية تجميع ملف بريموسوم، يعمل هذا على فك شريطين من الحمض النووي في شوكات النسخ وإضافة بادئات RNA إلى قوالب الحمض النووي التي ستستخدمها إنزيمات بوليميريز الحمض النووي لبدء النسخ المتماثل. بعد إعادة تشكيل أصل النسخ المتماثل الناجم عن الحمض النووي الريبي ، يحدث تجميع البريموسوم المعتمد على اللودر البكتيري في خطوات منفصلة ويتضمن على الأقل أربعة بروتينات مختلفة (بروتين البادئ ، وهليكاز ، وبروتين لودر هيليكس ، وبريماز) التي تعمل في تنسيق منسق والطريقة المتسلسلة (الجدول 25.1.1).

ال oriC تحتوي منطقة بدائيات النوى على أشكال متسلسلة محفوظة بدرجة عالية تتضمن مجال AT-rich box الذي يعمل كتسلسل التعرف على ارتباط بروتين البادئ DnaA. الربط الأولي لـ DnaA بـ oriC يشجع على ذوبان اللولب المزدوج للحمض النووي وتوظيف العديد من الوحدات الفرعية للحمض النووي DNA التي تشكل أوليغومر حلزوني على طول الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل والذي تم افتتاحه حديثًا (ssDNA) (الشكل 25.1.5). يحتوي بروتين DnaA على أربعة مجالات رئيسية. المجالات III و IV جزء لا يتجزأ من ربط ssDNA ، بينما يشارك المجال I في تفاعلات البروتين والبروتين. يشكل المجال الثاني رابطًا مرنًا بين مجال تفاعل البروتين ومجالات ربط الحمض النووي.

الشكل 25.1.5 تجميع بريموسوم. ذوبان الحمض النووي في oriC وتحميل DnaB6- (DnaC)6 هيليكس-لودر المركب على فقاعة الحمض النووي. التخطيطي السفلي: يرتبط DnaA المرتبط بـ ATP (البروتين البادئ) بصناديق DnaA عبر المجال الرابع ، وبالتالي يعزز dsDNA للالتفاف حول خيوط DnaA ، مما يتسبب في إجهاد الالتواء لـ dsDNA. في غضون ذلك ، يرتبط المجال الثالث من DnaA بأحد خيطي ssDNA لعنصر تفكيك الحمض النووي ويمتد الشريط. تتسبب هذه التفاعلات في ذوبان عنصر تفكيك الحمض النووي الغني بـ AT لتشكيل فقاعة. في الوقت نفسه ، فإن ربط DnaC (محمل الهليكاز) يحبس DnaB (الهليكاز) في تشكيل مفتوح لغسالة القفل ، لتمكين تحميله على ssDNA. يتفاعل DnaC مع DnaA في نهاية الفتيل ويعمل كمحول لتحميل مركب DnaB – DnaC واحد. من غير المعروف ما إذا كان إغلاق DnaB حول ssDNA لتشكيل حلقة سداسية الشكل يحدث قبل أو بالتزامن مع تفكك DnaC. يتفاعل المجال الأول من DnaA مع المجال الطرفي N لـ DnaB ، مما يساعد على تحميل DnaB-DnaC آخر على الشريط التكميلي. الأجزاء العلوية الداخلية: الخيوط الحلزونية لـ DnaA المتكونة من Domains III (برتقالي فاتح) و IV (أخضر شاحب) من Aquifex aeolicus DnaA (PDB: 3R8F) والمجال الرابع من بكتريا قولونية الحمض النووي (أخضر شاحب) مرتبط بـ dsDNA (PDB: 1J1V). يرتبط ssDNA في منتصف خيوط DnaA عبر التفاعلات مع AAA + المجال III من DnaA.

الشكل من: Xu ، Z-Q. وديكسون ، ن. (2018) Curr Op Struct Biol 53: 159-168


في ال بكتريا قولونية النظام ، وهو بروتين محمل الهليكاز ، DnaC ، المركب مع ATP ، يرتبط بـ Hexameric Helicase DnaB ويشكل مجمع DnaB-DnaC ، والذي تم تأكيده بواسطة دراسات المجهر الإلكتروني (cryo-EM). يقوم بروتين اللودر بتسليم الهليكاز إلى خيوط الحمض النووي المفرد الذائب لمركب البروتين النووي DnaA-oriC في أصل التكاثر. في الجسم الحي، يرتبط هذا التسليم بالبروتين البادئ ، DnaA ، الذي يُعتقد أن مجاله الطرفي الأميني (NTD) له دور في تحميل مجمع هليكس وهليكاز لودر على oriC من خلال التفاعل مع Helicase ، DnaB. بعد أن ينفصل بروتين اللودر عن حلقة الهليكاز ، يتفاعل NTD الخاص بهليكاز مع المجال الكاربوكسي الطرفي (CTD) الخاص بالبريميز ويشكل عنصرًا وظيفيًا بريموسوم. داخل البريموسوم ، يعمل الهليكس (DnaB) على فك اللولب المزدوج الذي تقطعت به السبل ، ويقوم البريميز (DnaG) بتركيب بادئات الحمض النووي الريبي على كل من خيوط الحمض النووي الرائدة والمتأخرة.

Helicases هي بروتينات حركية تتحرك بشكل اتجاهي على طول العمود الفقري للحمض النووي فوسفوديستر ، وتفصل بين خيوط حمض نووي صلب مثل DNA و RNA ، باستخدام الطاقة من التحلل المائي ATP. هناك العديد من المروحيات ، التي تمثل مجموعة كبيرة ومتنوعة من العمليات التي يجب فيها تحفيز فصل الخيوط. ما يقرب من 1 ٪ من رمز الجينات حقيقية النواة للهليكازات. رموز الجينوم البشري لـ 95 طائرة هليكوبتر غير زائدة عن الحاجة: 64 هليكاز RNA و 31 هليكاز DNA. تتضمن العديد من العمليات الخلوية ، مثل تكرار الحمض النووي ، والنسخ ، والترجمة ، وإعادة التركيب ، وإصلاح الحمض النووي ، والتكوين الحيوي للريبوسوم ، فصل خيوط الحمض النووي التي تستلزم استخدام الهليكازات. القولونية، DnaB Helicase (الشكل 25.1.5) هو المسؤول عن فك خيوط الحمض النووي الأصل لفكهما وفصلهما عن بعضهما البعض لتشكيل شوكة تكرار على شكل "Y". شوكات النسخ هي الموقع الفعلي لنسخ الحمض النووي. أثناء التكاثر داخل الشوكة ، تسمى البروتينات الحلزونية المزعزعة للاستقرار بروتينات ربط مفردة مجدولة (SSB)، ترتبط بالمناطق أحادية الجديلة التي تمنع الخيوط من الانضمام مرة أخرى.

بوليميراز الحمض النووي

إنزيمات بوليميريز الحمض النووي مطلوبة لتجميع خيوط الابنة على طول كل من خيوط DNA النموذجية. تتطلب جميع بوليميرات الحمض النووي قالب DNA وبادئًا يتم استخدامه لبدء عملية النسخ المتماثل. التمهيدي عبارة عن خيط قصير من الحمض النووي الريبي يتم وضعه على قالب الحمض النووي بواسطة إنزيم بريماز. تذكر أيضًا أن الحمض النووي يحتوي على خيطين متعارضين وأن DNA polymerases يمكن أن يضيف فقط نيوكليوتيدات جديدة في اتجاه 5 إلى 3 عند توليف خيوط ابنة DNA. نظرًا لأن كلا خيوط الحمض النووي يتم نسخها في وقت واحد بواسطة نفس الريبليزوم ، فإن الساحل الرئيسي،حيث يتحرك حبلا ابنة الحمض النووي في اتجاه 5 'إلى 3' ، يتكرر بشكل مستمر ويتدفق في نفس اتجاه حركة إعادة التوازن. ال حبلا متخلفة ، الذي يكمن في الاتجاه المضاد الموازي ، يجب تصنيعه في الاتجاه المعاكس لحركة إعادة التوازن ويتم إنشاؤه باستخدام رشقات قصيرة من نشاط بوليميريز الحمض النووي مما يؤدي إلى تكوين شظايا أوكازاكي على طول خيط القالب. وهكذا ، فإن حبلا متخلفة يجب أن يتم تحضيره باستمرار بتسلسلات قصيرة من الحمض النووي الريبي للحفاظ على تكوين شظايا أوكازاكي. يجب بعد ذلك استبدال تسلسلات RNA التمهيدي بالحمض النووي ويجب أيضًا إصلاح الفجوات في العمود الفقري للحمض النووي.

بكتريا قولونية لديه ما مجموعه خمسة بوليميرات الحمض النووي. تشارك ثلاثة من هذه الإنزيمات في تكرار الحمض النووي (DNA polymerases I و II و III). إن بوليميراز الدنا الثالث هو البوليميراز الرئيسي الذي يشارك في كل من عملية التخليق الحيوي الرائدة وتوليف شظايا أوكازاكي أثناء تكرار الحمض النووي. يتكون إنزيم DNA polymerase III من 10 بروتينات مختلفة منظمة في ثلاثة مجموعات متميزة وظيفيًا ، ولكنها مترابطة ماديًا: (1) قلب αεθ ، (2) β2 انزلاق المشبك ، و (3) δτنγ3 نδ'ΨX مجمع محمل المشبك (الشكل 25.1.6). في لب البوليميراز ، α هي الوحدة الفرعية للبوليميراز ، ε 3’ – 5 نوكلياز خارجي مصحح و θ هي وحدة فرعية صغيرة تستقر ε. بعد أن يتم تصنيع RNA بواسطة DnaG ، فإن β2يتم تحميل المشبك على طرف التمهيدي بواسطة محمل المشبك. تربط الوحدتان الفرعيتان α و المشبك بشكل منفصل ، كل منهما عبر نموذج ربط مشبك خطي قصير (CBM) بجيوب ربط CBM ذات الصلة بشكل متماثل من2. يتم ربط Pol III بالمشابك ، وهو قادر على تصنيع الحمض النووي بسرعة عالية (∼1000 Nt / s) ومع معالجة أعلى بكثير (> 150 كيلو بايت).

الشكل 25.1.6 إعادة تشكيل الحمض النووي. (أ) نموذج الكتاب المدرسي القياسي لـ DNA Replisome يوضح العمليات المزدوجة والمنسقة للغاية لتوليف الجدائل المتخلفة والمتأخرة. يرتبط DNA polymerase III بـ DnaB Helicase من خلال الوحدة الفرعية لمجمعات محمل المشبك واثنان أو ثلاثة نوى من البوليميراز تقوم بتكرار الحمض النووي من كل من قوالب الحمض النووي للخيط المتخلف وقوالب الحمض النووي في نفس الوقت. يرتبط ssDNA في حلقة السلسلة المتأخرة ببروتينات ربط ssDNA (SSB). (ب) أظهرت الدراسات الحديثة أن E. coli DNA polymerase III يمكن استبدالها بسهولة عند الشوكة وأن تركيب الخيط الرئيسي والخيط المتأخر قد لا يكون مقترنًا بإحكام ، أو حتى يمكن إنجازه بواسطة أنزيمات DNA polymerase III المختلفة. يمكن أيضًا فصل هيليكاز DnaB عن مركب بوليميراز الحمض النووي ونقله قبل قمة الشوكة.

الشكل من: Xu ، Z-Q. (2018) Curr Op Struct Biol 53: 159-168


تعتبر البدائل البكتيرية آلات عالية المرونة ومتحركة ، حيث يتم التحكم في ديناميكياتها بواسطة شبكة من التفاعلات البروتينية والبروتينية ذات نقاط القوة المختلفة. العديد من بروتينات النسخ إما مرنة أو تحتوي على مناطق مرنة أو غير منظمة ، مما يجعل الدراسات الهيكلية بواسطة علم البلورات بالأشعة السينية أو الرنين المغناطيسي النووي صعبة. ومع ذلك ، من خلال عقود من الجهود ، الهياكل للجميع بكتريا قولونية تم حل بروتينات النسخ المتماثل أو متماثلاتها البكتيرية كمجمعات أو بروتينات كاملة أو مجالات. شهدت الاختراقات الحديثة في الفحص المجهري الإلكتروني للجسيم الفردي (cryo-EM) هياكل محددة لمجموعات فرعية كبيرة متجانسة ، حتى مجموعة البكتيريا T7 بأكملها ، على الرغم من دقة متواضعة حتى الآن.

هياكل Cryo-EM من بكتريا قولونية بول الثالث الأساسية ، المشبك ، τج (المجال الطرفي C للوحدة الفرعية لمركب المشبك) تم حلها مؤخرًا على DNA القالب التمهيدي في كل من أوضاع البلمرة والتدقيق اللغوي عند 8 و 6.7 ، على التوالي ، جنبًا إلى جنب مع هياكل مجمع خالٍ من الحمض النووي (الشكل 9.7 ). تشبه هذه الهياكل النماذج الهيكلية المقترحة سابقًا ، مع بعض المفاجآت. على سبيل المثال ، في معقد البلمرة المرتبط بالحمض النووي ، β2 يصبح المشبك عموديًا تقريبًا على خيوط الحمض النووي (الشكل 25.1.7 أ ، ب) ، على عكس تكوينه المائل في التركيب البلوري للحمض النووي المرتبط β2. بينما ترتبط الوحدة الفرعية Polymerase Polymerase α بالحمض النووي DNA في شكل مشابه للتركيب البلوري للحمض النووي المرتبط Thermus aquaticus (طق) α ، مواقع نطاقات C- الطرفية (αCTD ، التي تضم مجال ربط قليل النوكليوتيد ، OB ، ومجالات ربط τ ، TBD ،) مختلفة. في ال طق هيكل α والمجمع الخالي من الحمض النووي ، فإن αCTD قريب من موقع البوليميراز النشط مع وضع مجال OB لربط قالب ssDNA وتسليمه إلى الموقع النشط (الشكل 25.1.7c ، د). في هياكل Cryo-EM المرتبطة بالحمض النووي ، يتم تحويل هذه المجالات نحو مجال الإصبع الصغير لـ α ، وهو المجال الذي يتصل مباشرة بـ β2 المشبك. لذلك فهي بعيدة عن خيط القالب الذي يدخل الموقع النشط (الشكل 25.1.7e). يتصل مجال OB بمجالي الإصبع الصغير والإبهام لـ α بالإضافة إلى β2 المشبك و ε. وجه مجال OB الذي كان يعتقد أنه متورط في ربط قالب ssDNA يواجه الآن مباشرة وهو قريب نسبيًا من dsDNA. بالإضافة إلى ذلك ، ε أسافين بين مجال الإبهام والمشابك. يبدو أن شبكة التفاعل هذه التي لم يتم تقديرها سابقًا تعمل على استقرار المجمع بأكمله.

الشكل 25.1.7 هياكل بكتريا قولونية البوليميراز - المشبك- τج- مجمعات الحمض النووي. (أ) تمثيلات سطحية لمجمعات البلمرة (يسار) وتصحيح التجارب المطبعية (يمين). نطاقات N- الطرفية لـ α (αNTD ، البقايا 1-963 ، ملونة في سمك السلمون العميق) ، ومجالات OB (964-1072) ومجالات ربط (TBD ، 1173-1160) لـ αCTD في السلمون البني والداكن ، على التوالي ، باللون الأصفر ، β2 في الزبرجد ، θ باللون البرتقالي و τج في لائحة. لا يتضمن معقد البلمرة θ وج و αCTD مفقودة من مجمع التدقيق اللغوي. (ب) تمثيلات كارتونية للمجمعات توضح الاختلافات في قالب DNA التمهيدي. في مجمع البلمرة (على اليسار) ، يحتوي الحمض النووي على بنية على شكل B ، بينما في مجمع التدقيق اللغوي ، يتم تآكل DNA التمهيدي بنهاية الشريط المركب حديثًا في المركز النشط لـ ε. يتم تدوير مجمع التدقيق اللغوي قليلاً لإظهار الحمض النووي في المركز النشط ε ويتم حذف الوحدة الفرعية من أجل الوضوح. (ج) التمثيل السطحي لـ αNTD من مجمع البلمرة المرتبط بالحمض النووي (PDB: 5FKV) ، يُظهر مجالات الإبهام والنخيل والأصابع ومجالات PHP. (د) وضع αCTD في المجمعات الخالية من الحمض النووي (PDB: 5FKU). (هـ) وضع αCTD في مجمع البلمرة المرتبط بالحمض النووي (PDB: 5FKV). في حين أن مجال OB في المجمع الخالي من الحمض النووي قريب من الموقع النشط لـ Pol III α ، فهو بعيد جدًا في المجمع المرتبط بالحمض النووي. يتم تلوين مجال OB باللون البحري و TBD باللون الأرجواني. يُظهر αNTD (الرمادي) في المجمعين تغييرات طفيفة نسبيًا مقارنة بـ αCTD.

الشكل من: Xu ، Z-Q. (2018) Curr Op Struct Biol 53: 159-168


بشكل عام ، هناك تغييرات توافقية كبيرة في مجمع DNA Polymerase III عند الارتباط بالحمض النووي الذي يتسبب في انتقال ذيل البوليميراز من التفاعل مع المشبك في الحالة المرتبطة بالحمض النووي ، إلى موضع 35 Å بعيدًا عن المشبك في حالة خالية من الحمض النووي (فيديو 25.1.1). تم الافتراض بأن هذا التغيير التوافقي الكبير قد يساعد البوليميراز في العمل كمفتاح لتسهيل تخليق الخيوط المتأخرة. على الخيط المتأخر ، يعاد وضع البوليميراز إلى موقع معدة حديثًا كل 1000 نقطة أساس. للقيام بذلك ، يحتاج البوليميراز إلى تحرير كل من المشبك والحمض النووي. قد تلعب الحركة الشبيهة بالتبديل لذيل البوليميراز دورًا في إطلاق البوليميراز وإعادة وضعه في نهاية جزء أوكازاكي.

فيديو من: Fernandez-Liero، R.، et al. (2015) eLife 4: e11134


يشبه مجمع التدقيق اللغوي إلى حد ما معقد البلمرة ، مع حركات صغيرة لمكونات البروتين الفردية (الشكل 25.1.7 أ ، ب). تشمل أهم الحركات دوران وإمالة DNA مزدوج الاتجاه مقابل مستوى2، قفل الحمض النووي ضد السطح الداخلي لـ β2 خاتم (الشكل 25.1.7 ب). يتحرك مجال إبهام البوليميراز و أيضًا نحو الحمض النووي. ينحرف مجال الإبهام بين خيطي DNA مع أزواج قاعدية لا مثيل لها ، مما ينتج عنه ركيزة DNA مشوهة للغاية ومتهالكة. وبالتالي ، فإن الخيط المركب حديثًا قادر على الوصول إلى موقع نوكلياز النشط لـ ε للتحرير. بالنظر إلى أن مجمع التدقيق اللغوي يشبه إلى حد ما معقدات البلمرة والحمض النووي المزدوج مع اثنين من أزواج القاعدة غير المتطابقة يميل إلى التآكل ، يُقترح أن ε يعمل بشكل سلبي عن طريق انتظار وصول الحمض النووي إلى مركزه النشط للنيوكلياز عندما يتم دمج نيوكليوتيد خاطئ بدلاً من الاستجابة بنشاط لحدث سوء الإدماج. في دراسة فيزيائية حيوية تكميلية أحادية الجزيء ، ثبت أن لب Pol III المرتبط بالمشابك مستقر بشكل ملحوظ ومعالج في وضع التدقيق اللغوي في غياب dNTPs الواردة.

يُعتقد منذ فترة طويلة أن البدائل البكتيرية هي آلات عالية التنسيق وذات معالجة عالية قادرة على نسخ الكروموسوم بأكمله دون تفكك. اثنان أو ثلاثة نوى بوليميراز من نفس الشيء بكتريا قولونية يُعتقد أن Pol III HE يصنع كلاً من خيوط الحمض النووي ، مع إعادة تدوير البوليميراز المتأخر بشكل متكرر من أجل تخليق جزء Okazaki الجديد ، كما هو موضح أعلاه. تمت مناقشة إعادة تدوير البوليميراز المتخلفة عن طريق العديد من آليات التصادم أو الإشارات بطريقة يتم التحكم فيها جيدًا والتي من المحتمل أن تتضمن حركة منطقة الذيل τ. ومع ذلك ، وجدت الدراسات الحديثة أن البوليميرات البكتيرية تتبادل أيضًا بسهولة عند شوكات النسخ المتماثل وأن تركيب الحمض النووي للخيط الرئيسي والشريط المتأخر قد لا يكون دائمًا مرتبطين بإحكام. يوضح الشكل 9.6 ب نموذجًا مقترحًا لهذا التبادل.

بشكل عام ، فإن DNA polymerase III عبارة عن إنزيم عالي المعالجة يشتمل على 600 إلى 1000 قاعدة في الثانية مع وجود أكثر من 100000 قاعدة مدمجة في حدث ربط ، ومعدل خطأ يقارب 1 لكل مليون.

بوليميريز الحمض النووي أنا، يساعد في عملية تخليق الخيوط المتأخرة ، في ذلك ، يزيل هذا البوليميراز بادئات الحمض النووي الريبي (RNA) ويدمج الحمض النووي في مكانه. بوليميريز الحمض النووي الثاني ، على الرغم من عدم فهمه جيدًا ، إلا أنه يُعتقد أنه يلعب دورًا في التحرير بعد تخليق الخيوط المتأخرة بواسطة بوليميراز الحمض النووي 1. تلعب بوليميراز الحمض النووي الأول والثاني أيضًا دورًا في إصلاح الحمض النووي ، كما يفعل بوليميرات الحمض النووي IV و V.

بوليميريز الحمض النووي أنايشبه DNA polymerase III من حيث أنه يحتوي على 5 'إلى 3' نشاط بوليميريز ولديه أيضًا نشاط 3 'إلى 5' نوكلياز خارجي للتوسط في كل من العملية ووظيفة تصحيح الحمض النووي للإنزيم. بالإضافة إلى ذلك ، يحتوي DNA polymerase I أيضًا على مجال بروتين كبير يسمى جزء Klenow التي تعرض نشاط نوكلياز خارجي من 5 إلى 3 (الشكل 25.1.8). نشاط نوكلياز خارجي 5 'إلى 3' مسؤول عن إزالة بادئات RNA على طول الشريط المتأخر. تمكن عملية هذا الإنزيم البوليميراز من إعادة ملء هذه الفجوات بالحمض النووي. ومع ذلك ، فإن DNA polymerase I غير قادر على توصيل العمود الفقري لشظايا Okazaki المصنعة حديثًا مع الجزء السفلي. يتم إصلاح الفجوات في العمود الفقري للحمض النووي بواسطة أ إنزيم DNA ligase.

الشكل 25.1.8 هيكل بكتريا قولونية بوليميريز الحمض النووي I. يُظهر بوليميراز الحمض النووي I نشاطًا من 5 إلى 3 من البوليميراز ونشاط نوكلياز خارجي من 3 إلى 5 بوصات يتوسط في أنشطة معالجة الإنزيم وإثباته. يحتوي DNA polymerase I أيضًا على نشاط نوكلياز خارجي من 5 إلى 3 موجود في مجال خاص من الإنزيم يسمى جزء Klenow. هذا المجال مسؤول عن إزالة تسلسل RNA التمهيدي من DNA المركب حديثًا. ثم يتم استخدام نشاط البوليميراز 5 إلى 3 لاستبدال RNA التمهيدي بالحمض النووي. يضمن نشاط نوكلياز خارجي من 3 إلى 5 أن يتم دمج القواعد الصحيحة.

الشكل من: جودسيل ، دي إس (2015) جزيء الشهر RCSD PDB-101

العودة إلى الصدارة


إنزيمات DNA Ligase ختم الفواصل في العمود الفقري للحمض النووي التي تحدث أثناء تكرار الحمض النووي ، أو تلف الحمض النووي ، أو أثناء عملية إصلاح الحمض النووي. ينتج عن النشاط الكيميائي الحيوي لليغازات الحمض النووي ختم الفواصل بين 5′-فوسفات و 3′-هيدروكسيل تيرميني داخل خيط من الحمض النووي. تم تمييز ligases DNA على أنها تعتمد على ATP أو NAD+- تعتمد على العامل المشترك (أو الركيزة المشتركة) التي يتم استخدامها أثناء تفاعلها. عادة ، يوجد أكثر من نوع واحد من DNA ligase داخل الكائن الحي. كما هو مبين في الشكل 25.1.9 ، يتم تعديل إنزيم DNA ligase تساهميًا عن طريق إضافة جزء AMP إلى بقايا ليسين على الإنزيم. يُشتق AMP من العامل المساعد ATP أو NADH. إن 5'-فوسفات المصب في موقع نيك الحمض النووي قادر على التوسط في هجوم محب للأنوية على مجمع إنزيم AMP ، مما يتسبب في نقل AMP إلى موضع 5'-phospahte للحمض النووي. يعمل AMP كمجموعة مغادرة جيدة للهجوم النووي المحب للنووية من المنبع 3'-OH مع 5'-الفوسفات لإغلاق العمود الفقري للحمض النووي ، وإطلاق AMP.

الشكل 25.1.9 تفاعل DNA Ligase. تحفز ليجازات الحمض النووي الخطوة الحاسمة للانضمام إلى الفواصل في الحمض النووي المزدوج أثناء إصلاح الحمض النووي وتكرارها وإعادة التركيب ، وتتطلب إما أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) أو نيكوتيناميد أدينين ثنائي النوكليوتيد (NAD +) كعامل مساعد. يظهر على اليسار العلوي هو DNA ligase I يصلح الضرر الكروموسومي. الهياكل البروتينية الثلاثة المرئية هي: مجال ربط الحمض النووي (DBD) المرتبط بأخدود ثانوي للحمض النووي في كل من المنبع والمصب في المنطقة التالفة. يقوم مجال طيات OB (OBD) بفك الحمض النووي قليلاً على مدى ستة أزواج قاعدية ويشارك عمومًا في ارتباط الحمض النووي. يحتوي مجال Adenylation (AdD) على بقايا نشطة إنزيميًا تنضم إلى النيوكليوتيدات المكسورة معًا عن طريق تحفيز تكوين رابطة phosphodiester بين مجموعة الفوسفات والهيدروكسيل. من المحتمل أن جميع ligases DNA للثدييات (Ligases I و III و IV) لها بنية حلقية مماثلة وقادرة على التعرف على الحمض النووي بطريقة مماثلة. ال الرسم التخطيطي العلوي الأيمن هي بنية عالية الدقة من بكتريا قولونية LigA في مركب مع DNA مرقق من PDB 2OWO ، متخيل بواسطة UCSF Chimera. يشار إلى المجالات المختلفة بألوان مختلفة وتتعلق بمجالات Pfam المشار إليها. ال الرسم البياني السفلي يصور الآلية التحفيزية لـ DNA Ligase I. يشكل العامل المساعد ATP رابطًا تساهميًا مع بقايا ليسين في موضع α-phosphate الذي يغلف إطلاق ثنائي الفوسفات. يتم استخدام AMP لتنشيط مجموعة 5 'فوسفات لتمكين مجموعة المنبع 3'-OH للتوسط في الهجوم على ذرة الفوسفور المركزية. تعمل AMP كمجموعة مغادرة.

الشكل في الجزء العلوي الأيسر بواسطة: Ellenberger، T at Washington University School of Medicine، St. ) e00391 ، والرقم السفلي بواسطة: Showalter، A. (2002)


يظهر ملخص لعملية تكرار الحمض النووي في الفيديو 25.1.2

[عرض الفيديو = "1280" الارتفاع = "720" mp4 = "https://wou.edu/chemistry/files/2020...eplication.mp4"] [/ video]

فيديو من: Yourgenome ، رسوم متحركة بواسطة شركة Polymime Animation Company، Ltd

إنزيمات توبويزوميراز

يؤدي فك اللولب المزدوج الذي تقطعت به السبل في شوكة النسخ المتماثل إلى توليد توتر متعرج في الحمض النووي على شكل لفائف فائقة موجبة في بداية شوكة النسخ المتماثل. تسمى الانزيمات توبويزوميراز مواجهة هذا عن طريق إدخال سوبر سالبة في الحمض النووي من أجل تخفيف هذا الضغط في الجزيء الحلزوني أثناء النسخ المتماثل. هناك أربعة إنزيمات معروفة موجودة في توبويزوميراز بكتريا قولونية التي تندرج في فئتين رئيسيتين ، النوع الأول Topoisomerases والنوع II Topoisomerases (الشكل 25.1.10). يعتبر Topoisomerase I و III من النوع الأول topoisomerases ، في حين أن DNA gyrase و Topoisomerase IV هما من النوع II topoisomerases.

الشكل 25.1.10 تراكيب النوع الأول والنوع الثاني توبويزوميراز. (أ) التركيب البلوري لنوع 1 Topoisomerase ، موضح باللون الأزرق ، مرتبط بالحمض النووي ، كما هو موضح باللونين البرتقالي والأصفر. (ب) هيكل بلوري من النوع الثاني Topoisomerase. يشكل Topoisomerase II هيكلًا رباعي الأبعاد ، كما هو موضح باللونين الأخضر والأزرق. تظهر عوامل ATP (اللون الوردي) مرتبطة بالإنزيم.

جودسيل ، دي إس (2015) جزيء الشهر RCSD PDB-101


اكتب أنا توبويزوميراز تخفيف التوتر الناجم أثناء لف وفك الحمض النووي. إحدى الطرق التي يمكنهم من خلالها القيام بذلك هي إجراء قطع أو شق في خيط واحد من الحلزون المزدوج للحمض النووي (الشكل 25.1.11). يظل الجانب 5'-phosphoryl من حبلا DNA المكسور مرتبطًا تساهميًا بالأنزيم في بقايا التيروزين ، بينما يتم الاحتفاظ بالنهاية 3'-end بشكل غير تساهمي بواسطة الإنزيم. تقوم الإيزوميرات من النوع الأول بتدوير أو تدوير الطرف الثالث للحمض النووي حول حبلا الحمض النووي السليم. هذا يحرر الجريان في الحمض النووي ويطلق التوتر بشكل فعال. يكمل الإنزيم التفاعل عن طريق إعادة إحكام غلق العمود الفقري للفوسفوديستر أو الربط عودة الشريط المكسور معًا. بشكل عام ، يتم كسر خيط واحد فقط من الحمض النووي أثناء آلية التفاعل ويوجد لا متطلبات ATP أثناء التفاعل. القولونية يستطيع إنزيم Topo I إزالة لفائف الحمض النووي الفائقة السلبية فقط ، ولكن ليس الإيجابي منها. وبالتالي ، لا يشارك هذا الإنزيم في تخفيف الالتفاف الإيجابي الناتج عن هليكاز الحمض النووي أثناء النسخ المتماثل. هذا على عكس حقيقيات النوى Topo I التي يمكن أن تخفف كلاً من الالتفاف الفائق الإيجابي والسلبي. بالرغم ان بكتريا قولونية لا يشارك Topoisomerase I بشكل مباشر في تخفيف التوتر الناجم عن تكرار الحمض النووي ، فهو ضروري بكتريا قولونية بقاء. يُعتقد أنه يساعد في موازنة أعمال النوع الثاني من الإيزوميراز العلوي ويساعد في الحفاظ على كثافة الالتفاف الفائقة المثلى داخل الحمض النووي الصبغي. وبالتالي ، يُعتقد أن Topo I يساعد في الحفاظ على توازن التماثل الساكن للكروموسوم الفائق بالداخل بكتريا قولونية. يبدو أن Topo III ، وهو أيضًا من النوع الأول Topoisomerase ، يلعب دورًا في فك الكروموسومات الابنة أثناء تكرار الحمض النووي ، ولكنه لا يلعب دورًا في استرخاء الالتواء الفائق.

الشكل 25.1.11 تفاعل النوع الأول من الإيزوميراز. أثناء التفاعل ، يقوم النوع الأول Topoisomerases بقطع خيط واحد من الحمض النووي. يتم ربط أحد طرفي الحمض النووي المكسور تساهميًا بالإنزيم ، كما هو موضح باللون الأخضر الفاتح في المخططات السفلية. يتم الاحتفاظ بالطرف الآخر بشكل غير تساهمي ويتم تدويره حول الحلزون المزدوج لفك الالتفاف الفائق وإرخاء الحمض النووي. بمجرد تحرير التوتر الفائق ، يتم إعادة إحكام العمود الفقري ويتم تحرير إنزيم Topoisomerase I.

الشكل مُعاد خلطه من: Notahelix و JoKalliauer ، والمعهد القومي لأبحاث الجينوم البشري


النوع الثاني Topoisomerases له وظائف متعددة داخل الخلية. يمكن أن تزيد أو تقلل من توتر اللف داخل الحمض النووي أو يمكنها فك العقدة أو إزالة الحمض النووي الذي أصبح متشابكًا مع حبلا آخر (الشكل 25.1.12). إنها تفعل ذلك بطريقة أكثر خطورة من نظيراتها من النوع الأول ، عن طريق كسر كلا خيوط الحمض النووي أثناء آلية التفاعل. يرتبط الإنزيم تساهميًا بكلا الجانبين المكسورين بينما يتم تمرير حلزون الحمض النووي الآخر من خلال الكسر. ثم يتم إحكام كسر الخيط المزدوج.

الشكل 25.1.12 تفاعل النوع الثاني من الإيزوميراز. يتم تمثيل دورة تفاعل توبويزوميراز من النوع الثاني المقترحة بواسطة توبويزوميراز IV. يتم الإشارة إلى الوحدات الفرعية Topoisomerase IV باللون الرمادي والسماوي والأصفر. تكون البوابة أو G-DNA باللون الأخضر وتكون المادة المنقولة أو T-DNA باللون البنفسجي. يُشار إلى ATP المرتبط بنطاقات ATPase بنقطة حمراء. في الخطوة 1 ، يرتبط G-DNA بالإنزيم. يرتبط ATP وجزء T-DNA بالإنزيم في الخطوة 2. في الخطوة 3 ، يتم شق G-DNA ويتم تمرير T-DNA خلال الكسر. يتم تمييز المجالات المستهدفة للأدوية داخل مجمع توبويزوميراز من النوع الثاني في الأقسام الفرعية A و B و C مع أمثلة على الجانب الأيمن من الشكل.

تم تعديل الرقم من: Laponogov، I.، et al. (2018) اتصالات الطبيعة 9:2579.


DNA gyrase ، هو إنزيم توبويزوميراز من النوع الثاني الذي يشارك بشكل أساسي في تخفيف توتر الالتواء الفائق الإيجابي الذي ينتج عن فك الهيليكس عند شوكة النسخ المتماثل. يعالج النوع الثاني Topoisomerases ، وخاصة Topo IV ، أيضًا تحديًا ميكانيكيًا رئيسيًا يواجه إعادة الجراثيم البكتيرية أثناء إنهاء تكرار الحمض النووي. تملي الطبيعة الدائرية للكروموسوم البكتيري أن زوجًا من البدائل التي تبدأ من أصل واحد للنسخ المتماثل سوف يتقارب في النهاية مع بعضهما البعض في اتجاه الرأس. من الحمض النووي gyrase ، الذي يزيل عادة الملفات الفائقة الإيجابية ، يصبح محدودًا بسبب تناقص كمية الحمض النووي المتاحة للقالب ، وبدلاً من ذلك ، قد تنتشر اللفائف الفائقة خلف البدائل ، وتشكل مركبات سابقة التين بين DNA المرقع حديثًا ؛ في بكتريا قولونية يجب حل هذه المشاكل عن طريق Topo IV لحدوث فصل الكروموسوم.

بروتينات Tus وإنهاء النسخ المتماثل

الإنهاء السليم لتكرار الحمض النووي مهم لاستقرار الجينوم. القولونية النسخ المتماثل ينتهي في المنطقة المقابلة oriC. هناك عشرة إنهاء 23-bp (تير) المواقع في المنطقة مع بعض الاختلافات المتسلسلة التي تحدد تقاربات الربط الخاصة بـ بروتين إنهاء أحادي Tus (الشكل 25.1.13). يرتبط Tus بـ تير ذات تقارب عالٍ بنسبة 1: 1 و Tus–تير يمكن أن يشكل أيضًا مركبًا ثابتًا للغاية "قفل" إذا كان السيتوزين 6 من زوج القاعدة G-C (6) المحفوظ بدقة من تير تم قلبه من مزدوج الحمض النووي وربطه بجيب ربط السيتوزين المشكل مسبقًا من Tus (الشكل 25.1.13 ب). الطوس-تير مجمع القفل هو قطبي ذو وجه متساهل يسمح للبداء بالمرور دون عوائق ووجه غير متسامح يمكنه منع إعادة السمع. العشرة تير يتم تنظيم المواقع كمجموعتين متعاكستين من خمسة ، مما يسمح للإعادة بتمرير المجموعة الأولى ويتم حظره في المجموعة الثانية. هذا يضمن أن شوكتي النسخ المتماثل تتقاربان في منطقة النهاية لفصل الكروموسوم المناسب.

الشكل 25.1.13 آليات انسداد إعادة الجسم بواسطة Tus-تير مجمعات إنهاء النسخ المتماثل.(أ) تمثيل تخطيطي لـ بكتريا قولونية كروموسوم ، تظهر مواقع oriC و تير المواقع. تمر الشوكة المتحركة في اتجاه عقارب الساعة عبر المواقع المسموح بها الموضحة باللون الأخضر ويتم إيقافها في المواقع غير المسموح بها الموضحة باللون الأحمر. (ب) تمثيل تخطيطي لهيكل طوس "المقفل"تير مركب (PDB: 2I06) ، يظهر السيتوزين 6 في جيبه الملزم في Tus. (ج) تفاعلات البقايا Arg198 من Tus مع كل من خيوط تير في المجمعات ذات النوع البري المزدوج الذين تقطعت بهم السبل تير (PDB: 2I05 ، يسار) و Tus–تير مجمع UGLC (GC (6) زوج أساسي مقلوب ؛ PDB: 4XR3 ، يمين).

الشكل من: Xu ، Z-Q. (2018) Curr Op Struct Biol 53: 159-168

25.1.3 استنساخ الحمض النووي للعناصر خارج الصبغيات: البلازميدات والفيروسات

لنسخ الأحماض النووية ، غالبًا ما تستخدم البلازميدات والفيروسات اختلافات في نمط تكرار الحمض النووي الموصوف لجينومات بدائيات النوى. سنركز هنا على نمط واحد يعرف باسم طريقة الدائرة المتداول.

المتداول دائرة تكرار

في حين أن العديد من البكتيرية البلازميدات تتكاثر من خلال عملية مماثلة لتلك المستخدمة لنسخ الكروموسوم البكتيري ، والبلازميدات الأخرى ، عدة العاثيات، و البعض الفيروسات استخدام حقيقيات النوى المتداول تكرار الدائرة (الشكل 25.1.14). إن الطبيعة الدائرية للبلازميدات وتعميم بعض الجينومات الفيروسية على العدوى تجعل هذا ممكنًا.يبدأ تكرار الدائرة المتدحرجة بالخدش الأنزيمي لخيط واحد من جزيء دائري مزدوج الشريطة في موقع منشأ مزدوج الشريطة (dso). في البكتيريا ، يرتبط DNA polymerase III بمجموعة 3′-OH من الخيط المكسور ويبدأ في تكرار الحمض النووي بشكل أحادي باستخدام الخيط غير المكسور كقالب ، مما يؤدي إلى إزاحة الشريط المكسور أثناء قيامه بذلك. يؤدي إكمال تكرار الحمض النووي في موقع النك الأصلي إلى إزاحة كاملة للخيط المكسور ، والذي قد يعاد تدويره بعد ذلك إلى جزيء DNA أحادي الجديلة. يقوم RNA primase بعد ذلك بتوليف التمهيدي لبدء تكرار الحمض النووي في موقع أصل واحد تقطعت بهم السبل (SSO) من جزيء DNA أحادي السلسلة (ssDNA) ، مما ينتج عنه جزيء DNA مزدوج الشريطة (dsDNA) مطابق لجزيء DNA الدائري الآخر.

الشكل 25.1.14 تكرار الدائرة المتداول. تبدأ عملية تكرار الدائرة المتدحرجة بواسطة شق واحد تقطعت به السبل في الحمض النووي. داخل بدائيات النوى ، يتم استخدام DNA polymerase III لتوليد حبلا الابنة. ينضم DNA ligase مرة أخرى إلى النكات في العمود الفقري ويسمح ببدء تخليق الحمض النووي للضفيرة الثانية.

الشكل بواسطة باركر ، ن ، وآخرون. (2019) أوبنستاكس

25.1.4 استنساخ الحمض النووي في حقيقيات النوى

دورة الخلية

ال دورة الخلية هي سلسلة منظمة من الأحداث التي تنطوي على نمو الخلايا وانقسام الخلايا التي تنتج خليتين جديدتين. تمر الخلايا التي تسير على طريق الانقسام الخلوي عبر سلسلة من مراحل النمو المحددة التوقيت بدقة والمنظمة بعناية ، وتكرار الحمض النووي ، والانقسام الذي ينتج خليتين متطابقتين وراثيًا. تتكون دورة الخلية من مرحلتين رئيسيتين: الطور البينيو ال المرحلة الانقسامية (الشكل 25.1.15). أثناء الطور البيني ، تنمو الخلية ويتكرر الحمض النووي. خلال المرحلة الانقسامية ، يتم فصل محتويات الحمض النووي المكرر والسيتوبلازمي وتنقسم الخلية. شاهد هذا الفيديو حول دورة الخلية: http://openstax.org/l/biocellcyc

الشكل 25.1.15 رسم تخطيطي لدورة الخلية. تتحرك الخلية عبر سلسلة من المراحل بطريقة منظمة. خلال الطور البيني ، G1 تتضمن نمو الخلايا وتخليق البروتين ، وتتضمن المرحلة S تكرار الحمض النووي وتكرار الجسيم المركزي ، و G2 ينطوي على مزيد من النمو وتخليق البروتين. المرحلة الانقسامية تتبع الطور البيني. الانقسام الخيطي هو انقسام نووي يتم خلاله فصل الكروموسومات المضاعفة وتوزيعها في نوى ابنة. عادة ما تنقسم الخلية بعد الانقسام الخيطي في عملية تسمى الحركية الخلوية التي ينقسم فيها السيتوبلازم وتتشكل خليتان ابنتان.

الشكل من فاولر ، س ، وآخرون. (2013) أوبنستاكس


أثناء الطور البيني ، تخضع الخلية لعمليات طبيعية أثناء التحضير أيضًا لانقسام الخلية. لكي تنتقل الخلية من الطور البيني إلى الطور الانقسامي ، يجب استيفاء العديد من الشروط الداخلية والخارجية. تسمى المراحل الثلاث من الطور البيني G1و S و G2. المرحلة الأولى من الطور البيني تسمى G1 المرحلة ، أو الفجوة الأولى ، لأن القليل من التغيير مرئي. ومع ذلك ، خلال G1 المرحلة ، الخلية نشطة جدا على المستوى البيوكيميائي. تقوم الخلية بتجميع اللبنات الأساسية للحمض النووي الصبغي والبروتينات المرتبطة به ، بالإضافة إلى تراكم احتياطيات طاقة كافية لإكمال مهمة تكرار كل كروموسوم في النواة. طوال الطور البيني ، يظل الحمض النووي في تكوين كروماتين شبه مكثف. في المرحلة S (مرحلة التوليف) ، ينتج عن تكرار الحمض النووي تكوين نسختين متطابقتين من كل كروموسوم -الكروماتيدات الشقيقة—المرتبطة بقوة في المنطقة المركزية (الشكل 25.1.16B). في هذه المرحلة ، يتكون كل كروموسوم من اثنين من الكروماتيدات الشقيقةوهو كروموسوم مكرر. يتم تكرار الجسيم المركزي خلال المرحلة S. سوف ينتج عن الجسيمين المركزيين المغزل الانقسامي ،الجهاز الذي ينظم حركة الكروموسومات أثناء الانقسام. في الثدييات ، يتكون الجسيم المركزي من زوج من العصي المريكزون بزوايا قائمة لبعضها البعض. تساعد المريكزات في تنظيم انقسام الخلايا. لا توجد المريكزات في الجسيمات المركزية للعديد من الأنواع حقيقية النواة ، مثل النباتات ومعظم الفطريات.

الشكل 25.1.16 هيكل الكروموسوم البشري. (أ) يُظهر مخطط karyogram الطيفي لأنثى بشرية عادية. لدى البشر ما مجموعه 23 زوجًا من الكروموسومات لما مجموعه 46. يشار إلى كل زوج من الكروموسومات باسم صبغيات متشابهة لأنها تحتوي على نسخ من نفس مناطق الجينات. كل من أزواج الكروموسومات المتماثلة ملطخة بنفس اللون. تظهر الكروموسومات في حالتها المكثفة وغير المكررة. (ب) يعرض مخططًا تخطيطيًا لكروموسوم واحد قبل النسخ المتماثل (الرسم البياني السفلي) وبعده (الرسم التخطيطي العلوي). عند التكرار ، يتم استدعاء النسخ المتطابقة من الكروموسوم الكروماتيدات الشقيقة وترتبط معًا في السنترومير بنية.

الشكل (أ) من: المعهد القومي لبحوث الجينوم البشري ، والشكل (ب) من: The School of Biomedical Sciences Wiki


في G2 في المرحلة ، أو الفجوة الثانية ، تقوم الخلية بتجديد مخزونها من الطاقة وتوليف البروتينات اللازمة للتلاعب بالكروموسوم. يتم تكرار بعض عضيات الخلية ، ويتم تفكيك الهيكل الخلوي لتوفير الموارد للمغزل الانقسامي. قد يكون هناك نمو إضافي للخلايا خلال G2. يجب الانتهاء من الاستعدادات النهائية للمرحلة الانقسامية قبل أن تتمكن الخلية من دخول المرحلة الأولى من الانقسام. لصنع خليتين ابنتيتين ، يجب تقسيم محتويات النواة والسيتوبلازم. المرحلة الانقسامية هي عملية متعددة الخطوات يتم خلالها محاذاة الكروموسومات المضاعفة وفصلها ونقلها إلى أقطاب متقابلة للخلية ، ثم يتم تقسيم الخلية إلى خليتين ابنتيتين جديدتين متطابقتين. الجزء الأول من المرحلة الانقسامية ، الانقسام المتساوي، يتكون من خمس مراحل ، والتي تحقق الانقسام النووي. يسمى الجزء الثاني من المرحلة الانقسامية يظهر، هو الفصل المادي للمكونات السيتوبلازمية إلى خليتين ابنتيتين.

إذا لم تكن الخلايا تمر عبر إحدى مراحل الطور البيني أو الانقسام الفتيلي ، فيُقال إنها في G0 أو حالة الراحة. إذا دخلت الخلايا G0 بشكل دائم ، يقال أنهم دخلوا في مرحلة الشيخوخة التكرارية ولن يتم الحفاظ عليها من أجل البقاء على المدى الطويل داخل الكائن الحي.

يتطلب تقدم الخلايا خلال دورة الخلية إجراءات منسقة من كينازات بروتين معينة ، والمعروفة باسم الكينازات المعتمدة على السيكلين. عادةً ما يتم اختصار الكينازات المعتمدة على السيكلين كبروتينات CDK أو CDC. تتطلب بروتينات CDK / CDC ربط بروتين السيكلين التنظيمي ليتم تنشيطه (الشكل 25.1.17). يتم التعبير عن بروتينات السيكلين الرئيسية التي تقود دورة الخلية في الاتجاه الأمامي ، فقط في أوقات منفصلة خلال دورة الخلية. عند تنشيطه بواسطة نظير cyclin ، فإن إنزيمات CDK / CDC فسفوريلات أهداف المصب المتضمنة في تقدم دورة الخلية. على سبيل المثال ، مجمع cyclin-CDK الأساسي الذي يشارك في بدء تكرار الحمض النووي أثناء المرحلة S هو مجمع CyclinE-CDK2. يتم تنشيط CDK2 عن طريق التعبير عن Cyclin E وربطه خلال مرحلة G1 المتأخرة. يتسبب هذا في قيام CDK2 بفوسفوريلات أهداف المصب ، بما في ذلك بروتين مثبط الورم الأرومي الشبكي ، pRb. عادة ما يربط pRB ويثبط نشاط عوامل النسخ من عائلة E2F. بعد إطلاق عوامل نسخ E2F من pRb ، ينشط E2Fs نسخ الجينات المشاركة في تكرار الحمض النووي ويؤدي إلى تقدم الخلايا إلى المرحلة S.

الشكل 25.1.17 كينازات Cyclin التابعة (CDKs) والوحدات الفرعية التنظيمية الخاصة بـ Cyclin. (أ) تظهر مجمعات CDK-cyclin ذات الوظائف المباشرة في تنظيم دورة الخلية. يدفع CDK3 / cyclin C إدخال دورة الخلية من G0. تبدأ مجمعات CDK4 / 6 / cyclin D عملية فسفرة بروتين الورم الأرومي الشبكي (pRb) وتعزز تنشيط مجمع CDK2 / cyclin E. في أواخر G1 ، يكمل مجمع CDK2 / cyclin E الفسفرة وتعطيل pRb ، والذي يطلق عوامل نسخ E2F ويحدث انتقال G1 / S. يحدث تكرار الحمض النووي في المرحلة S. ينظم مجمع CDK2 / cyclin A التقدم خلال المرحلة S و CDK1 / cyclin A خلال المرحلة G2 استعدادًا للانقسام (M). بدأ الانقسام الخيطي بواسطة مجمع CDK1 / cyclin B. (ب) يُظهر الطبيعة الدورية للتعبير السيكلني أثناء تقدم دورة الخلية. يتم تنظيم وفرة Cyclin من خلال التعبير النسخي والتحلل السريع للبروتين. وبالتالي ، يتم استهداف نشاطهم البيولوجي في نقاط زمنية محددة جدًا أثناء تقدم الخلية الخلوية.

الشكل (أ) من: عليم ، إ. ، أرشيسي ، آر جيه. (2015) أمام. الخلية والتنمية 3 (16) والشكل B من: Cyclinexpression_waehrend-Zellzyklus

بدء النسخ المتماثل

يعتبر تنظيم المنشأ ، والمواصفات ، والتفعيل في حقيقيات النوى أكثر تعقيدًا مما هو عليه في الممالك البكتيرية أو البدائية وينحرف بشكل كبير عن النموذج الذي تم إنشاؤه لبدء النسخ المتماثل بدائية النواة. أحجام الجينوم الكبيرة للخلايا حقيقية النواة ، والتي تتراوح من 12 ميجا بت في البوصة س. الخباز رo 3 Gbp في البشر ، يستلزم أن يبدأ تكرار الحمض النووي من عدة مئات (في الخميرة الناشئة) إلى عشرات الآلاف (في البشر) من الأصول لاستكمال تكرار الحمض النووي لجميع الكروموسومات خلال كل دورة خلية (الشكل 25.1.18).

الشكل 25.1.18. عادة ما تكون الكروموسومات حقيقية النواة خطية ، ويحتوي كل منها على أصول متعددة من النسخ المتماثل. الشكل الأيسر هو تمثيل رسومي لأصول eukayotic للتكرار ، بينما الصورة اليمنى هي صورة مجهرية Cryo-electron

الرقم الموجود على الجانب الأيسر من: باركر ، ن. وآخرون. والشكل على الجانب الأيمن من: فريتنسكي ، ب. وبرين ، إن


فيما عدا س.الخباز وما يتصل بها السكاروميكوتين الأنواع ، أصول حقيقية النواة لا تحتوي على عناصر تسلسل الحمض النووي المتوافق عليها ولكن موقعها يتأثر بالإشارات السياقية مثل طوبولوجيا الحمض النووي المحلي ، والسمات الهيكلية للحمض النووي ، وبيئة الكروماتين. ومع ذلك ، لا تزال وظيفة الأصل حقيقية النواة تعتمد على مركب بروتين بادئ محفوظ لتحميل الهليكازات التكاثرية على الحمض النووي خلال المرحلتين المتأخرة M و G1 من دورة الخلية ، وهي خطوة تُعرف باسم ترخيص المنشأ. على عكس نظيراتها البكتيرية ، يتم تحميل الهليكازات التكاثرية في حقيقيات النوى على الحمض النووي المزدوج الأصلي في شكل غير نشط ، سداسي عشري مزدوج ، ويتم تنشيط مجموعة فرعية منها فقط (10-20٪ في خلايا الثدييات) خلال أي مرحلة S معينة ، وهي الأحداث التي يشار إليها باسم أصل إطلاق النار. لذلك يتم تحديد موقع أصول حقيقية النواة النشطة على مستويين مختلفين على الأقل ، ترخيص المنشأ لتمييز جميع الأصول المحتملة ، وإطلاق النار لتحديد مجموعة فرعية تسمح بتجميع آلية النسخ والبدء في تخليق الحمض النووي. تعمل الأصول المرخصة الإضافية كنسخة احتياطية ولا يتم تنشيطها إلا عند إبطاء أو توقف شوكات النسخ المتماثل القريبة ، مما يضمن إمكانية اكتمال تكرار الحمض النووي عندما تواجه الخلايا إجهاد النسخ المتماثل. معًا ، تجسد فائض الأصول المرخصة والتحكم المحكم في دورة الخلية لترخيص المنشأ وإطلاق النار استراتيجيتين مهمتين لمنع التكاثر الناقص والمفرط والحفاظ على سلامة الجينومات حقيقية النواة.

إنزيمات بوليميراز DNA حقيقية النواة

على غرار تكرار الحمض النووي في بدائيات النوى ، يحدث تكرار الحمض النووي في حقيقيات النوى في اتجاهين متعاكسين بين السلاسل الجديدة في شوكة النسخ المتماثل. داخل حقيقيات النوى ، يقوم اثنان من البوليميرات التكرارية بتوليف الحمض النووي في اتجاهات متعارضة (الشكل 25.1.16). بوليميراز ε (إبسيلون)يصنع الحمض النووي بطريقة مستمرة ، لأنه "موجه" في نفس اتجاه فك الحمض النووي. على غرار التكاثر البكتيري ، يُعرف هذا الشريط باسم الساحل الرئيسي. فى المقابل، بوليميراز δ (دلتا) يصنع الحمض النووي على خيط القالب المعاكس بطريقة مجزأة أو متقطعة ويطلق على هذا الخيط اسم حبلا متخلفة. تُعرف الامتدادات المتقطعة لمنتجات تكرار الحمض النووي على الخيط المتأخر باسم شظايا Okazaki ويبلغ طولها حوالي 100 إلى 200 قاعدة في شوكات النسخ المتماثل حقيقية النواة. نظرًا للطبيعة "المتأخرة" ، تحتوي السلسلة المتأخرة عمومًا على امتداد أطول من ssDNA المغلفة ببروتينات ربط أحادية السلسلة ، والتي تعمل على استقرار قوالب ssDNA عن طريق منع تكوين البنية الثانوية أو المعاملات الأخرى في ssDNA المكشوف. في حقيقيات النوى ، يتم الحفاظ على استقرار ssDNA بواسطة المركب غير المتجانسة المعروف باسم بروتين النسخ المتماثل A (RPA) (الشكل 9.19). يسبق كل جزء من أجزاء أوكازاكي مادة أولية من الحمض النووي الريبي ، والتي يتم إزاحتها بواسطة موكب جزء أوكازاكي التالي أثناء التركيب. في الخلايا حقيقية النواة ، يتم أيضًا إزاحة كمية صغيرة من جزء الحمض النووي مباشرة في بداية الطريق التمهيدي للحمض النووي الريبي ، مما يؤدي إلى تكوين هيكل رفرف. يتم بعد ذلك شق هذه السديلة بواسطة نوكليازات داخلية (مثل Fen1 ، تمت مناقشته لاحقًا). في شوكة النسخ ، يتم سد الفجوة في الحمض النووي بعد إزالة السديلة DNA ligase أنا. نظرًا للطبيعة القصيرة نسبيًا لجزء Okazaki حقيقية النواة ، فإن تخليق تكرار الحمض النووي الذي يحدث بشكل متقطع على الخيط المتأخر يكون أقل كفاءة ويستغرق وقتًا أطول من تخليق الخيوط الرائدة.

الشكل 25.1.19 ينسق مركب إعادة الشكل حقيقية النواة تكرار الحمض النووي. يتم إجراء النسخ المتماثل على السلاسل الرائدة والمتأخرة بواسطة Pol و Pol ، على التوالي. العديد من عوامل إعادة التوازن (بما في ذلك FPC [معقد حماية الشوكة] ، Claspin ، And1 ، و RFC [مُحمل المشبك C لعامل النسخ]) مُكلف بتنظيم وظائف البوليميراز وتنسيق تخليق الحمض النووي مع فك حبلا القالب بواسطة Cdc45-MCM [صغير -صيانة الكروموسوم] -GINS [go-ichi-ni-san]. يرتبط الريبليزوم أيضًا ببروتينات نقاط التفتيش مثل تكرار الحمض النووي وآليات مراقبة سلامة الجينوم.

الشكل من: ليمان أ. و Noguchi ، إي. (2013) الجينات 4 (1): 1-32


في شوكة النسخ المتماثل حقيقية النواة ، تساهم ثلاثة مجمعات بوليميراز مكررة متميزة في تكرار الحمض النووي المتعارف عليه: α و δ و. هذه البوليمرات الثلاثة ضرورية لبقاء الخلية. نظرًا لأن بوليميرات الدنا تتطلب أساسًا لبدء تخليق الحمض النووي ، أولاً ، يعمل البوليميراز α (Pol α) بمثابة بريماز مكرر. يرتبط Pol α ببريميز RNA وهذا المركب ينجز مهمة التمهيدي عن طريق تخليق تمهيدي يحتوي على امتداد قصير من RNA ~ 10 نيوكليوتيد متبوعًا بـ 10 إلى 20 قاعدة DNA. الأهم من ذلك ، يحدث هذا الإجراء الأولي عند بدء النسخ المتماثل في الأصول لبدء توليف الخيوط الرائدة وأيضًا عند نهاية 5 بوصات من كل جزء من أجزاء Okazaki على الشريط المتأخر.

ومع ذلك ، فإن Pol α غير قادر على مواصلة تكرار الحمض النووي. من عند في المختبر الدراسات ، لوحظ أن تكرار الحمض النووي يجب "تسليمه" إلى بوليميراز آخر لمواصلة التوليف. يتطلب تحويل البوليميراز لوادر مشابك. في البداية ، كان يُعتقد أن Pol قام بإجراء نسخ متماثل رائد وأن Pol α أكمل كل جزء Okazaki على الشريط المتأخر. باستخدام متغيرات البلمرة الطافرة ورسم خرائط لأحداث التضمين الخاطئ للنيوكليوتيدات ، وجد كونكل وزملاؤه أن طفرات Pol و Pol تؤدي إلى دمج نوكليوتيد غير متطابق فقط في السلاسل الرائدة والمتأخرة ، على التوالي. وبالتالي ، يتطلب تكرار الحمض النووي الطبيعي الإجراءات المنسقة لثلاثة بوليميرات DNA: Pol α لتوليف فتيلة ، Pol لتكرار السلسلة الرائدة ، و Pol لتوليد شظايا Okazaki أثناء تخليق حبلا (الشكل 25.1.16).

في حقيقيات النوى ، يتم تجميع بوليميرات الحمض النووي في سبع عائلات (A و B و C و D و X و Y و RT). تُظهر الهياكل البلورية لبوليميرات الحمض النووي التكراري الثلاثة أنها تنتمي إلى عائلة B (الشكل 25.1.17). جميع بوليمرات الحمض النووي التكراري الثلاثة عبارة عن إنزيمات متعددة الوحدات الفرعية (الجدول 25.1.2)

الجدول 25.1.2 الوحدات الفرعية لبوليميراز الحمض النووي التكراري الرئيسي حقيقية النواة

الجدول من:Doublié، S. and Zahn، K.E. (2014) الجبهة. ميكروبيول 5:444

العودة إلى الصدارة


تتكون جميع بوليميرات عائلة B من خمسة نطاقات فرعية: الأصابع والإبهام وراحة اليد التي تشكل جوهر الإنزيم ، بالإضافة إلى مجال نوكلياز خارجي ومجال N- طرفي (NTD). النخلة ، وهي طية محفوظة بشكل كبير وتتألف من أربعة خيوط متوازنة ولولبتين ، تؤوي اثنين من الأسبارتات التحفيزية المحفوظة بشكل صارم والموجودة في الشكل أ ، دXXLYPS وعزف C ، DTدS (الشكل 25.1.20). تتم مشاركة هذه الطية بواسطة مجموعة كبيرة جدًا من الإنزيمات ، بما في ذلك بوليميراز DNA و RNA ، والنسخ العكسية ، و CRISPR polymerase ، وحتى النقل العكسي (3′ –5 ′). في المقابل ، تُظهر المجالات الفرعية للإبهام والأصابع تنوعًا هيكليًا أكبر بشكل كبير. تخضع الأصابع لتغيير تكوين عند ربط الحمض النووي والنيوكليوتيدات الواردة الصحيحة. تسمح هذه الحركة للبقايا الموجودة في المجال الفرعي للأصابع بالتلامس مع النيوكليوتيدات في زوج القاعدة الناشئ. يحمل الإبهام مزدوج الحمض النووي أثناء النسخ ويلعب دورًا في العملية. يحمل مجال نوكلياز خارجي نشاط تدقيق لغوي من 3 إلى 5 درجات ، والذي يزيل النيوكليوتيدات التي تم دمجها بشكل خاطئ. يبدو أن NTD خالية من النشاط التحفيزي. في pol ، تشتمل NTD على ثلاثة أشكال: أحدها له طوبولوجيا تشبه طية OB ، ومخطط ربط DNA أحادي السلسلة ، وآخر يحمل فكرة ربط RNA (RNA Recognition Motif or RRM). من المحتمل أن تلعب NTD دورًا في استقرار البوليميراز وإخلاصه من خلال تفاعلاتها مع المجالات الأخرى.

الشكل 25.1.20 يتم توضيح المجمعات الثلاثية للبوليميرات α و و ε و RB69 gp43 من اتجاهات متطابقة للمقارنة. يدرك مجالا الإبهام (الأخضر) والأصابع (الأزرق الداكن) الحمض النووي المزدوج (التمهيدي الموضح باللون البيج ، القالب باللون البرتقالي) مقابل مجال النخيل (الأحمر). يظهر المجال الطرفي N باللون الذهبي ، بجوار مجال نوكلياز خارجي 3′ –5 (سماوي). (أ) يربط Polymerase α (PDBID 4FYD) هجينًا من الحمض النووي الريبي / الحمض النووي ، حيث يظهر الأخدود الضحل الواسع من الحمض النووي من النوع A بالقرب من الإبهام. مجال نوكلياز خارجي 3′ –5 خالي من أي نشاط. منطقة حلزونية (أرجوانية) في مجال نوكلياز خارجي غير نشط تستقر في النهاية الخامسة للقالب. (ب) يحتوي البوليميراز δ (PDBID 3IAY) على شكل دبوس شعر كبير (أرجواني) ، وهو أمر مهم في تحويل حبلا التمهيدي من موقع البوليميراز النشط إلى موقع نوكلياز خارجي نشط في حالة التصحيح اللغوي. (ج) يستخدم Polymerase ε (PDBID 4M8O) مجال P فريد (أرجواني) ، والذي يمنح البوليميراز مزيدًا من المعالجة. ومن المثير للاهتمام ، أن شكل β القاسي ضمر في pol. (د) يتضح الحفاظ على طية بوليميراز الحمض النووي للعائلة وتنظيم المجال عند عرض إنزيم النموذج من البكتيريا RB69 gp43 (PDBID 2OZS) جنبًا إلى جنب مع البوليميرات التكاثرية حقيقية النواة الثلاثة. يرد ترسيم المجال لكل بوليميراز في الجدول S1. تم صنع الشكل باستخدام PyMOL (نظام الرسومات الجزيئية PyMOL ، الإصدار 1.5.0.4 Schrödinger ، LLC.)

الشكل من: Doublié، S. Microbiol 5:44


تتطلب بوليميرات الحمض النووي عوامل إضافية لدعم تكرار الحمض النووي في الجسم الحي. تحتوي بوليميرات الحمض النووي على بنية يدوية شبه مغلقة ، مما يسمح لها بالتحميل على الحمض النووي والانتقال. تسمح هذه البنية لبوليميراز الحمض النووي بالاحتفاظ بالقالب المفرد الذي تقطعت به السبل ، ودمج dNTPs في الموقع النشط ، وإطلاق الخيط المزدوج المكون حديثًا. ومع ذلك ، فإن تشكيل بوليميرات الحمض النووي لا يسمح بتفاعلها المستقر مع قالب الحمض النووي. لتقوية التفاعل بين القالب والبوليميراز ، تطورت المشابك المنزلقة للحمض النووي ، مما يعزز قابلية البوليميراز التكراري. في حقيقيات النوى ، هذا المشبك المنزلق عبارة عن مشابك متجانسة معروفة باسم تكاثر مستضد الخلية النووية (PCNA) ، الذي يشكل هيكل الحلقة. حلقة PCNA لها قطبية مع سطح يتفاعل مع بوليميراز الحمض النووي ويربطها بشكل آمن بالحمض النووي. التثبيت المعتمد على PCNA لبوليميرات الحمض النووي له تأثير كبير على تكرار الحمض النووي لأنه يعزز عملية البوليميراز حتى 1000 ضعف (الشكل 25.1.19).

ال دهليكازات NA (بروتينات MCM) ويجب أن تظل البوليميرات أيضًا على اتصال وثيق عند شوكة النسخ المتماثل (الشكل 25.1.19). إذا حدث الفك قبل التوليف بوقت طويل جدًا ، فإن مساحات كبيرة من ssDNA تكون مكشوفة. يمكن أن يؤدي ذلك إلى تنشيط إشارات تلف الحمض النووي أو إحداث عمليات إصلاح شاذة للحمض النووي. لإحباط هذه المشاكل ، تحتوي إعادة التجميد حقيقية النواة على بروتينات متخصصة مصممة لتنظيم نشاط الهليكاز قبل شوكة النسخ. توفر هذه البروتينات أيضًا مواقع الالتحام للتفاعل المادي بين الهليكازات والبوليميراز ، وبالتالي ضمان أن يقترن فك اللف المزدوج بتوليف الحمض النووي.

يمكن أن يكون استخدام الأصل في حقيقيات النوى ديناميكيًا ، حيث يتم إطلاق الأصل في مواقع مختلفة اعتمادًا على نوع الخلية ومرحلة التطور. ومع ذلك ، فإن آلية التجميع المتكرر وإطلاق النار في الأصل محفوظة للغاية. خلال الانقسام المتأخر و G1المرحلة ، بروتينات دورة الخلية ، مثل Cdc6 ، مرتبطة بـ أوري المواقع في جميع أنحاء الجينوم وتجنيد إنزيمات الهليكاز ، مليون متر مكعب 2-7 (الشكل 25.1.21A). في هذا الوقت ، يتم تحميل السداسيات المزدوجة لمركب MCM2-7 عند أصول النسخ المتماثل. هذا يولد أ مجمع ما قبل النسخ المتماثل (قبل RC). تعتبر الأصول ذات ما قبل RC المرتبط مرخصة للنسخ المتماثل. يمكن بعد ذلك "إطلاق" أصول النسخ المتماثل المرخص ، عندما يبدأ النسخ المتماثل فعليًا في أوري. يحدث إطلاق النار في الأصل من خلال أحداث الفسفرة المتعددة التي يتم إجراؤها بواسطة مجمع cyclin E-CDK2 في بداية المرحلة S وبواسطة أخرى كينازات تعتمد على السيكلين (CDKs)قبل إطلاق النار من مصدر فردي (الشكل 25.1.21B). الكينازات المعتمدة على السيكلين (CDKs) هي عائلات كينازات البروتين التي تم اكتشافها لأول مرة لدورها في تنظيم دورة الخلية. كما أنهم يشاركون في تنظيم النسخ ، ومعالجة الرنا المرسال ، وتمايز الخلايا العصبية. يتم تنشيط CDKs من خلال ارتباط بروتين تنظيمي cyclin مرتبط. بدون cyclin ، تُظهر CDK نشاطًا ضئيلًا للكيناز. بعد الفسفرة لما قبل RC ، يحدث ذوبان المنشأ ويولد تفكيك الحمض النووي بواسطة الهليكاز ssDNA ، مما يعرض قالبًا للنسخ المتماثل (الشكل 9.21C). ثم يبدأ الريبليزوم بالتشكل مع توطين العوامل البديلة مثل Cdc45. يبدأ تخليق الحمض النووي على القالب المصهور ، وتنتقل آلية النسخ بعيدًا عن الأصل بطريقة ثنائية الاتجاه.

يحمل الشكل 25.1.21 MCM2-7 على الحمض النووي في أصول النسخ المتماثل خلال G1 ويفك الحمض النووي قبل البوليمرات التكرارية. (أ) تجلب الأنشطة المدمجة لـ Cdc6 و Cdt1 مجمعات MCM (تظهر كدوائر زرقاء ذات ظلال مختلفة) إلى أصول النسخ المتماثل. (ب) تؤدي عملية الفسفرة المعتمدة على CDK / DDK لمكونات ما قبل RC إلى إعادة التجميع وإطلاق النار الأصلي. لم تعد هناك حاجة إلى Cdc6 و Cdt1 وتتم إزالتهما من النواة أو تدهورهما (ج) MCMs والبروتينات المرتبطة بها (يظهر GINS و Cdc45) فك الحمض النووي لفضح الحمض النووي للقالب. في هذه المرحلة يمكن إكمال التجميع البديل وبدء النسخ المتماثل. تشير "P" إلى الفسفرة.

الشكل من: ليمان أ. (2013) الجينات 4 (1): 1-32

النسخ المتماثل من خلال النيوكليوسومات

تعتبر جينومات حقيقيات النوى أكثر تعقيدًا بشكل كبير من جينومات بدائية النواة الأصغر وغير المزخرفة. تحتوي الخلايا حقيقية النواة على العديد من مكونات الحمض النووي غير المتجاورة ، الكروموسومات ، يجب ضغط كل منها للسماح بالتعبئة داخل المساحة الضيقة للنواة. كما رأينا في الفصل 4 ، يتم تغليف الكروموسومات بلف حوالي 147 نيوكليوتيد (على فترات متوسطها 200 نيوكليوتيد) حول ثماني من بروتينات هيستون ، مما يشكل نووي. يشتمل أوكتامر هيستون على نسختين من هيستون H2A و H2B و H3 و H4. في الفصل 8 ، تم تسليط الضوء على أن بروتينات هيستون تخضع لمجموعة متنوعة من التعديلات اللاحقة للترجمة ، بما في ذلك الفسفرة ، والأسيتيل ، والمثيلة ، والتواجد في كل مكان والتي تمثل العلامات اللاجينية الحيوية. يشير الارتباط الوثيق بين بروتينات الهيستون والحمض النووي في النيوكليوسومات إلى أن الخلايا حقيقية النواة تمتلك بروتينات مصممة لإعادة تشكيل الهيستونات قبل شوكة النسخ ، من أجل السماح بالتقدم السلس للريبليزوم. من الضروري أيضًا إعادة تجميع الهستونات خلف الشوكة لإعادة إنشاء التشكل النووي. علاوة على ذلك ، من المهم نقل المعلومات اللاجينية الموجودة في النيوكليوسومات الأبوية إلى نيوكليوسومات الابنة ، من أجل الحفاظ على نفس حالة الكروماتين. بمعنى آخر ، يجب أن تكون تعديلات هيستون نفسها موجودة على نيوكليوسومات الابنة كما كانت في نيوكليوسومات الوالدين. يجب أن يتم كل هذا مع مضاعفة كمية الكروماتين ، الأمر الذي يتطلب دمج بروتينات هيستون المركبة حديثًا. يتم إنجاز هذه العملية بواسطة المرافقون هيستون و معيد تشكيل هيستون، والتي تمت مناقشتها أدناه (الشكل 25.1.22).

الشكل 25.1.22 إزاحة وترسيب النيوكليوسوم أثناء تكرار الحمض النووي. تتم إزالة الهستونات من الكروماتين قبل شوكة النسخ المتماثل. قد يسهل FACT هذه العملية. يقوم Asf1 بتجنيد ثنائيات هيستون H3-H4 لشوكة النسخ المتماثل. يقوم CAF-1 و Rtt106 بتحميل هيستونات مركبة حديثًا (أرجواني فاتح) لإنشاء كروماتين خلف الشوكة. يتم أيضًا ترسيب الهستونات المحملة مسبقًا (الأرجواني الداكن) على خيوط DNA الابنة. ترتبط مرافقات هيستون المشاركة في هذه العمليات ببروتينات ريبليزوم: CAF-1 / Rtt106 مع PCNA و FACT / Asf1 مع MCMs.

الشكل من: ليمان أ. (2013) الجينات 4 (1): 1-32


من المعروف أن العديد من مرافقي هيستون متورطون في تجميع النوكليوسوم المقترن بالنسخ المتماثل ، بما في ذلك مجمع FACT. ال مجمع FACT تم تحديد المكونات في الأصل على أنها بروتينات تحفز بشكل كبير النسخ بواسطة RNA polymerase II. في الخميرة الناشئة ، وجد أن FACT تتفاعل مع مركب DNA Pol α-primase ، ووجد أن الوحدات الفرعية FACT تتفاعل وراثيًا مع عوامل النسخ المتماثل. في الآونة الأخيرة ، أظهرت الدراسات أن تقنية FACT تسهل تكرار الحمض النووي في الجسم الحي ويرتبط مع إعادة التوازن في الخميرة الناشئة والخلايا البشرية. معقد FACT هو مغاير لا يحلل ATP مائيًا ، ولكنه يسهل "فك" الهستونات في النيوكليوسومات

حواجز شوكة النسخ المتماثل وإنهاء النسخ المتماثل

في بدائيات النوى ، مثل بكتريا قولونية، يبدأ النسخ المتماثل ثنائي الاتجاه في أصل تكرار واحد على الكروموسوم الدائري وينتهي في موقع تقريبًا مقابل الأصل. تحتوي منطقة فاصل النسخ المتماثل هذه على تسلسلات DNA المعروفة باسم تير مواقع ، نهايات النسخ المتماثل القطبية المرتبطة ببروتين Tus. ال تير- يتعارض مجمع Tus مع نشاط الهليكاز ، مما يؤدي إلى إنهاء النسخ المتماثل. بهذه الطريقة ، تتوقف شوكات النسخ المتماثل بدائية النواة مؤقتًا وتنتهي بطريقة يمكن التنبؤ بها خلال كل جولة من تكرار الحمض النووي.

في حقيقيات النوى ، يختلف الوضع. يحدث إنهاء النسخ المتماثل عادةً عن طريق تصادم اثنين من تفرعات النسخ المتماثل في أي مكان بين أصلي النسخ المتماثل النشطين. يمكن أن يختلف موقع الاصطدام بناءً على معدل النسخ المتماثل لكل من الشوكات وتوقيت إطلاق النار الأصلي. في كثير من الأحيان ، إذا توقفت شوكة النسخ المتماثل أو انهارت في موقع معين ، فيمكن إنقاذ النسخ المتماثل للموقع عندما تكتمل عملية إعادة الانتقال في الاتجاه المعاكس من نسخ المنطقة. ومع ذلك ، هناك العديد من المبرمجة حواجز شوكة النسخ (RFBs) و "تحديات" التكرار في جميع أنحاء الجينوم. لإنهاء شوكات النسخ المتماثل بكفاءة أو إيقافها مؤقتًا ، ترتبط بعض حواجز الشوكة ببروتينات RFB بطريقة مشابهة لـ بكتريا قولونية طوس. في هذه الظروف ، يجب أن تتفاعل بروتينات الريبليزوم وبروتينات RFB على وجه التحديد لوقف تقدم شوكة النسخ المتماثل.

25.1.5 تكرار الحمض النووي للميتوكوندريا

تحتوي الميتوكوندريا الثديية على نسخ متعددة من جينوم DNA دائري مزدوج الشريطة يبلغ طوله حوالي 16.6 كيلو بايت (الشكل 25.1.23). يختلف خيطي mtDNA في تكوينهما الأساسي ، حيث يكون أحدهما غنيًا بالجوانين ، مما يجعل من الممكن فصل خيط ثقيل (H) وخفيف (L) عن طريق الطرد المركزي الكثافة. منطقة غير مشفرة (NCR) يشار إليها أيضًا باسم منطقة التحكم. في NCR ، هناك مروّجات للنسخ متعدد الخلايا ، واحد لكل خيط mtDNA ؛ مروج الخيوط الخفيفة (LSP) ومحفز الخيوط الثقيلة (HSP). يحتوي NCR أيضًا على أصل تكرار الحمض النووي H-strand (Oح). أصل ثانٍ لتكرار الحمض النووي L-strand (Oإل) خارج NCR ، داخل كتلة الحمض النووي الريبي.

الشكل 25.1.23 خريطة mtDNA البشري. يشفر الجينوم لـ 13 mRNA (أخضر) و 22 tRNA (بنفسجي) و 2 جزيء rRNA (أزرق شاحب). توجد أيضًا منطقة رئيسية غير مشفرة (NCR) ، والتي تظهر مكبرة في الجزء العلوي باللون الأزرق. يحتوي NCR الرئيسي على مروج حبلا ثقيل (HSP) ، ومروج حبلا خفيف (LSP) ، وثلاثة مربعات تسلسل محفوظة (CSB1-3 ، برتقالي) ، أصل H-strand للنسخ المتماثل (Oح) ، والتسلسل المرتبط بالإنهاء (TAS ، أصفر). يتكون هيكل حلقة الإزاحة الثلاثية (D-loop) من الإنهاء المبكر لتخليق الحمض النووي H-strand الوليد في TAS. يُطلق على منتج النسخ المتماثل القصير H-strand المتشكل بهذه الطريقة اسم 7S DNA. NCR ثانوي ، يقع حوالي 11000 نقطة أساس في اتجاه المصب من Oح، يحتوي على أصل L-strand للنسخ المتماثل (Oإل).

الشكل من: Falkenberg، M. (2018) مقالات Biochem 62(3):287-296


يلزم وجود آلية مخصصة لتكرار الحمض النووي لصيانتها. يتم نسخ mtDNA للثدييات بواسطة بروتينات متميزة عن تلك المستخدمة في تكرار الحمض النووي النووي والعديد منها مرتبط بعوامل النسخ التي تم تحديدها في العاثيات. إن إنزيم DNA polymerase (POLγ) هو بوليميراز مكرر في الميتوكوندريا. في الخلايا البشرية ، يعتبر POLγ عبارة عن وحدة غير متجانسة مع وحدة فرعية تحفيزية واحدة (POLγA) ووحدتين فرعيتين ملحقة (POLγB). ينتمي POLγA إلى عائلة A من بوليميرات الحمض النووي ويحتوي على مجال نوكلياز خارجي مكون من 3 إلى 5 درجات يعمل على تصحيح خيط DNA المركب حديثًا. POLγ هو بوليميراز DNA عالي الدقة مع تكرار سوء التضمين أقل من 1 × 10−6. تعزز الوحدة الفرعية الملحقة POLγB التفاعلات مع قالب DNA وتزيد من النشاط التحفيزي والتجهيزية لـ POLγA. تنتقل مروحية DNA TWINKLE أمام POLγ ، لتقوم بفك قالب الحمض النووي المزدوج الشريطة. تشكل TWINKLE شكلًا سداسيًا وتتطلب بنية شوكة (موقع تحميل أحادي الجديلة 5′-DNA وذيل قصير 3′) للتحميل وبدء الفك. يرتبط بروتين ربط الحمض النووي أحادي السلسلة (mtSSB) بالميتوكوندريا بـ ssDNA المتشكل ، ويحميها من نوكليازات ، ويمنع تكوين البنية الثانوية

النموذج الأكثر قبولًا لتكرار الحمض النووي في الميتوكوندريا هو نموذج الإزاحة حبلا (الشكل 25.1.24). ضمن هذا النموذج ، يكون تخليق الحمض النووي مستمرًا على كل من H- و L- حبلا. هناك أصل مخصص لكل خصلة ياح و Oإل. أولاً ، يتم بدء النسخ المتماثل في Oح ثم يشرع تصنيع الحمض النووي لإنتاج حبلا H جديد. خلال المرحلة الأولية ، لا يوجد توليف L-strand متزامن ويغطي mtSSB النازحين ، الأبوين H-strand. من خلال الارتباط بالحمض النووي أحادي الجديلة ، يمنع mtSSB بوليميريز الحمض النووي الريبي الميتوكوندري (POLRMT) من بدء تخليق RNA عشوائي على الشريط النازحين. عندما تتقدم شوكة النسخ حوالي ثلثي الجينوم ، فإنها تمر من الأصل الثاني للنسخ المتماثل ، Oإل. عند تعرضها في شكلها الأحادي ، فإن الأبوية H-strand في Oإل تطوي في هيكل حلقة جذعية. يمنع الجذع بكفاءة mtSSB من الارتباط ويظل امتداد قصير من الحمض النووي أحادي السلسلة في منطقة الحلقة متاحًا ، مما يسمح لـ POLRMT ببدء تخليق الحمض النووي الريبي. POLRMT ليس معالجًا في قوالب الحمض النووي أحادية السلسلة. بعد إضافة ما يقرب من 25 نيوكليوتيد ، يتم استبداله بـ POLγ و L-strand DNA توليف. من هذه النقطة ، يستمر توليف H- و L-strand باستمرار حتى يصل الخيوط إلى دائرة كاملة. يرتبط تكرار الخيطين ، نظرًا لأن تركيب H-strand مطلوب لبدء توليف L-strand. يستخدم DNA Ligase III لإكمال ربط خيوط DNA المشكلة حديثًا.

أثناء تكرار الحمض النووي ، يظل الجزيء الأبوي سليمًا ، مما يشكل مشكلة فلكية لآلية النسخ المتماثل المتحركة. يمكن لمصابيح Topoisomerases التي تنتمي إلى عائلة النوع 1 أن تخفف الإجهاد الالتوائي المتشكل بهذه الطريقة ، عن طريق السماح لأحد الخيوط بالمرور عبر الآخر. في الميتوكوندريا في الثدييات ، يمكن أن يعمل إنزيم TOP1MT من النوع IB بمثابة "قطب" للحمض النووي ، يعمل جنبًا إلى جنب مع تعويض الميتوكوندريا. علاوة على ذلك ، غالبًا ما يتسبب تكرار الحمض النووي الدائري في تكوين الكاتينانات ، أو الدوائر المتشابكة التي يجب فصلها عن بعضها البعض. مطلوب نوع 1A topoisomerase ، topoisomerase 3α (Top3α) ، لحل بنية الهيميكاتينان التي يمكن أن تتشكل أثناء تكرار mtDNA.

الشكل 25.1.24 تكرار جينوم الميتوكوندريا البشري. يبدأ تكرار الحمض النووي للميتوكوندريا في Oح ويستمر بشكل أحادي الاتجاه لإنتاج H-strand الوليدة بطول كامل. يربط mtSSB ويحمي حبلا H الأبوية المكشوفة. عندما يمر الاعادة Oإل، يتم تشكيل بنية حلقة جذعية تمنع ربط mtSSB ، مما يؤدي إلى منطقة حلقة مفردة الجديلة يمكن لـ POLRMT من خلالها بدء تخليق التمهيدي. يحدث الانتقال إلى تخليق L-strand DNA بعد حوالي 25 nt ، عندما يحل POLγ محل POLRMT في الطرف 3′ من التمهيدي. يتواصل تركيب الخيطين بطريقة مستمرة حتى يتم تكوين جزيئين كاملين من الحمض النووي مزدوج الشريطة.

الشكل من: Falkenberg، M. (2018) مقالات Biochem 62(3):287-296


من الغريب أنه لم يتم بدء جميع أحداث النسخ المتماثل في Oح الاستمرار في الدائرة الكاملة. بدلاً من ذلك ، يتم إنهاء 95٪ بعد حوالي 650 نيوكليوتيد في تسلسل يُعرف باسم التسلسلات المرتبطة بالإنهاء (TAS) (الشكل 25.1.23). يؤدي هذا إلى إنشاء جزء قصير من الحمض النووي يُعرف باسم 7S DNA ، والذي يظل مرتبطًا بـ L-strand الأبوي ، بينما يتم إزاحة خيط H الأبوي (الشكل 25.1.23). نتيجة لذلك ، تقطعت بهم السبل الثلاثي هيكل حلقة الإزاحة ، حلقة D ، لقد تكون. الأهمية الوظيفية لهيكل الحلقة D غير واضحة ، كما أن كيفية إنهاء النسخ المتماثل في TAS غير معروفة.

25.1.6 التيلوميرات والشيخوخة المتماثلة

مشكلة إنهاء النسخ المتماثل

في البشر، التيلوميراتيتكون من مئات إلى آلاف التسلسلات المتكررة من TTAGGG عند النهايات الصبغية للحفاظ على السلامة الجينية. نظرًا لأن تكرار الحمض النووي غير متماثل على طول الخيوط المزدوجة ، لا يمكن استبدال تسلسل pimer RNA عند نهاية 3′-hydroxyl بـ DNA polymerase I ، حيث لا توجد مجموعة بادئة 3'-OH موجودة للبوليميراز لتمديد سلسلة DNA. يتسبب هذا في فقدان 30-200 نيوكليوتيد مع كل تكرار للحمض النووي وانقسام الخلية ويعرف باسم مشكلة نهاية النسخ المتماثل. التيلوميرات توفير تسلسل متكرر غير مشفر للحمض النووي في الطرف الثالث لمنع فقدان المعلومات المشفرة وراثيًا أثناء النسخ المتماثل. علاوة على ذلك ، فإن التيلوميرات مغلفة بمركب مكون من ستة بروتينات متدرجة ، تُعرف أيضًا باسم بروتينات المأوى، والتي تم تعبئتها في شكل مضغوط هيكل T- حلقةالذي يخفي نهايات الكروموسومات. هذا يمنع آلية إصلاح الحمض النووي من الخلط بين نهايات الكروموسومات لكسر الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل (الشكل 25.1.25). لذلك ، تم اقتراح التيلوميرات على أنها الساعة الانقساميةيقيس عدد المرات التي انقسمت فيها الخلية ، وفي جوهرها ، يعطي الخلية عمرًا محددًا.

الشكل 25.1.25 هيكل التيلومير. (أ) تقع التيلوميرات في نهاية الكروموسومات ، حيث تساعد في الحماية من فقدان الحمض النووي أثناء التكاثر. (ب) رباعي الدنا يتكون من تكرارات التيلومير. يختلف التشكل الحلقي للعمود الفقري للحمض النووي اختلافًا كبيرًا عن الحلزون النموذجي للحمض النووي ، ويعرف هذا باسم تشكيل T- حلقة. تمثل الكرات الخضراء في المركز أيونات البوتاسيوم.

صورة (أ) بواسطة: MBInfo والصورة (B) بواسطة: توماس سبلتسويسر


الانسان إنزيم التيلوميراز هي المسؤولة عن الحفاظ على التيلوميرات وإطالةها وتتكون من مكون الحمض النووي الريبي (TERC) و أ النسخ العكسي (TERT)، الذي يعمل كمكون محفز (الشكل 25.1.26). ال تيرت يستخدم TERC كقالب لتجميع تكرارات الحمض النووي التيلومري الجديد في عبء أحادي الخيط للحفاظ على طول التيلومير (الشكل 25.1.26). بعض الخلايا مثل الخلايا الجرثومية والخلايا الجذعية والخلايا السلفية المكونة للدم والخلايا الليمفاوية المنشطة ومعظم الخلايا السرطانية تعبر بشكل أساسي عن التيلوميراز وتحافظ على نشاط التيلوميراز للتغلب على تقصير التيلومير والشيخوخة الخلوية. ومع ذلك ، فإن معظم الخلايا الجسدية الأخرى لديها بشكل عام مستوى منخفض أو غير قابل للكشف من نشاط التيلوميراز وطول العمر المحدود. ومن المثير للاهتمام ، أن نشاط الإنزيم تيلوميراز الكلي يتناقص مع تقدم العمر ، ولكنه يزداد بشكل ملحوظ استجابة للإصابة ، مما يشير إلى دور التيلوميراز في التجدد الخلوي أثناء التئام الجروح. يتم تنظيم طول التيلومير وسلامته من خلال التفاعل بين تيلوميراز و بروتينات المأوى.

شكل 25.1.26 نموذج مفاهيمي لنشاط التيلوميراز. يحتوي الموقع النشط لإنزيم التيلوميراز على قالب RNA ، TERC (يظهر باللون الأحمر) ويتوافق مع القواعد التيلوميرية القليلة الأخيرة في نهاية الكروموسوم (كما هو موضح باللون الأزرق). يؤدي هذا إلى إنشاء تراكب واحد تقطعت به السبل يمكن استخدامه كقالب بواسطة النسخ العكسي لـ TERT لتوسيع تسلسل التيلومير.

الشكل من قبل: Abbexa Ltd.


في الجسم الحي ، يُفترض عادةً أن التيلوميرات القصيرة والتيلوميرات التالفة الناتجة عن أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) هي العلامات الرئيسية لشيخوخة الخلايا ويُعتقد أنها السبب الرئيسي الشيخوخة التكرارية. أنان المختبر، تفقد التيلوميرات حوالي 50-200 نقطة أساس عند كل قسم بسبب مشكلة النسخ المتماثل النهائي. يُعتقد أن ما يقرب من 100 من التخفيفات كافية للوصول إلى حد Hayflick، أو الحد الأقصى لعدد الأحداث الانقسامية المسموح بها قبل دخول الشيخوخة التكرارية.الخلايا في التجديد المستمر ، مثل خلايا الدم ، تعوض تآكل التيلومير عن طريق التعبير عن التيلوميراز ، وهو الإنزيم الوحيد القادر على بلمرة متواليات التيلومير من جديد في أقصى التيلوميرات. يؤدي التخلص من مكونات الإنزيم تيلوميراز ، مثل الوحدة الفرعية التحفيزية (TERT) أو قالب الحمض النووي الريبي (TERC) ، إلى تحفيز العديد من ميزات الشيخوخة في الفئران. في البشر ، تكون طفرات السلالة الجرثومية في وحدات التيلوميراز الفرعية مسؤولة عن متلازمات التقدم ، مثل خلل التقرن الخلقي ، وهو شكل وراثي نادر لفشل نخاع العظم. علاوة على ذلك ، يرتبط العمر الصحي عند البشر ارتباطًا إيجابيًا بطول التيلومير الأطول والمرضى الذين يعانون من الأمراض المرتبطة بالعمر والشيخوخة المبكرة لديهم تيلوميرات أقصر مقارنة بالأفراد الأصحاء. وقد ثبت أيضًا أن تراكم الضرر غير المُصلح داخل مناطق التيلومير يتراكم في الفئران المسنة والرئيسيات غير البشرية ، مما يشير إلى أن تلف التيلوميرات مع تقدم العمر قد يساهم أيضًا في حالات المرض المدفوعة بالعمر وتقليل المدة الصحية.

وبالتالي ، يمكن للمرء أن يجادل في أن تنشيط التيلوميراز والتعبير عنه قد يكون وسيلة لتقليل الأمراض المرتبطة بالعمر وزيادة طول العمر الكلي. ومع ذلك ، فإن التعبير التكويني للإنزيم تيلوميراز ، للأسف ، هو سمة من سمات جميع الخلايا السرطانية تقريبًا. لذلك ليس من المستغرب أن الحيوانات المعدلة وراثيا تفرط في التعبير عن الوحدة الفرعية التحفيزية للإنزيم تيلوميراز (mTERT) ، وتطور السرطانات في وقت مبكر من الحياة. ومع ذلك ، فقد أظهر الإفراط في التعبير عن الإنزيم تيلوميراز في الفئران شديدة المقاومة للسرطانات زيادات كبيرة في متوسط ​​العمر وانخفاض كبير في الاضطرابات المرتبطة بالعمر. نظرًا لأن البشر لا يتمتعون بمقاومة عالية للسرطان ، فإن هذا ليس خيارًا ممكنًا للبشر. ومع ذلك ، فإن الدراسات الإضافية التي أجريت على الفئران ، حيث تم إدخال التعبير التأسيسي للإنزيم تيلوميراز فقط في نسبة صغيرة من الخلايا المضيفة باستخدام تقنيات العلاج الجيني للفيروس الغدي ، قد أسفرت عن نتائج واعدة أكثر. Adenoviruses هي مجموعة من الفيروسات التي تشكل قفيصة بروتينية عشرونية الوجوه تحتوي على جينوم DNA مزدوج الخطي تقطعت به السبل. عادة ما تسبب العدوى التي تصيب البشر أعراض نزلات البرد وعادة ما تكون خفيفة في طبيعتها. هذه هدف جيد للعلاج الجيني ، حيث يمكن أن يتحول الحمض النووي الذي تحمله ، بحيث تكون ناقصة في قدرتها على التكاثر بمجرد إصابة المضيف. يمكن أيضًا تحويلها لتحمل الجين المهم إلى المضيف ، حيث يمكن لهذا الجين بعد ذلك الاندماج في جينوم المضيف. أظهرت التجارب التي أُجريت على الفئران المصابة بفيروس غدي يحمل الجين mTERT أن mTERT تم توصيله إلى مجموعة واسعة من الأنسجة داخل الجسم ، وزاد من طول التيلومير داخل تلك الأنسجة. علاوة على ذلك ، كانت الفئران التي تعبر عن mTERT أكثر صحة من زملائها في القمامة وأظهرت انخفاضًا في حالات الإعاقة المرتبطة بالشيخوخة الفسيولوجية مثل هشاشة العظام ومقاومة الأنسولين (الشكل 25.1.27). كما تم تحسين المهارات المعرفية ووظائف التمثيل الغذائي. بشكل ملحوظ ، الفئران التي عولجت بالعلاج الجيني لم يكن لديها زيادة في معدلات الإصابة بالسرطان ، مما يشير إلى أنه في أنواع الفئران قصيرة العمر على الأقل ، فإن نهج العلاج الجيني لزيادة نشاط التيلوميراز آمن. وزاد متوسط ​​العمر داخل هذه الحيوانات بنسبة 24٪ عندما عولجت الحيوانات في عمر سنة واحدة ، وبنسبة 13٪ إذا عولجت في عمر سنتين.

الشكل 25.1.27 تعزيز هيلثسبان في الفئران باستخدام العلاج الجيني تيلوميراز. يؤدي توصيل الوحدة الفرعية التحفيزية للتيلوميراز (TERT) باستخدام ناقل الفيروس الغدي المعدل (rAAV) إلى قمع تآكل التيلومير المرتبط بالشيخوخة ويمتد التيلوميرات القصيرة في مجموعة متنوعة من الأنسجة. وبالتالي ، فإن الحيوانات تظهر تحسنًا صحيًا وعمرًا ممتدًا.

الشكل من: Boccardi، V. and Herbig، U. (2012) EMBO Mol Med 4: 685-687.


النسخ المتماثل وإصلاح متواليات التيلومير

بالإضافة إلى مشكلة النسخ المتماثل النهائي ، يعد تكرار وإصلاح الحمض النووي التيلومري (telDNA) تحديًا حقيقيًا بسبب السمات الهيكلية المختلفة للتيلوميرات. أولاً ، يتكون التسلسل النووي نفسه من شكل سداسي النواة (TTAGGG) يتكرر على قاعدتين ، مع حبلا 5′-3 يسمى "G-strand" نظرًا لمحتواه العالي في الجوانين. أثناء تقدم شوكة النسخ المتماثل ، تشكل الخيوط المتأخرة ، المقابلة لـ G-strand ، هياكل G-quadruplex (G4) ، والتي يجب حلها للسماح بتقدم الشوكة وإكمال النسخ المتماثل (الشكل 25.1.28a). ثانيًا ، يجب أيضًا فصل حلقات R المتوافقة مع RNA عالي الاستقرار: هجينة DNA ، والتي تتضمن نسخة تيلوميرية طويلة غير مشفرة TERRA (RNA تحتوي على تكرارات تيلوميرية). ثالثًا ، يتبنى طرف التيلوميرات بنية حلقة محددة ، الحلقة T ، والتي يجب تفكيكها. هذه هي الحلقة التي تخفي نهاية الخيط المزدوج من مستشعرات تلف الحمض النووي ، ويتم قفلها بواسطة تهجين الطرف المتدلي المفرد 3 مع الخيط أعلاه 3′-5 ، وبالتالي إزاحة الشريط المقابل 5′-3 لتشكيل بنية D- حلقة (حلقة الإزاحة) (الشكل 25.1.28a). أخيرًا ، يجب أن يتعامل النسخ المتماثل أيضًا مع الحواجز التي تمت مواجهتها في أماكن أخرى من الجينوم ، مثل الالتواءات والبيئة المتغايرة اللون.

الشكل 25.1.28 عوائق وحلول لتكرار التيلوميرات. (أ) تم تصوير تسلسل Telomeric ، مع G-strand بخط أحمر متصل و C-strand بخط أخضر صلب. يتم تثبيت الحلقة الطرفية D التي تشكل حلقة T الأكبر بكثير بواسطة مجمع المأوى. يعمل الريبليزوم (PCNA ، pol ، إلخ) على بلمرة G-strand جديد (كما هو موضح في خط أحمر منقط) ويحرر G-strand الأبوي ، مما يتيح تكوين البنية الثانوية G4. حلقات R المطابقة لتهجين TERRA (بخطوط سوداء منقطة) مع حبلا 3'-5 '، كما تظهر الالتواءات بسبب تقدم الشوكة. (ب) يتم تصوير مساعدي النسخ المتماثل ، مثل طائرات الهليكوبتر ، إما للمساعدة في فك G4 أو في فتح حلقة D. تساعد الحمض النووي (Top2a ، DNA2) و RNAses (RNAse H1 و FEN1) في حل الالتواءات و RNA: DNA heteroduplexes ، بينما يحفز Timeless المتغير و POT1 يتنافس مع RPA1 لربط الخيط الفردي ويساعد في حل G4. تساعد مكونات المأوى ، POT1 و TRF1 و TRF2 في تحميل البروتينات المساعدة (الأسهم الخضراء الدقيقة)

الشكل من: Billiard، P. and Poncet، D.A. (2019) Int J. Mol. علوم. 20 (19) 4959


نظرًا لأن التيلوميرات تواجه مجموعة من العقبات التي تحول دون إكمال عملية النسخ المتماثل ، كما هو موضح في الشكل 25.1.28 ، تمتلك الخلية مجموعة من الآليات المتخصصة لتحقيق تكاثرها بشكل كامل ، مثل البروتينات RTEL1 و TRF1 و TRF2 والحمض النووي DNA و RNAsses و وخالدة. يتم تنظيم تجنيد هذه العوامل من قبل مجمع المأوى.

على المستوى الجزيئي ، تكون التكرارات التيلوميرية GGG حساسة بشكل خاص لـ ROS ، والتي تنتج امتدادات من 8-oxoguanine يصعب إصلاحها بشكل خاص. إلى جانب إصلاح التيلومير غير الفعال ، تنتج هذه الآفات التي يسببها ROS فواصل مفردة ومزدوجة ، و / أو تولد إجهادًا متكررًا ، مما يؤدي في النهاية إلى تقصير التيلومير. إن وجود 8-oxoguanine مفرد أو ترادفي غير مُصلح يثبط بشكل كبير ارتباط TRF1 و TRF2 ، ويضعف تجنيد الإنزيم تيلوميراز ، خاصةً عندما يكون تلف ROS موضعيًا في 3 المتراكمة. يساهم هذا النوع من الضرر في تقصير وتقليل التيلومير. اللافت للنظر أن ROS (والضغوط الأيضية الأخرى) تحفز أيضًا على نقل TERT إلى الميتوكوندريا ، كما لوحظ (1) في الخلايا العصبية الأولية بعد الإجهاد التأكسدي ؛ (2) في الخلايا العصبية المعرضة لبروتين تاو ؛ (3) في الخلايا العصبية بوركينجي المعرضة للإثارة السمية ؛ و (4) في سلالات الخلايا السرطانية المعالجة برباط G4. يزيد TERT الميتوكوندريا من إمكانات الغشاء الداخلي ، وكذلك عدد نسخ mtDNA ، ويقلل من إنتاج ROS مع تأثير وقائي على mtDNA. الميتوكوندريا هي أيضًا أجهزة استشعار مهمة للضرر الخلوي وتساهم في عمليات الالتهام الذاتي وموت الخلايا المبرمج (موت الخلية المبرمج). قد يشير إعادة تحديد موقع TERT بعد تلف الكروموسومات في النواة إلى آلية واحدة تستخدمها الميتوكوندريا لمراقبة الإجهاد والتلف الخلوي.

العودة إلى الصدارة

إتقان المحتوى

أي مما يلي هو الإنزيم الذي يحل محل نيوكليوتيدات الحمض النووي الريبي في مادة أولية بنيوكليوتيدات الحمض النووي؟

  1. بوليميريز الحمض النووي الثالث
  2. بوليميريز الحمض النووي أنا
  3. بريماز
  4. هيليكس

[تكشف-الإجابة q = ”628075 ″] إظهار الإجابة [/ تكشف-الإجابة]
[إجابة مخفية أ = ”628075 ″] الجواب ب. بوليميراز الحمض النووي 1 هو الإنزيم الذي يحل محل نيوكليوتيدات الحمض النووي الريبي في مادة أولية مع نيوكليوتيدات الحمض النووي. [/ hidden-answer]

أي مما يلي لا يشارك في بدء النسخ المتماثل؟

  1. يجاز
  2. جريز الحمض النووي
  3. بروتين ملزم واحد تقطعت به السبل
  4. بريماز

[تكشف-الإجابة q = ”820951 ″] إظهار الإجابة [/ تكشف-الإجابة]
[hidden-answer a = ”820951 ″] أجب أ. لا يشارك Ligase في بدء النسخ المتماثل. [/ hidden-answer]

أي من الإنزيمات التالية المشاركة في تكرار الحمض النووي تنفرد به حقيقيات النوى؟

  1. هيليكس
  2. بوليميريز الحمض النووي
  3. يجاز
  4. تيلوميراز

[إظهار الإجابة q = ”650146 ″] إظهار الإجابة [/ إظهار الإجابة]
[إجابة مخفية أ = ”650146 ″] الإجابة د. تيلوميراز فريد من نوعه لحقيقيات النوى. [/ hidden-answer]

أي مما يلي سيتم تصنيعه باستخدام 5′-CAGTTCGGA-3 كقالب؟

  1. 3′-أجكتجاك -4 ′
  2. 3′-تكجاكتج -5 ′
  3. 3′-GTCAAGCCT-5 ′
  4. 3′-CAGTTCGGA-5 ′

[تكشف-الإجابة q = ”429167 ″] إظهار الإجابة [/ تكشف-الإجابة]
[إجابة مخفية أ = ”429167 ″] إجابة ج. 3′-GTCAAGCCT-5 ′ [/ hidden-answer]

يسمى الإنزيم المسؤول عن استرخاء الحمض النووي الفائق الالتفاف للسماح ببدء النسخ المتماثل ________.
[تكشف-إجابة q = ”855893 ″] إظهار الإجابة [/ تكشف-إجابة]
[hidden-answer a = "855893 ″] يسمى الإنزيم المسؤول عن استرخاء الحمض النووي الفائق الالتفاف للسماح ببدء النسخ المتماثل الحمض النووي gyrase أو topoisomerase II. [/ إجابة مخفية].

يسمى التكرار أحادي الاتجاه لجزيء دنا دائري مثل البلازميد الذي يتضمن شق خيط دنا واحد وإزاحته أثناء تخليق خيط جديد ________.
[تكشف-إجابة q = ”378861 ″] إظهار الإجابة [/ تكشف-إجابة]
[hidden-answer a = "378861 ″] يسمى التكرار أحادي الاتجاه لجزيء دنا دائري مثل البلازميد الذي يتضمن تقطيع خيط DNA وإزاحته أثناء تخليق خيط جديدالمتداول تكرار الدائرة. [/ إجابة مخفية].

يتم استخدام المزيد من مواد التمهيدي في تخليق الخيوط المتأخرة مقارنةً بتوليف الخيوط الرائدة.
[تكشف-الإجابة q = ”25479 ″] إظهار الإجابة [/ تكشف-الإجابة]
[hidden-answer a = ”25479 ″] صحيح [/ hidden-answer]

  1. لماذا مطلوب بريماز لتكرار الحمض النووي؟
  2. ما هو دور بروتين الربط أحادي السلسلة في تكرار الحمض النووي؟
  3. يوجد أدناه تسلسل الحمض النووي. تخيل أن هذا جزء من جزيء DNA انفصل استعدادًا للتكاثر ، لذا فأنت ترى خيطًا واحدًا فقط من الحمض النووي. بناء تسلسل الحمض النووي التكميلي (يشير إلى نهايات 5 و 3). تسلسل الحمض النووي: 3′-T A C T G A C T G A C G A T C-5 ′
  4. راجع الشكل 1 والشكل 2. لماذا كان من المهم أن يواصل Meselson و Stahl تجربتهما إلى جولتين على الأقل من النسخ المتماثل بعد وضع العلامات النظيرية للحمض النووي الأولي باستخدام15N ، بدلاً من إيقاف التجربة بعد جولة واحدة فقط من النسخ المتماثل؟
  5. إذا تمت إضافة deoxyribonucleotides التي تفتقر إلى مجموعات 3′-OH أثناء عملية النسخ المتماثل ، فما الذي تتوقع حدوثه؟

العودة إلى الصدارة


25.1.7 المراجع

  1. باركر ، إن ، شنيجورت ، إم ، ثي تو ، إيه-إتش ، ليستر ، بي ، فورستر ، بي إم. (2019) علم الأحياء الدقيقة. أوبنستاكس. متاح على: https://opentextbc.ca/microbiologyopenstax/
  2. مبادئ الكيمياء الحيوية / استقلاب الخلية 1: تكرار الحمض النووي. (2017 ، 6 أغسطس). ويكي الكتب ، مشروع الكتاب المدرسي المجاني. تم الاسترجاع 19:07 ، 31 أكتوبر 2019 من en.wikibooks.org/w/index.php؟title=Principles_of_Biochemistry/Cell_Metabolism_I:_DNA_replication&oldid=3259729.
  3. كايزر ، ج. (2015) تشريح الخلايا بدائية النواة. كلية المجتمع في مقاطعة بالتيمور. متاح على: http://faculty.ccbcmd.edu/~gkaiser/SoftChalk٪20BIOL٪20230/Prokaryotic٪20Cell٪20Anatomy/nucleoid/nucleoid/nucleoid3.html
  4. RCSB PDB "جزيء الشهر": إلهام النظرة الجزيئية للبيولوجيا د. بيرمان ، س. بيرلي (2015) بلوس بيول 13(5): e1002140. دوى: 10.1371 / journal.pbio.1002140
  5. المساهمين في ويكيبيديا. (2020 ، 7 مايو). هيليكاس. في ويكيبيديا، الموسوعة الحرة. تم الاسترجاع 13:38 ، 9 يونيو 2020 ، من en.Wikipedia.org/w/index.php؟
  6. Windgassen ، T.A. ، Wessel ، S.R. ، Bhattacharyya ، B. ، and Keck ، J.L. (2017) إعادة تشغيل آليات تكرار الحمض النووي البكتيري. Res أحماض Nuc 46 (2): 504-519. متاح على: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5778457/
  7. Xu، Z-Q.، Dixon، N.E. (2018) البدائل البكتيرية. بيول هيكل العملة للعملات 53: 159-168. متاح على: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959440X18300952
  8. ليو ، بي ، إلياسون ، دبليو كيه ، وستيتز ، تي إيه. (2013) هيكل مجمع لودر هليكاز-هليكاز يكشف عن رؤى حول آلية تجميع البريموسوم البكتيري. Nature Comm 4: 2495. متاح على: https://www.researchgate.net/publication/256764134_Structure_of_a_helicase-helicase_loader_complex_reveals_insights_into_the_mechanism_of_bacterial_primosome_assembly
  9. Xu و Z-Q و Dixon و N.E. Curr Op Struc Biol 53: 159-168. متاح على: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959440X18300952
  10. فرنانديز ليرو ، R. ، كونراد ، J. ، شيريس ، S.HW. ، و Lamers ، M.H. (2015) تكشف هياكل Cryo-EM لبوليميراز DNA المتكرر للإشريكية القولونية عن تفاعلاتها الديناميكية مع المشبك المنزلق للحمض النووي والنوكلياز الخارجي و τ. eLife 4: e11134. متاح على: https://elifesciences.org/articles/11134
  11. Ekundayo، B. and Bleichert، F. (2019) أصول تكرار الحمض النووي. بلوس 15 (12): e1008556. متاح على: https://journals.plos.org/plosgenetics/article؟id=10.1371/journal.pgen.1008320
  12. Leman، AR، and Noguchi، E. (2013) شوكة النسخ المتماثل: فهم آلية النسخ المتماثل حقيقية النواة والتحديات التي تواجه تكرار الجينوم. الجينات 4 (1): 1-32. متاح على: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3627427/
  13. Doublié، S. (2014) رؤى هيكلية في تكرار الحمض النووي حقيقية النواة. أمام. ميكروبيول. 5:444. متاح على: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2014.00444/full
  14. بيلارد ، ب ، وبونسيت د. (2019) إجهاد النسخ في الحمض النووي التيلومري والميتوكوندريا: الأصول والعواقب الشائعة على الشيخوخة. علوم Int J. Mol 20 (19): 4959. متاح على: https://www.mdpi.com/1422-0067/20/19/4959/htm
  15. Yeh ، J-K. ، و Wang ، C-Y. (2016) التيلوميرات والتيلوميراز في أمراض القلب والأوعية الدموية. الجينات 7 (9) 58. متاح على: https://www.mdpi.com/2073-4425/7/9/58/htm
  16. Boccardi، V. (2012) العلاج الجيني التيلوميرس: نهج جديد لمكافحة الشيخوخة. EMBO Mol Med 4: 685-687. متاح على: https://www.embopress.org/doi/epdf/10.1002/emmm.201200246
  17. المساهمين في ويكيبيديا. (2020 ، 26 أبريل). كيناز المعتمد على السيكلين. تم الاسترجاع 18:52 ، 30 يونيو 2020 ، من https://en.Wikipedia.org/w/index.php؟title=Cyclin-dependent_kinase&oldid=953307433
  18. Falkenberg ، M. (2018) تكرار الحمض النووي للميتوكوندريا في خلايا الثدييات: نظرة عامة على المسار. مقالات Biochem 62 (3): 287-296. متاح على: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6056714/
  19. فولوير ، إس ، وآخرون. آل. (2013) مفاهيم علم الأحياء. أوبنستاكس. متاح على: https://openstax.org/details/books/concepts-biology؟
  20. عليم ، إ. و أرسيشي ، آر جيه. (2015) استهداف منظمات دورة الخلية في أورام الدم الخبيثة. الحدود في الخلية وعلم الأحياء التنموي 3 (16). متاح على: https://www.researchgate.net/publication/275354547_Targeting_cell_cycle_regulators_in_hematologic_malignancies

25.1: استنساخ الحمض النووي - علم الأحياء

المطفّر هو عامل مادة يمكنه إحداث تغيير دائم في التركيب المادي لجين الحمض النووي بحيث يتم تغيير الرسالة الجينية.

بمجرد تلف الجين أو تغييره ، فإن الرنا المرسال المنسوخ من هذا الجين سيحمل الآن رسالة متغيرة.

سيحتوي البولي ببتيد الناتج عن ترجمة mRNA المتغير على تسلسل مختلف من الأحماض الأمينية. من المحتمل أن تتغير أو تفقد وظيفة البروتين الناتج عن طي هذا البولي ببتيد. في هذا المثال ، تم تغيير الإنزيم الذي يحفز إنتاج صبغة لون الزهرة بطريقة لم تعد تحفز إنتاج الصبغة الحمراء.

لا ينتج عن البروتين المعدل أي منتج (صبغة حمراء).

  • يقلد القواعد النوكليوتيدية الصحيحة في جزيء الحمض النووي ، لكنه يفشل في إنشاء الزوج بشكل صحيح أثناء تكرار الحمض النووي.
  • إزالة أجزاء من النيوكليوتيدات (مثل المجموعة الأمينية على الأدينين) ، مما يتسبب مرة أخرى في الاقتران غير الصحيح للقاعدة أثناء تكرار الحمض النووي.
  • إضافة مجموعات هيدروكربونية إلى نيوكليوتيدات مختلفة ، مما يتسبب أيضًا في الاقتران غير الصحيح للقاعدة أثناء تكرار الحمض النووي.

الإشعاع يتم امتصاص الإشعاع عالي الطاقة من مادة مشعة أو من الأشعة السينية بواسطة الذرات الموجودة في جزيئات الماء المحيطة بالحمض النووي. يتم نقل هذه الطاقة إلى الإلكترونات التي تطير بعد ذلك بعيدًا عن الذرة. تبقى الجذور الحرة في الخلف ، وهي جزيء شديد الخطورة وعالي التفاعل يهاجم جزيء الحمض النووي ويغيره بعدة طرق.
يمكن أن يتسبب الإشعاع أيضًا في حدوث فواصل مزدوجة في جزيء الحمض النووي ، والتي لا تستطيع آليات إصلاح الخلية تصحيحها.

يحتوي ضوء الشمس على الأشعة فوق البنفسجية (المكون الذي يسبب الاسمرار) والذي ، عند امتصاصه بواسطة الحمض النووي ، يتسبب في تكوين رابط متقاطع بين قواعد متجاورة معينة. في معظم الحالات العادية ، يمكن للخلايا إصلاح هذا الضرر ، لكن الثنائيات غير المعالجة من هذا النوع تتسبب في تخطي نظام النسخ المتماثل للخطأ وترك فجوة ، من المفترض أن يتم ملؤها لاحقًا.
يمكن أن يتسبب تعرض جلد الإنسان غير المحمي للأشعة فوق البنفسجية في أضرار جسيمة وقد يؤدي إلى الإصابة بسرطان الجلد وانتشار أورام الجلد.

تحدث الطفرات العفوية دون التعرض لأي عامل مطفر واضح. في بعض الأحيان تتحول نيوكليوتيدات الحمض النووي دون سابق إنذار إلى شكل كيميائي مختلف (يعرف باسم أيزومر) والذي بدوره سيشكل سلسلة مختلفة من الروابط الهيدروجينية مع شريكه. هذا يؤدي إلى أخطاء في وقت تكرار الحمض النووي.

العلم عن بعد
ونسخ 1997 ، 1998 ، 1999 ، 2000 الأستاذ جون بلامير


الفرق بين بوليميريز الحمض النووي 1 و 3

بوليميريز الحمض النووي 1 مقابل 3

بوليميرات الدنا هي إنزيمات مصممة خصيصًا تساعد في تكوين جزيئات الحمض النووي عن طريق تجميع كتل بناء صغيرة من الحمض النووي تسمى نيوكليوتيدات. يساعد بوليميراز الحمض النووي في تقسيم جزيء الحمض النووي إلى جهازي DNA متطابقين. تسمى عملية تقسيم الحمض النووي هذه بتكرار الحمض النووي. يعمل بوليميراز الحمض النووي كمحفز في تكرار الحمض النووي وبالتالي فهو ضروري للغاية. يساعد بوليميراز الحمض النووي في قراءة خيوط الحمض النووي الموجودة بالفعل لإنشاء خيطين جديدين يتطابقان مع الحمض النووي الأصلي الموجود. بهذه الطريقة ، يتم توجيه المعلومات الجينية إلى الخلايا الوليدة وتنتقل من جيل إلى آخر.

الفرق في الهيكل

هناك العديد من أنواع بوليميرات الحمض النووي بناءً على الوظائف المختلفة التي يتعين عليهم القيام بها.إن بوليميراز الحمض النووي 1 ضروري لتكرار الحمض النووي ويسمى أيضًا بول 1. اكتشفه آرثر كورنبرج. إن بوليميراز الدنا 3 ضروري لتكرار الحمض النووي المؤيد للنواة واكتشفه توماس كورنبرج ومالكولم جيفتر. يسمى DNA polymerase 3 أيضًا باسم holoenzyme وهو المكون الأكثر أهمية في ريبليزوم.

الاختلاف في الوظيفة

تساعد وظائف DNA polymerase 1 في تكرار الحمض النووي. يتم استخدامه لبحوث البيولوجيا الجزيئية. أثناء عملية النسخ المتماثل ، يُملأ أساس الحمض النووي الريبي في الخيط المتأخر من الحمض النووي. يزيل DNA polymerase 1 RNA التمهيدي ويملأ النيوكليوتيدات اللازمة لتشكيل الحمض النووي في الاتجاه- 5 "إلى 3". كما أنه يساعد في تدقيق القراءة لمعرفة ما إذا كان هناك أي خطأ أثناء النسخ المتماثل وأثناء مطابقة أزواج القاعدة. الحقيقة التي يجب تذكرها هي أن بوليميريز الحمض النووي 1 هذا يضيف فقط النيوكليوتيدات ولكنه لا ينضم إليها. يتم الانضمام إلى الحمض النووي بواسطة إنزيم آخر يسمى ligase والذي يشكل خيوطًا مستمرة من الحمض النووي. تتمثل الوظيفة الرئيسية لبوليميراز الحمض النووي 1 في وسم الحمض النووي عن طريق ترجمة نيك وتوليف الشريط الثاني لـ cDNA. إن بوليميريز الحمض النووي 1 يحفز أيضًا تخليق 5 إلى 3 من الحمض النووي. يقرأ DNA polymerase 1 شكل وقطبية dNTP الوارد. يحتوي DNA polymerase 1 على 3 أنشطة مثل polymerase و 3 'to 5' exonuclease و 5 'to 3' exonuclease. بوليميراز الدنا 1 عبارة عن بوليميراز DNA يعتمد على القالب.

يحتوي المركز الحفاز Pol 3 على وحدات فرعية مرتبطة بإحكام تسمى alpha و epsilon و theta. الوحدة الفرعية ألفا مسؤولة عن نشاط بوليميريز الحمض النووي ، والوحدة الفرعية إبسيلون لديها دليل على قراءة نشاط نوكلياز خارجي ووحدة ثيتا الفرعية هي الأصغر على الإطلاق وتساعد في تعزيز خصائص إثبات القراءة للإبسيلون. يوجد ريبليزوم في شوكة النسخ المتماثل. إن بوليميراز الدنا 3 هو أحد مكونات الريبليزوم وبالتالي يساعد في التكرار.

يعد بوليميراز الدنا 3 ضروريًا لتكرار السلاسل الرائدة والمتأخرة بينما يعد بوليميريز الحمض النووي 1 ضروريًا لإزالة بادئات الحمض النووي الريبي من الأجزاء واستبدالها بالنيوكليوتيدات المطلوبة. لا يمكن لهذه الإنزيمات أن تحل محل بعضها البعض لأن كلاهما له وظائف مختلفة يجب القيام بها. تساعد بوليميرات الحمض النووي في نقل المعلومات الجينية والسمات من جيل إلى آخر من خلال عملية تكرار الحمض النووي.


بحث

الكروموسومات هي المستودعات الدائمة للمعلومات التي توجه وظيفة الخلية. يتكون كل كروموسوم من جزيء DNA واحد مع مجموعة من البروتينات المرتبطة به. في كل مرة تنقسم فيها الخلية يجب أن تنسخ بشكل دقيق وكامل الحمض النووي في أساس كل كروموسوم وأن تعيد تجميع البروتينات التي تفسر هذا المخطط الخلوي الأساسي. ومن اللافت للنظر أنه خلال متوسط ​​عمر الإنسان ، تصنع هذه العملية بدقة تريليونات الأميال من الحمض النووي. يمكن أن يؤدي تكرار الحمض النووي غير الدقيق أو غير المكتمل أو المفرط إلى موت الخلايا أو تشوهات في النمو أو الإصابة بالسرطان. تمشيا مع دورها الحاسم ، يتم تنسيق ازدواجية الكروموسوم بعناية مع انقسام الخلية.

تركز دراساتنا على الأحداث التي تحدث في نقاط بداية تكرار الكروموسومات ، والتي تسمى أصول تكرار الحمض النووي. تم العثور على تسلسلات الحمض النووي هذه في مواقع متعددة على كل كروموسوم حقيقي النواة وتوجيه تجميع زوج ثنائي الاتجاه من آلات النسخ المتماثل ، أو المستبدلات ، التي تقوم بتكرار الحمض النووي على جانبي الأصل. يجب أن ينسق كل بديل نشاط إنزيمات متعددة ، بما في ذلك إنزيم DNA ، وثلاثة بوليميراز DNA ، وبوليميراز RNA. يمكن تقسيم الأحداث التي تحدث في الأصل إلى أربع خطوات: اختيار الأصل ، وتحميل الهليكوبتر ، وتفعيل الهليكوبتر ، والتجميع المتكرر. للحفاظ على أرقام الكروموسوم المناسبة ، تفصل الخلايا المنقسمة اختيار الأصل وتحميل الهليكاز عن تنشيط الهليكاز وتجميع إعادة التركيب. يضمن هذا الفصل أن كل أصل للنسخ المتماثل يمكن أن يبدأ النسخ المتماثل مرة واحدة فقط لكل انقسام خلية ، مما يمنع إعادة تكرار الجينوم (الشكل 1).


شكل 1

يتوسط مجمع التعرف على أصل البروتين المكون من ستة بروتينات (ORC) في الاختيار الأولي لتسلسل الحمض النووي الأصلي. تم اكتشاف ORC في البداية في الخميرة الناشئة Saccharomyces cerevisiae ، من خلال قدرتها على الارتباط بتسلسل محفوظ موجود في أصول هذا الكائن الحي لتكرار الحمض النووي. على الرغم من وجود هذه المواقع في العديد من المواضع عبر الجينوم ، إلا أن مجموعة فرعية فقط مرتبطة بـ ORC. بالتعاون مع مختبر David MacAlpine (جامعة Duke) ، استخدمنا رسم خرائط على مستوى الجينوم للنيوكليوزومات لإثبات أن المناطق المستنفدة للنيوكليوزوم هي محدد حاسم للمواقع المرتبطة بـ ORC (الشكل 2). بمجرد ارتباطه بالحمض النووي الأصلي ، يحدد ORC الموقع الدقيق للنيوكليوزومات على جانبي الأصل. تشير تجاربنا السابقة إلى أن هذا الوضع أمر بالغ الأهمية لتحميل هليكاز. نحن نركز حاليًا على فهم كيفية ترميز هذه المناطق المستنفدة للنيوكليوسوم في أصول النسخ المتماثل وكيف تؤثر النيوكليوزومات المتوضعة على تحميل الهليكاز وبدء النسخ المتماثل.

الشكل 2

مع دخول الخلايا إلى المرحلة G1 من دورة الخلية ، يقوم ORC بتجنيد عاملين آخرين لتحميل الهيليكس (Cdc6 و Cdt1) وهليكس الحمض النووي التكراري (مجمع Mcm2-7) إلى الحمض النووي الأصلي. في سلسلة من الأحداث المعتمدة على ATP ، يقوم ORC و Cdc6 و Cdt1 بتحميل هليكاز الحمض النووي على الحمض النووي المجاور. بعد التحميل ، يقوم مجمعان Mcm2-7 على شكل حلقة ، بتطويق الحمض النووي المزدوج الشريطة (dsDNA) كسداسي مزدوج وجهاً لوجه. على الرغم من أنها غير نشطة ، إلا أن هذه السداسيات المزدوجة المحملة تحدد جميع الأصول المحتملة للنسخ المتماثل وهي مهيأة لبدء ثنائي الاتجاه.

لقد حققنا في سيطرة ATP على تحميل المروحيات على نطاق واسع. يكشف تحليل طفرات Cdc6 و ORC و Mcm2-7 ATPase عن أدوار مختلفة لكل بروتين. Mcm2-7 ربط ATP والتحلل المائي مسؤولان بشكل أساسي عن متطلبات ATP لتحميل الهليكاز. على الرغم من أن طفرات التحلل المائي Cdc6 ATP تساهم أيضًا في تحميل الهليكاز ، فإن هذه الوظيفة تشارك بشكل أساسي في إطلاق مجمعات Mcm2-7 التي تفشل في التحميل. التحلل المائي ORC ATP غير مطلوب لتحميل الهليكاز ولكنه مهم للجولات المتعددة للتحميل Mcm2-7 وهو ضروري في الجسم الحي.

تستخدم أحدث دراساتنا مناهج الجزيء المفرد لمعالجة ديناميكيات البروتين أثناء تحميل الهليكاز وتقديم نظرة ثاقبة للآليات التي تؤسس بدء النسخ المتماثل ثنائي الاتجاه (الشكل 3). بالتعاون مع مختبر جيف جيليس في جامعة برانديز ، طورنا طرقًا لرصد ارتباط العديد من البروتينات المحملة للهلياز بالحمض النووي باستخدام التحليل الطيفي لجزيء واحد (CoSMoS). تكشف دراساتنا أن التحميل المتسلسل لطائرتين من نوع Mcm2-7 في شكل سداسي مزدوج يتضمن الربط المرتب وإطلاق جزيئات Cdc6 و Cdt1 المتميزة. في المقابل ، يوجه جزيء ORC واحد فقط تحميل كلتا الهليكازين في سداسي مزدوج. يُظهر الكشف عن نقل طاقة الرنين بالرنين أحادي الجزيء (FRET) لتفاعلات Mcm-Mcm أن تكوين السداسي المزدوج يحدث بسرعة بعد وصول الهيكاز الثاني. تشير دراساتنا معًا إلى أن الآليات المتميزة تقوم بتحميل أول وثاني هليكاز في كل سداسي مزدوج وتضمن أنها في التشكل وجهاً لوجه المطلوب للبدء ثنائي الاتجاه اللاحق. نحن بصدد توسيع هذه الدراسات لرصد الأحداث الإضافية أثناء تحميل الهليكاز ودراسة البروتينات الطافرة التي تحمل هليكاز لاكتساب نظرة ثاقبة حول العديد من الخطوات الجديدة في تحميل هيليكاز التي اكتشفناها.

يظهر نموذج للتحميل من الرأس إلى الرأس للسداسي المزدوج Mcm2-7 في الشكل 3. يتعرف ORC على الأصل DNA ويربط Cdc6. يقوم هذا المجمع بتجنيد هليكاز Mcm2-7 المرتبط بـ Cdt1 عن طريق ربط المناطق الطرفية C. ينتج عن الإصدار المتسلسل من Cdc6 و Cdt1 تحميل أول هليكاز Mcm2-7. بعد ربط ORC بمركب Cdc6 ثانٍ ، فإن التفاعلات بين نطاقات N-terminal للطائرتين Mcm2-7s تجند الهليكاز الثاني. وصول الإصدار الثاني لمحركات الأقراص Mcm2-7 من Cdc6 ، يليه Cdt1 و ORC. نتيجة هذه الآلية هي تحميل الطائرتين في اتجاهات متعاكسة معدة لبدء النسخ المتماثل ثنائي الاتجاه.

الشكل 3

تم التعديل من Ticau et al. (2015)

يتم تنشيط مجمعات Mcm2-7 المحملة على الحمض النووي الأصلي أثناء G1 فقط عند الدخول إلى المرحلة S من دورة الخلية. يتطلب تنشيط Helicase عمل كيناز Cdc7 المعتمد على Dbf4 (DDK) و kinase المعتمد على cyclin على شكل S (S-CDK). تؤدي هذه الكينازات إلى تجنيد عوامل تنشيط الهليكاز Cdc45 و GINS ، مما يشكل الهليكاز المنشط Cdc45-Mcm2-7-GINS (CMG). بالإضافة إلى تنشيط هيليكاز ، يجب أن تجمع الخلية بقية إعادة تركيب الحمض النووي ، بما في ذلك بوليميرات الحمض النووي التكراري الثلاثة المخصصة للخيط الرئيسي (Pol) أو الخيط المتأخر (Pol α / primase ، Pol) التوليف.

استخدمنا المقايسات التي تلخص بدء النسخ المتماثل المعتمد على الأصل لتحديد أن DDK و S-CDK يطلقان أحداثًا مميزة ومتسلسلة أثناء تنشيط هيليكاز وأن DDK نشط قبل مرحلة S في الأصول المبكرة للنسخ المتماثل. من خلال تحليل التجميع المتكرر ، وجدنا أن بوليميراز الحمض النووي الرائد يتم تجنيده قبل نظرائه من الخيوط المتأخرة. يضمن هذا الترتيب للأحداث وجود بوليميراز الحمض النووي الريادي قبل أي تخليق تمهيدي لـ RNA بحيث يمكن إطالة البادئات الأولى.

لقد استخدمنا اختبار النسخ المتماثل هذا لفهم وظائف Mcm2-7 أثناء بدء النسخ المتماثل. على الرغم من أن العديد من طفرات Mcm2-7 ATPase التي درسناها كانت معيبة في تحميل الهليكاز ، إلا أن مجموعة فرعية من هذه المجمعات الطافرة أظهرت عيوبًا طفيفة فقط. كشف تحليل هذه المسوخات في مقايسة بدء النسخ المتماثل عيوبًا في تكوين مركب CMG ، مما يشير إلى أدوار لزخارف Mcm2-7 ATPase المحددة في تنشيط الهليكاز. لقد تعاونا أيضًا مع مختبر Eric Enemark (مستشفى سانت جود لأبحاث الأطفال) لإثبات أن مجال ربط الحمض النووي المفرد الذي تم تحديده حديثًا في المنطقة الطرفية N في Mcm2-7 يشارك أيضًا في تنشيط الهليكاز. ومن المثير للاهتمام ، أن قطبية هذا التفاعل تتنبأ بالارتباط التفضيلي للحمض النووي أحادي الخيط الذي يحيط بمركب Mcm2-7 أثناء الحركة المعاد تشكيلها. تقترح هذه الملاحظة آلية لـ Mcm2-7 للاحتفاظ بالحبلا المنقولة في القناة المركزية أثناء انتقال Mcm2-7 من تطويق الخيط المزدوج إلى تطويق الحمض النووي أحادي الجديلة. نستمر في استغلال هذه المقايسات لاكتساب نظرة ثاقبة لآليات بدء النسخ المتماثل ونسعى إلى إجراء فحوصات أحادية الجزيء لهذه الأحداث.


تكرار الحمض النووي

يتكاثر الحمض النووي بطريقة شبه محافظة حيث يعمل كل من خيوط الحمض النووي الأبوية كقالب لتخليق الحمض النووي الجديد. بعد التكاثر ، يكون لكل DNA خيط أبوي أو خيط "قديم" وابنة واحدة أو خصلة "جديدة".

يبدأ النسخ المتماثل في حقيقيات النوى من أصول متعددة للنسخ المتماثل ، بينما يبدأ النسخ المتماثل في بدائيات النوى من أصل واحد للنسخ المتماثل. يتم فتح الحمض النووي بواسطة الإنزيمات ، مما يؤدي إلى تكوين شوكة النسخ المتماثل. يصنع Primase مادة أولية من الحمض النووي الريبي لبدء التوليف بواسطة بوليميريز الحمض النووي ، والذي يمكن أن يضيف نيوكليوتيدات في اتجاه واحد فقط. يتم تصنيع خصلة واحدة بشكل مستمر في اتجاه شوكة النسخ المتماثل وهذا ما يسمى بالخيط الرئيسي. يتم تصنيع الخيط الآخر في اتجاه بعيدًا عن شوكة النسخ ، في امتدادات قصيرة من الحمض النووي المعروفة باسم شظايا أوكازاكي. يُعرف هذا الخيط بالخيط المتأخر. بمجرد اكتمال النسخ المتماثل ، يتم استبدال بادئات RNA بنكليوتيدات DNA ويتم ختم الحمض النووي بـ DNA ligase.

تشكل نهايات الكروموسومات حقيقية النواة مشكلة ، حيث أن البوليميراز غير قادر على تمديدها بدون مادة أولية. تيلوميراز ، إنزيم مع قالب RNA يحمل في ثناياه عوامل ، يمتد النهايات عن طريق نسخ قالب RNA وتوسيع أحد طرفي الكروموسوم. يمكن لبوليميراز الحمض النووي بعد ذلك تمديد الحمض النووي باستخدام التمهيدي. بهذه الطريقة ، تتم حماية أطراف الكروموسومات. تمتلك الخلايا آليات لإصلاح الحمض النووي عندما يتضرر أو تحدث أخطاء في النسخ المتماثل. تتضمن هذه الآليات إصلاح عدم التطابق لاستبدال النيوكليوتيدات المقترنة بقاعدة غير مكملة وإصلاح استئصال النوكليوتيدات ، والذي يزيل القواعد التالفة مثل ثايمين الثايمين.


دور نشاط DNA methyltransferase في علاج الكوكايين والانسحاب في النواة المتكئة للفئران

أنتي كالدا ، قسم الصيدلة ، معهد الطب الحيوي والطب التحويلي ، جامعة تارتو ، رافيلا 19 ، تارتو 50411 ، إستونيا.

قسم الصيدلة ، معهد الطب الحيوي والطب التحويلي ، جامعة تارتو ، إستونيا

قسم الصيدلة ، معهد الطب الحيوي والطب التحويلي ، جامعة تارتو ، إستونيا

قسم الصيدلة ، معهد الطب الحيوي والطب التحويلي ، جامعة تارتو ، إستونيا

معهد الكيمياء ، جامعة تارتو ، إستونيا

معهد الكيمياء ، جامعة تارتو ، إستونيا

قسم الصيدلة ، معهد الطب الحيوي والطب التحويلي ، جامعة تارتو ، إستونيا

معهد الكيمياء والتكنولوجيا الحيوية ، جامعة تالين للتكنولوجيا ، إستونيا

قسم الصيدلة ، معهد الطب الحيوي والطب التحويلي ، جامعة تارتو ، إستونيا

قسم الصيدلة ، معهد الطب الحيوي والطب التحويلي ، جامعة تارتو ، إستونيا

Anti Kalda، Department of Pharmacology، Institute of Biomedicine and Translational Medicine، University of Tartu، Ravila 19، Tartu 50411، Estonia.

الملخص

قدم عدد متزايد من التقارير دليلًا حاسمًا على أن التعديلات اللاجينية ، مثل مثيلة الحمض النووي ، قد تكون متورطة في بدء وإنشاء التغييرات المستقرة التي يسببها المنبه النفسي على المستوى الخلوي من خلال تنسيق التعبير عن شبكات الجينات ، والتي تظهر بعد ذلك على أنها سلوك طويل الأجل. التغييرات. في هذه الدراسة ، قمنا بتقييم نشاط إنزيم ميثيل ترانسفيرازات الحمض النووي (DNMTs) بعد علاج الكوكايين وأثناء الانسحاب. علاوة على ذلك ، درسنا كيف أن التثبيط الوراثي أو الدوائي لـ DNMTs في نواة الفأر المتكئة (NAc) يؤثر على التحريض والتعبير عن التحسس السلوكي الناجم عن الكوكايين. أظهرت نتائجنا أنه بعد إسكات Dnmt3a في NAc أثناء مرحلة تحريض التحسس الناجم عن الكوكايين ، ينخفض ​​نشاط DNMT الكلي ، ويرتبط سلبًا بالتوعية السلوكية. انخفاض Dnmt3a كان mRNA خلال هذه المرحلة أكبر عامل مساهم في انخفاض نشاط DNMT. أدى سحب الكوكايين وجرعة التحدي إلى زيادة نشاط DNMT في NAc ، والذي ارتبط بالتعبير عن التحسس السلوكي. انتقائية طويلة المدى Dnmt3a لم يغير إسكات النسخ في NAc نشاط DNMT أو التعبير عن التحسس السلوكي الناجم عن الكوكايين. ومع ذلك ، فإن الحقن الثنائي داخل NAc لمثبط غير محدد لـ DNMT (RG108) أثناء الانسحاب من الكوكايين قلل من نشاط DNMT في NAc وكان له تأثير ضئيل على التعبير عن التحسس السلوكي الناجم عن الكوكايين. وبالتالي ، يرتبط علاج الكوكايين والانسحاب بالتغيرات ثنائية الطور في نشاط DNMT في NAc ، وينخفض ​​التعبير عن التحسس السلوكي مع التثبيط غير الانتقائي لـ DNMT ولكن ليس بالإسكات الانتقائي لـ DNMT. Dnmt3a.


دورة تحليلية

الدورة اللايتية هي عملية تكرار يقوم بها فيروس داخل خلية بكتيرية. المقالة التالية عبارة عن مناقشة للخطوات التي تساعدك على فهم هذه العملية.

الدورة اللايتية هي عملية تكرار يقوم بها فيروس داخل خلية بكتيرية. المقالة التالية عبارة عن مناقشة للخطوات التي تساعدك على فهم هذه العملية.

يحدث التكاثر الفيروسي في دورتين ، أي الدورة اللايسوجينية والدورة اللايتية. يُعتقد أن الطريقة الأخيرة هي الطريقة الرئيسية لتكاثر الفيروس ، حيث تؤدي إلى تدمير خلية بكتيرية مصابة. تؤدي هذه الدورة إلى تحلل الخلية ، أي انهيار الخلية ، ومن هنا جاءت التسمية. في هذه المقالة سوف نتعلم خطواتها باختصار.

ما هي دورة Lytic؟

هل تود الكتابة لنا؟ حسنًا ، نحن نبحث عن كتاب جيدين يريدون نشر الكلمة. تواصل معنا وسنتحدث.

ينص التعريف على أن العاثيات الخبيثة هي تلك التي يمكن أن تتكاثر فقط في الخلايا البكتيرية. في نهاية دورة حياتهم ، يتسببون في تحلل الخلايا ، مما يقتل البكتيريا المضيفة. تسمى الفيروسات التي تصيب البكتيريا بالعاثيات. الأمثلة الأكثر شيوعًا على العاثية هي T4 و Lambda Phage. يمكن لكل من هذه العاثيات أن تصيب بكتيريا الإشريكية القولونية (E. Coli). العاثيات هي طفيليات إلزامية داخل الخلايا مثل الفيروسات الأخرى وتحتاج إلى خلية مضيفة للتكاثر. تتكاثر العاثية T4 بواسطة الدورة اللايتية ، والتي تتسبب في النهاية في موت الخلية المضيفة & # 8217s. تتكاثر فجوة لامدا باستخدام الدورة اللايسوجينية ، والتي لا تسبب موت الخلية المضيفة. هناك خمس مراحل من الدورة اللايتية ، ويتم شرحها في الفقرات التالية باستخدام الملتهمة T4 كمثال.

معالجة

تتكاثر العاثية باستخدام الدورة اللايتية كطريقة للتكاثر. الخطوات الخمس لاستنساخه هي التعلق والاختراق والتركيب الحيوي والتجميع والإطلاق. دعونا نتعرف على هذه الخطوات بالتفصيل.

  1. مرفق:
    تحتوي فجوة T4 على هيكل معقد يحتوي على العديد من ألياف الذيل. تساعد هذه الألياف في ربط الفيروس بجدار خلية الإشريكية القولونية في خلايا المستقبل التكميلية. بمجرد الارتباط ، تتشكل روابط كيميائية ضعيفة بين موقع المستقبل والمرفق ، مما يساعد الفيروس على الالتصاق بالخلية المضيفة.
  2. اختراق:
    بمجرد أن يتم ربط العاثية T4 بالخلية البكتيرية ، فإنها تحقن دناها المزدوج الشريطة (أو الحمض النووي الريبي المفرد الذي تقطعت به السبل ، اعتمادًا على نوع العاثية) في خلية الإشريكية القولونية. تطلق فجوة T4 الإنزيمات التي تضعف جدار الخلية للبكتيريا. يساعد ذلك في حقن المادة الوراثية للفيروس عن طريق الضغط على غلافه على الخلية. يبقى جسم القفيصة أو الفيروس الفارغ في الخلية البكتيرية. تدخل بعض أنواع العاثيات إلى الخلية المضيفة سليمة وتذيب قفيصتها داخل العائل. تُعرف هذه العملية باسم uncoating.
  3. التخليق الحيوي:
    يتوقف تخليق البروتين المضيف & # 8217s عندما يتحلل الحمض النووي المضيف بواسطة الفيروس المصاب. يبدأ الحمض النووي الفيروسي بالتدخل في نسخ وترجمة الحمض النووي للمضيف. تستخدم العاثية T4 النيوكليوتيدات المضيفة لتكرار الحمض النووي الخاص بها. كما أنه يستخدم الريبوسومات المضيفة والإنزيمات والأحماض الأمينية لتجميع الإنزيمات والبروتينات الخاصة به. أثناء التخليق الحيوي ، لا توجد عاثيات كاملة داخل الخلية المضيفة. وبالتالي ، تُعرف هذه المرحلة باسم فترة الكسوف.
  4. المجسم:
    هناك العديد من المكونات الفيروسية المصنوعة في الخلية المضيفة. ثم يتم تجميعها في فيروسات كاملة. تعمل البروتينات المشفرة للحمض النووي للعاثية في حالة الملتهمة T4 كإنزيمات تُستخدم لبناء عاثيات جديدة. يتم استخدام استقلاب المضيف & # 8217s لتجميع العاثيات ، مما يؤدي إلى امتلاء الخلية البكتيرية بالفيروسات الجديدة. ببطء ، يتم تجميع الكابسيدات ويتم تعبئة الحمض النووي داخل الرأس. أخيرًا ، يتم ربط ألياف الذيل بالبنية الفيروسية المعقدة.
  5. يطلق:
    يتم إطلاق الفيروسات من الخلية المضيفة بعد تجميع الجسيم الفيروسي الجديد. تنتج العاثية إنزيمًا يكسر جدار الخلية البكتيرية من الداخل ويسمح بدخول السوائل. تمتلئ الخلية بخلايا الملتهمة الجديدة (حوالي 100-200) والسوائل التي تسبب تحلل الخلية ، وبالتالي تكمل الدورة. العاثيات التي تم إطلاقها حرة في إصابة المزيد من الخلايا المضيفة ومواصلة العملية.

عملية دورة Lytic

يتم حساب وقت الاندفاع من وقت ربط الملتهمة بالخلية حتى تحلل الخلية المضيفة وإطلاق العاثيات الجديدة. يبلغ إجمالي وقت الانفجار حوالي 20-40 دقيقة. يسمى عدد الفيروسات التي يتم إطلاقها من الخلية في وقت الاندفاع بحجم الاندفاع. يمكن أن يختلف حجم الاندفاع من 50-200 لاقمات.

المنشورات ذات الصلة

دورات Lytic و lysogenic هي طرق قابلة للتبديل للتكاثر الفيروسي. مماثلة ، ومربكة في بعض الأحيان ، فإن فهم الفرق بين هاتين الدورتين يعتمد إلى حد كبير على دراسة كل منهما على حدة.

ربما يكون الكربون هو العنصر الأكثر حيوية على كوكب الأرض. تعيد دورة الكربون تأكيد حيويتها. تقدم هذه المقالة BiologyWise مخططها وشرح شامل من شأنه أن & hellip

الأميبا هي واحدة من أبسط المخلوقات التي وجدت منذ أن بدأت الحياة على الأرض. نظرًا لوجودها في عصور ما قبل التاريخ ، من المهم دراسة دورة حياة الأميبا


صحيفة وقائع: DNA-RNA-Protein

في جوهرها ، تمتلك جميع الكائنات الحية على هذا الكوكب آليات متشابهة جدًا يمكنها من خلالها معالجة معلوماتها الجينية واستخدامها لإنشاء اللبنات الأساسية للخلية. تقوم الكائنات بتخزين المعلومات على شكل DNA ، وتحرر المعلومات أو تحملها على هيئة RNA ، وتحول المعلومات إلى بروتينات تؤدي معظم وظائف الخلايا (على سبيل المثال ، تصل بعض البروتينات أيضًا إلى مكتبة DNA وتشغلها). هذه "العقيدة المركزية" للبيولوجيا الجزيئية هي نموذج مبسط للغاية ، ولكنها مفيدة لمتابعة تدفق المعلومات في النظم البيولوجية. من بين الميزات الأساسية:

1. الحمض النووي هو المادة الجينية لجميع الكائنات الخلوية.

حمض الديوكسي ريبونوكلييك (DNA) هو المادة المادية للوراثة. تستخدم جميع الكائنات الخلوية الحمض النووي لتشفير وتخزين معلوماتها الجينية. الحمض النووي هو مركب كيميائي يشبه سلسلة طويلة ، مع روابط في السلسلة تتكون من وحدات كيميائية فردية تسمى النيوكليوتيدات. تحتوي النيوكليوتيدات نفسها على ثلاثة مكونات: سكر (deoxyribose) ، فوسفات ، و nucleobase (غالبًا ما تسمى القاعدة).

تأتي القواعد في أربعة أشكال كيميائية تُعرف باسم الأدينين والسيتوزين والجوانين والثايمين ، والتي غالبًا ما يتم اختصارها ببساطة على أنها A و C و G و T. ترتيب القواعد أو "تسلسلها" يشفر المعلومات في الحمض النووي.

تخزن جميع الكائنات الحية الحمض النووي في شكل آمن ومستقر ومزدوج: "الحلزون المزدوج" الشهير ، حيث تلتف سلسلتان (تُعرفان أيضًا باسم الخيوط) من الحمض النووي حول بعضهما البعض. يتم ترتيب خيوط الحمض النووي مع القواعد من أحدهما يصطف مع قواعد الآخر. تتكون مكونات السكر والفوسفات من الخارج مثل القضبان المنحنية ، وتشكل القواعد المتطابقة قضبان تشبه السلم في المنتصف. (لاحظ & # 8211 أن بعض الفيروسات لها مادتها الجينية في شكل خيط واحد من الحمض النووي).

يتسبب شكل وشحنة القواعد في ارتباط A بشكل ضعيف بـ T ، و C إلى الارتباط الضعيف بـ G. A في أحد الخيطين يوجد T في الآخر عندما يكون هناك C في أحد الخيطين و G في الآخر. قواعد "الاقتران الأساسي" هذه هي المفتاح لفهم كيفية نقل الحمض النووي للمعلومات ونسخها في خيط DNA جديد (يجب أن تنسخ الخلية حمضها النووي قبل أن ينقسم إلى خليتين). عندما تنسخ الكائنات الحية جينوماتها ، تفصل الإنزيمات خيطي اللولب المزدوج ، وتفصل القواعد المزدوجة عن بعضها. تبدأ الإنزيمات الأخرى سلاسل DNA جديدة ، باستخدام قواعد الاقتران الأساسية لعمل صورة معكوسة جديدة لكل من الخيوط الأصلية. يمكن أن تؤدي الأخطاء في هذه العملية إلى الطفرات (التغيرات في التسلسل الجيني بين الأجيال). تمتلك العديد من الكائنات الحية آليات فحص الأخطاء التي تمسح الحمض النووي المتماثل حديثًا بحثًا عن الأخطاء وتصححها ، مما يحد بشكل كبير من عدد الطفرات التي تنشأ بسبب أخطاء النسخ.

2. يحمل RNA المعلومات
يحتفظ الحمض النووي بالمعلومات ، لكنه عمومًا لا يطبق هذه المعلومات بنشاط. الحمض النووي لا صنع أشياء. لاستخراج المعلومات وإيصالها إلى موقع الآلات الخلوية التي يمكنها تنفيذ تعليماتها (عادةً المخططات الخاصة بالبروتين ، كما سنرى أدناه) ، يتم "نسخ" رمز الحمض النووي إلى تسلسل مناظر في جزيء "ناقل" يسمى الحمض النووي الريبي ، أو RNA. تسمى أجزاء الحمض النووي التي يتم نسخها إلى RNA & # 8220genes & # 8221.

يتم نسخ الحمض النووي إلى الحمض النووي الريبي

الحمض النووي الريبي مشابه جدًا للحمض النووي. إنها تشبه سلسلة طويلة ، مع روابط في السلسلة تتكون من نيوكليوتيدات فردية. تتكون النيوكليوتيدات في الحمض النووي الريبي ، كما هو الحال في الحمض النووي ، من ثلاثة مكونات & # 8211 السكر والفوسفات وقاعدة. السكر في الحمض النووي الريبي هو ريبوز بدلاً من ديكسويريبوز الأكثر استقرارًا في الحمض النووي ، مما يساعد على جعل الحمض النووي الريبي أكثر مرونة وأقل متانة.

كما هو الحال في DNA ، تأتي القواعد في RNA في أربعة أشكال كيميائية ، ويتم تشفير المعلومات الموجودة في RNA في التسلسل الذي يتم فيه ترتيب هذه القواعد. كما هو الحال في الحمض النووي ، يجد المرء في الحمض النووي الريبي الأدينين (A) والسيتوزين (C) والجوانين (G). ومع ذلك ، في RNA uracil (المختصر U) يحل محل الثايمين (T) (يسمح المفتاح للحمض النووي الريبي ببعض الخصائص الخاصة التي لن نتطرق إليها هنا ، على حساب جعله أقل استقرارًا من الحمض النووي). تصنع الخلايا رسائل RNA في عملية مشابهة لتكرار الحمض النووي. يتم تفكيك خيوط الحمض النووي في موقع الجين المراد نسخه ، وتخلق الإنزيمات الحمض النووي الريبي المرسال من تسلسل قواعد الحمض النووي باستخدام قواعد الاقتران الأساسية.

3. تُستخدم جزيئات الحمض النووي الريبي المصنوعة في الخلية بطرق متنوعة.

لأغراضنا هنا ، هناك ثلاثة أنواع رئيسية من RNA: messenger RNA ، و RNA ribosomal ، و RNA الناقل. رسول RNA (مرنا) يحمل تعليمات لصنع البروتينات. البروتينات مثل الحمض النووي عبارة عن بوليمرات: سلاسل طويلة مجمعة من وحدات جزيئية مسبقة الصنع ، والتي ، في حالة البروتينات ، هي أحماض أمينية. تقوم آلة جزيئية كبيرة * تسمى الريبوسوم بترجمة شفرة mRNA وتجميع البروتينات. تقرأ الريبوسومات الرسالة في الرنا المرسال في "كلمات" من ثلاثة أحرف تسمى الكودونات ، والتي تترجم إلى أحماض أمينية معينة ، أو تعليمات للتوقف عن صنع البروتين. كل ترتيب ثلاثي أحرف محتمل لـ A ، C ، U ، G (على سبيل المثال ، AAA ، AAU ، GGC ، إلخ) هو تعليمات محددة ، وتطابق هذه التعليمات والأحماض الأمينية تُعرف باسم "الشفرة الجينية". على الرغم من وجود استثناءات أو اختلافات في الشفرة ، فإن الشفرة الجينية القياسية صحيحة في معظم الكائنات الحية.

تم العثور على الريبوسومات في جميع الكائنات الخلوية وهي متشابهة بشكل لا يصدق في هيكلها ووظائفها في جميع أنحاء الحياة. في الواقع ، فإن التشابه الشديد بين الريبوسومات في جميع أشكال الحياة هو أحد خطوط الدليل على أن جميع أشكال الحياة على الكوكب تنحدر من سلف مشترك.

*غالبًا ما يشير علماء الأحياء إلى البروتينات ، خاصةً المجمعات الكبيرة من البروتينات ، التي تتحرك أو تدور أو ترفع أو تستخدم الطاقة عمومًا لأداء العمل ، على أنها "آلات". لا يقصد علماء الأحياء الإيحاء بأن مثل هذه الجزيئات مصممة. "الآلة" هي استعارة مفيدة لمثل هذه الوظائف ، وهي أبسط وأكثر إضاءة من "معقد الجزيئات الكبيرة التي تترجم الطاقة المخزنة كيميائيًا إلى أجزاء متحركة".

4. تصنع الريبوسومات البروتينات باستخدام الحمض الريبي النووي الريبوزي (الرنا الريباسي).
يقرأ الريبوسوم التعليمات الموجودة في جزيئات الحمض النووي الريبي المرسال في الخلية ويبني البروتينات من هذه الرنا المرسال عن طريق الربط الكيميائي للأحماض الأمينية (هذه هي اللبنات الأساسية للبروتينات) بالترتيب الذي يحدده الرنا المرسال. تعد جزيئات Messenger RNA أطول من تعليمات تسلسل البروتين المشفر ، وتتضمن تعليمات للريبوسوم "لبدء" و "إيقاف" بناء البروتين. داخل أي كائن حي معين ، يمكن أن يكون هناك من مئات إلى آلاف إلى عشرات الآلاف من الرنا المرسال المتميز الذي يؤدي إلى بروتينات متميزة. يتم تحديد تنوع الشكل والوظيفة في الكائنات الحية إلى حد كبير من خلال أنواع البروتينات المصنوعة وكذلك تنظيم مكان ووقت تصنيع هذه البروتينات.

الريبوسوم الذي يحول الرنا المرسال إلى بروتينات كبير ومعقد. يحتوي على أكثر من خمسين بروتينًا (يختلف العدد الدقيق حسب الأنواع) في وحدتين فرعيتين رئيسيتين (يُعرفان عمومًا بالوحدة الفرعية الكبيرة والصغيرة). بالإضافة إلى البروتينات ، تشتمل كل وحدة فرعية على جزيئات RNA خاصة ، تُعرف باسم الحمض النووي الريبوزي (الرنا الريباسي) لأنها تعمل في الريبوسوم. إنها لا تحمل تعليمات لصنع بروتين معين (أي أنها ليست مرسال RNAs) ولكنها بدلاً من ذلك جزء لا يتجزأ من آلية الريبوسوم المستخدمة في صنع البروتينات من mRNAs. لمزيد من المعلومات حول RNA الريبوسوم ، انظر هنا. للحصول على معلومات حول كيفية استخدام تسلسل الحمض النووي الريبي الريبوزومي في الدراسات التطورية ، وأخذ العينات البيئية ، انتقل هنا.

لا تقرأ الريبوسومات التعليمات الموجودة في الرنا المرسال مباشرة - فهي تحتاج إلى مساعدة من نوع آخر من الرنا في الخلايا. نقل الحمض النووي الريبي (الحمض النووي الريبي) زوجان الأحماض الأمينية إلى رموز RNA الخاصة بهم. من المفترض أن يتم تحويل كل كودون إما إلى حمض أميني محدد في بروتين أو تعليمات محددة للريبوسوم (على سبيل المثال ، بدء ، توقف ، توقف ، إلخ). في أحد طرفيه ، يقدم نقل الحمض النووي الريبي كودونًا ثلاثي القواعد. من ناحية أخرى ، يمسك الحمض الأميني المقابل. نقل RNAs "قراءة" ، أو "ترجمة" ، RNA المرسال من خلال الاقتران الأساسي ، التجاذب الكيميائي لـ A لـ T و C لـ G ، تمامًا كما يتم "نسخ" تسلسل RNA من DNA عن طريق الاقتران الأساسي. يعمل الريبوسوم مثل المشبك العملاق ، حيث يحافظ على جميع اللاعبين في مواقعهم ، ويسهل كل من إقران القواعد بين الرنا المرسال ونقل الحمض النووي الريبي ، والترابط الكيميائي بين الأحماض الأمينية. يُعرف صنع البروتينات عن طريق قراءة التعليمات في mRNA عمومًا باسم "الترجمة".

يتم ترجمة mRNA إلى بروتين

تم إنتاج هذا المستند بواسطة microBEnet. كتبه جوناثان آيزن وحرره ديفيد كويل وإليزابيث ليستر بتعليقات من هال ليفين.


25.1: استنساخ الحمض النووي - علم الأحياء

عرض تخطيطي لتخليق الحمض النووي المستمر والمتقطع

تمديد الاشعال RNA يحدث عن طريق إضافة النيوكليوتيدات إلى 3' نهايات كليهما الحمض النووي خيوط في وقت واحد ، بحيث يحدث هذا النمو على حد سواء في 5'3' اتجاه فقط. في هذا التخطيطي ، فإن شوكة النسخ المتماثل (الترددات اللاسلكية) على أنه فتح إلى اليمين. في الأسفل قيادة حبلا ، التوليف مستمر بسبب تمديد واحد RNA يحدث التمهيدي دون انقطاع في شوكة النسخ حيث يستمر في الفتح إلى اليمين. في الجزء العلوي متخلفة حبلا ، التوليف متقطع، منذ الجديد RNA الاشعال يجب إضافته مع استمرار فتح تفرع النسخ المتماثل لكشف قالب جديد. ينتج عن هذا سلسلة من قطع Okazaki غير المتصلة.

في هذا الرسم البياني ، لاحظ أناليسار' و 'حق'، و 'أعلى' و 'قاععشوائية: الجزيء يمكن أن ينقلب رأسيًا أو أفقيًا. فقط 5'-3' تم إصلاح اتجاه الخيوط. لاحظ أيضًا أن المخطط يُظهر امتدادًا على أي من الخيطين يحدث كعمليتين منفصلتين ، منفصلتين عن الترددات اللاسلكية. حقيقة، الحمض النووي يحدث التوليف كعملية واحدة تشتمل على جزيء بوليميريز ثنائي الأبعاد يقع في الترددات اللاسلكية.


استنساخ الحمض النووي (التفاصيل الأساسية)

تُظهر هذه الرسوم المتحركة كيف يتم نسخ جزيء واحد من الحمض النووي مزدوج الشريطة إلى جزيئين من الحمض النووي المزدوج الشريطة.

يتضمن تكاثر الحمض النووي إنزيمًا يسمى هيليكاز يعمل على فك الحمض النووي المزدوج الشريطة. ثم تقوم الإنزيمات الأخرى بنسخ كل من الخيطين. يتم نسخ خصلة واحدة بشكل مستمر. يتم نسخ الشريط الآخر في أقسام. والنتيجة النهائية هي جزيئين DNA مزدوج الشريطة.

يعيد هذا الرسم المتحرك الحياة إلى العملية ، ويظهر تمثيلات ثلاثية الأبعاد للجزيئات المعنية. اعتمادًا على خلفيات الطلاب ، قد يكون من المفيد إيقاف الرسوم المتحركة مؤقتًا في نقاط مختلفة لتحديد الجزيئات ووصف تفاعلاتها.

تفاصيل

قاعدة ، هيليكاز ، حمض نووي ، نيوكليوتيد ، حبلا

المورد مرخص بموجب رخصة المشاع الإبداعي Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 ترخيص دولي. لا يتم منح أي حقوق لاستخدام أسماء أو شعارات HHMI أو BioInteractive بشكل مستقل عن هذا المورد أو في أي أعمال مشتقة.


شاهد الفيديو: DNA Replication شرح بالعربي (كانون الثاني 2023).