معلومة

لماذا لا يكون للنوكلياز الخارجي T5 نشاط نوكلياز داخلي في تجميع جيبسون؟

لماذا لا يكون للنوكلياز الخارجي T5 نشاط نوكلياز داخلي في تجميع جيبسون؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

يستخدم تجميع Gibson T5 نوكلياز خارجي لمضغ نهاية 5 'من dsDNA لتوليد البروزات. ومع ذلك ، تم الإبلاغ عن أن نوكلياز T5 ، على عكس نوكلياز لامدا الخارجي ، لديه نشاط نوكلياز داخلي ssDNA (https://www.neb.com/products/m0363-t5-exonuclease#tabselect0). لماذا لا يسبب مشاكل أثناء تجميع جيبسون؟ هل هذا فقط لأن هذه لا تسفر عن تجمعات قابلة للحياة؟ أم لأن هذا النشاط مثبط بطريقة ما ، مثل تركيز T5 منخفض جدًا؟


تعمل ظروف المخزن المؤقت المستخدمة في التفاعل أيضًا على التخفيف من تفاعل نوكلياز داخلي ، لذلك لا ينبغي أن تكون مشكلة إذا التزمت بالبروتوكولات تمامًا. لقد عملت على هذا الإنزيم منذ عام 1988 وكنت "المستنسخ" الأصلي للمنتج المفرط ، راجع http://www.sayers.staff.shef.ac.uk/fen/ للحصول على مزيد من المعلومات حول هذه الإنزيمات جون سايرز ، جامعة شيفيلد .


لم أقم في الواقع بتجميع Gibson ، لكن بالنظر إلى البروتوكولات على موقع New England Biolabs ، أعتقد أن الإجابة يجب أن تكون أن ssDNA الذي تعرضه نوكلياز T5 محمي بسرعة من نشاط نوكلياز ssDNA لأنه (المكشوف) DNA) مع التسلسل التكميلي على المكون الآخر لتفاعل التجميع. بعد ذلك ، يتم إصلاح أي فجوات وسدها بواسطة بوليميراز الحمض النووي وليجيز الحمض النووي. كل هذه الإنزيمات موجودة بالطبع في نفس الوقت في تفاعل التجميع من خطوة واحدة.

باختصار ، في ظل ظروف تفاعل التجميع ، فإن نشاط نوكلياز ssDNA منخفض المستوى للنوكلياز الخارجي T5 يتفوق ببساطة على التفاعلات الأخرى التي تحدث.


SRSF3 و SRSF7 يعدلان طول 3′UTR من خلال قمع أو تنشيط مواقع polyadenylation القريبة وتنظيم مستويات CFIm

يشير عديد الأدينيل البديل (APA) إلى الاختيار المنظم لمواقع عديد الأدينيل (PASs) في النصوص ، والتي تحدد طول مناطقها غير المترجمة 3 (3′UTRs). لقد أظهرنا مؤخرًا أن SRSF3 و SRSF7 ، وهما بروتينان SR مرتبطان ارتباطًا وثيقًا ، يربطان APA بتصدير mRNA. ظلت الآلية الكامنة وراء تنظيم APA بواسطة SRSF3 و SRSF7 غير معروفة.

نتائج

نحن هنا نجمع بين iCLIP و 3-end التسلسل ونجد أن SRSF3 و SRSF7 يربطان المنبع من PASs القريبة (pPASs) ، لكنهما يمارسان تأثيرات معاكسة على طول 3′UTR. يعزز SRSF7 استخدام pPAS بطريقة تعتمد على التركيز ولكن بشكل مستقل عن الربط من خلال تجنيد عامل الانقسام FIP1 ، مما يؤدي إلى توليد 3UTRs قصيرة. مجالات البروتين الفريدة لـ SRSF7 ، والتي تغيب عن SRSF3 ، تساهم في توظيف FIP1. في المقابل ، يعزز SRSF3 استخدام PAS (dPAS) البعيد وبالتالي 3′UTRs الطويلة مباشرة عن طريق مواجهة SRSF7 ، ولكن أيضًا بشكل غير مباشر عن طريق الحفاظ على مستويات عالية من عامل الانقسام Im (CFIm) عبر الربط البديل. عند استنفاد SRSF3 ، تنخفض مستويات CFIm ويتم تقصير 3′UTRs. تعتبر أهداف SRSF3 غير المباشرة حساسة بشكل خاص لمستويات CFIm المنخفضة ، لأن CFIm هنا يخدم وظيفة مزدوجة فهو يعزز dPAS ويمنع استخدام pPAS عن طريق الربط الفوري مع المصب وتجميع مجمعات الانقسام غير المنتجة ، والتي تعزز معًا 3 UTRs طويلة.

الاستنتاجات

لقد أظهرنا أن SRSF3 و SRSF7 هما معدلين مباشرين لاستخدام pPAS ونبين كيف يمكن للاختلافات الصغيرة في بنية المجال لبروتينات SR أن تمنح تأثيرات معاكسة على تنظيم pPAS.


المواد والأساليب

قليل النوكليوتيدات

تم شراء جميع oligonucleotides DNA من تقنيات DNA المتكاملة مع تنقية HPLC. تم إذابة قليل النوكليوتيدات في ماء من الدرجة PCR وتم قياس تركيزات الحمض النووي باستخدام مطياف NanoDrop 2000. يتم سرد تسلسل قليل النوكليوتيدات المستخدمة في هذا العمل في المعلومات التكميلية (الجدول التكميلي S1).

ظروف تجريبية

أجريت تجارب هضم الإنزيم عند 25 درجة مئوية. تم إجراء SELEX في درجة حرارة الغرفة (-20 درجة مئوية). أجريت تجارب قياس حراري معايرة متساوي الحرارة (ITC) عند 23 درجة مئوية. استخدمت التجارب مع كل aptamer مخازن التفاعل التالية: ATP aptamers (10 ملي مولار تريس - حمض الهيدروكلوريك ، الرقم الهيدروجيني 7.4 ، 10 ملي مولار MgCl2) ، MA aptamers (10 ملي تريس - حمض الهيدروكلوريك ، الرقم الهيدروجيني 7.4 ، 20 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي MgCl2) ، أبتامرات MMC (10 ملي تريس - حمض الهيدروكلوريك ، الرقم الهيدروجيني 7.4 ، 20 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.5 ملي MgCl2) ، SCA2.1 aptamer (10 ملي مولار تريس - حمض الهيدروكلوريك ، الرقم الهيدروجيني 7.4 ، 20 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.5 ملي MgCl2) ، والدوبامين أبتامير (محلول فوسفات 10 ملي مولار ، ودرجة الحموضة 7.4 ، 140 ملي مول كلوريد الصوديوم ، 4 ملي مول كلوريد ، 2 ملي مول كلوريد الصوديوم2). بالنسبة للتجارب التي تشتمل على نوكليازات خارجية ، تم تضمين 0.1 مجم / مل من الألبومين المصل البقري في محلول التفاعل. لعزل aptamer ، تم استخدام المخزن المؤقت التالي: 10 ملي مولار تريس - حمض الهيدروكلوريك ، الرقم الهيدروجيني 7.4 ، 20 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.5 ملي مولار MgCl2.

فحوصات هضم نوكلياز خارجية وتحليل الرحلان الكهربي للهلام

لجميع فحوصات الهضم ، تم خلط 1 ميكرولتر من 50 ميكرومتر من aptamer مع 44 ميكرولتر من محلول رد الفعل الذي يحتوي على التركيز المناسب للهدف. بعد الحضانة لمدة ساعة واحدة ، تمت إضافة 5 ميكرولتر من 2 U / ميكرولتر T5 Exo أو 5 ميكرولتر من خليط من 2 U / ميكرولتر T5 Exo و 0.15 U / ميكرولتر Exo I إلى المحلول. تم جمع كمية 5 ميكرولتر من خليط التفاعل في نقاط زمنية مختلفة وخلطها مع 15 ميكرولتر من محلول تحميل الفورماميد (75٪ فورماميد ، 10٪ جلسرين ، 0.125٪ SDS ، 10 ملي مول EDTA ، و 0.15٪ (وزن / حجم) زيلين سيانول ) لإخماد رد الفعل. ثم تم تحليل منتجات الهضم بواسطة 15٪ تغيير طبيعة هلام البولي أكريلاميد الكهربائي (PAGE). تم إجراء الفصل عند 20 فولت / سم لمدة 2.5 - 3.5 ساعة في محلول 0.5 × TBE. تم تلوين الجل بـ 1 × SYBR Gold لمدة 25 دقيقة وتم تصويره باستخدام نظام ChemiDoc MP Image (BioRad).

فحوصات صفيحة ميكروسكوبية للتنميط المستندة إلى نوكلياز خارجية

تم خلط كمية 1 ميكرولتر من 50 ميكرومتر MA-46 أو 50 ميكرومتر MMC1 أو 25 ميكرومتر SCA2.1 أو 25 ميكرومتر من أبتامير الدوبامين مع 44 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتفاعل الخاص بكل منهما الذي يحتوي على تركيز مناسب من يجند. بالنسبة لمنحنى المعايرة MA-46 ، تم استخدام 0 ، 25 ، 50 ، 100 ، 200 ، 400 و 800 ميكرومتر MDPV (التركيز النهائي). بالنسبة لتجارب التنميط aptamer-ligand ، تم استخدام 400 أو 200 أو 50 أو 200 ميكرومتر من يجند لـ MA-46 أو MMC1 أو SCA2.1 أو أبتامير الدوبامين على التوالي (التركيز النهائي) تم تضمين عناصر التحكم الخالية من الترابط أيضًا. لفحص ميفيدرون ملزمة MMC aptamers ، تم استخدام 0 أو 200 ميكرومتر ميفيدرون (التركيز النهائي). تم تحضين الأبتامر والليغند لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، تمت إضافة 5 ميكرولتر من خليط يحتوي على 2 U / ميكرولتر T5 Exo و 0.15 وحدة / ميكرولتر Exo I إلى المحلول. تم تسجيل دورة زمنية من التألق لمدة 1.5 ساعة لـ MA-46 ، 4 ساعات لـ MMC1 ، 3 ساعات لـ SCA2.1 أو 2.5 ساعة لأبتامر الدوبامين عن طريق خلط 5 ميكرولتر من خليط التفاعل الذي تم جمعه في نقاط زمنية مختلفة مع 25 ميكرولتر من محلول تبريد (1.2 × SYBR Gold ، 12 ملي مولار Tris – HCl (pH 7.4) ، 3.75 ملي مول EDTA ، و 48٪ (حجم / حجم) فورماميد) محمّل مسبقًا في آبار صفيحة ميكروسكوبية سوداء 384 بئر. تم الحصول على أطياف انبعاث الإسفار من 500 إلى 800 نانومتر وانبعاث عند 545 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية Tecan M1000 Pro مع إثارة 495 نانومتر. تم قياس مقاومة aptamer للهضم (قيمة المقاومة) باستخدام المعادلة (AUC1 - الجامعة الأمريكية بالقاهرة0) / الجامعة الأمريكية بالقاهرة0 حيث الجامعة الأمريكية بالقاهرة1 والجامعة الأمريكية بالقاهرة0 هي المناطق الواقعة تحت منحنى مخططات الدورة الزمنية الفلورية مع وبدون ترابط ، على التوالي. تم حساب التفاعل المتبادل باستخدام المعادلة (AUCإل - الجامعة الأمريكية بالقاهرة0) / (AUCتي - الجامعة الأمريكية بالقاهرة0) × 100 حيث الجامعة الأمريكية بالقاهرةإل والجامعة الأمريكية بالقاهرةتي هي مقاومة هضم الأبتامر في وجود يجند معين والهدف الرئيسي للأبتامر (MDPV لـ MA-46 ، mephedrone لـ MMC1 ، MDPV لـ SCA2.1 ، والدوبامين للأبتامر المرتبط بالدوبامين) ، على التوالي.

تحديد التفاعل المتبادل عن طريق مقايسة مضان حبلا الإزاحة

أولاً ، لتحسين تركيز خيط الحمض النووي التكميلي لإخماد مضان الأبتامر بنسبة 90٪ ، 40 ميكرولتر من التركيزات المختلفة (التركيزات النهائية: 0 ، 12.5 ، 25 ، 50 ، 100 ، 200 ، 400 نانومتر) من الحمض النووي التكميلي 15 نانومتر تم تحضين الخيط المسمى بـ 3′-dabcyl (يُطلق عليه dab-15) بـ 40 ميكرولتر 5 ميكرولتر MA-46 (MA-FAM) المسمى بالفلورسين في مخزن مؤقت للتفاعل عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. بعد ذلك ، تم تبريد المحلول لأكثر من 30 دقيقة إلى درجة حرارة الغرفة. تم تحميل كمية 75 ميكرولتر من هذا المحلول في آبار صفيحة ميكروسكوبية سوداء 384 بئر. تم تسجيل أطياف انبعاث الإسفار من 510 إلى 800 نانومتر مع الإثارة عند 495 نانومتر. في ظل الظروف المُحسَّنة ، تم تحضين محلول 75 ميكرولتر يحتوي على MA-FAM و dab-15 (التركيزات النهائية 50 و 100 نانومتر ، على التوالي) المذاب في محلول التفاعل عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم تبريده إلى درجة حرارة الغرفة على مدى 30 دقيقة. . بعد ذلك ، تمت إضافة 5 ميكرولتر من يجند (التركيز النهائي: 400 ميكرومتر) إلى المحلول واحتضانها لمدة 30 دقيقة. تم تحضير محلول خالي من الترابط كعنصر تحكم. بعد ذلك ، تم تحميل 75 ميكرولتر من المحلول في آبار صفيحة ميكروسكوبية سوداء 384 بئر. تم تسجيل أطياف انبعاث التألق من 510 إلى 800 نانومتر مع إثارة 495 نانومتر. تم حساب كسب الإشارة باستخدام المعادلة (FF0)/F0، أين F و F0 تمثل شدة التألق في وجود وغياب يجند ، على التوالي. تم حساب التفاعل المتبادل باستخدام المعادلة (سإل/ستي) × 100 أين ستي هو كسب الإشارة الناتج عن الهدف الرئيسي من aptamer (MDPV) و سإل هو كسب الإشارة الناتج عن ترابط معين.


استكشف حل البحث العلمي الخاص بنا لدراسة COVID-19

أنواع المنتجات

نحن نقدم الحلول المثلى لأبحاث علوم الحياة

تخليق الحمض النووي هو تقنية تربط أحماض ديوكسينوكليك (الأدينين ، الثايمين ، السيتوزين والجوانين) معًا لتشكيل الحمض النووي. باعتباره حجر الزاوية في علم الأحياء الجزيئي الحديث ، يلعب تخليق الحمض النووي دورًا محوريًا في مجال البيولوجيا التركيبية. بالإضافة إلى توليف oligos القياسي ، فإننا نقدم أيضًا خدمات البحث العلمي مثل تخليق oligos الطويل ، وتخليق oligos (S-Oligo) ، وتخليق oligos المعدل ، وتخليق oligos الفلوري ، وتحقيقات PCR الكمية في الوقت الفعلي لتلبية احتياجاتك المختلفة.

يتم تصنيع الببتيدات عن طريق تفاعل التكثيف لمجموعة الكربوكسيل لحمض أميني واحد مع مجموعة أمينية من حمض أميني آخر وتستخدم على نطاق واسع في مجالات مختلفة مثل تحضير الأجسام المضادة وتطوير الأدوية وتطوير لقاح متعدد الببتيد. كل من البولي ببتيدات لدينا مصحوبة ببيانات موثوقة HPLC وقياس الطيف الكتلي ، ويتم توفير تقارير توليفية مفصلة ، ويتم إرسال المنتجات في حالة مجففة بالتجميد. يمكن للموظفين ذوي الخبرة مساعدة المستخدمين في تصميم سلاسل الببتيد وتقديم التوصيات المناسبة للاحتياجات المختلفة للمستخدمين ، مثل الأجسام المضادة ، والعلامات الخاصة ، والتوليف على نطاق واسع ، إلخ. بالإضافة إلى ذلك ، نقدم أيضًا تخليق PNA المخصص بجودة عالية.

مكتبة الببتيد هي تقنية جديدة لدراسة العلاقة بين البنية والوظيفة للبروتين. تحتوي مكتبة الببتيد على عدد كبير من الببتيدات التي تحتوي على مزيج منهجي من الأحماض الأمينية. توفر مكتبة الببتيد أداة قوية لتصميم الأدوية ، وتفاعلات البروتين البروتين ، وغيرها من التطبيقات الكيميائية الحيوية وكذلك الصيدلانية. كما أن لديها تطبيقات واسعة في فحص الأدوية ، والتحقق من صحة الهدف ، ورسم خرائط الحاتمة ، وتطوير اللقاح.

التوليف الجيني هو تقنية تُصنِّع الجينات بطرق اصطناعية ، وهي إحدى وسائل اكتساب الجينات. بالمقارنة مع اكتساب الجينات من الكائنات الحية الموجودة ، لا يحتاج التوليف الجيني إلى قوالب وبالتالي لا يقتصر على مصدر الجينات. نحن نستخدم برنامجًا فريدًا لتصميم التوليف الجيني ، والذي يتضمن مجموعة كاملة من الأدوات لتصميم وحدات هيكلية مثالية ، وبالتالي تمكين بناء الجينات وتوليفها بشكل سريع وفعال في تفاعل واحد. من فضلك لا تكون مقيدًا بمواقع التقييد والروابط المتعددة ، سنقوم بتوليف التسلسلات الجينية المختلفة التي تحتاجها.

تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) هو طريقة مستخدمة على نطاق واسع في البيولوجيا الجزيئية ، والتي يمكنها تكرار الملايين إلى المليارات من عينات الحمض النووي المحددة بسرعة ، مما يتيح للعلماء استخراج كمية صغيرة فقط من عينات الحمض النووي لإجراء بحث مفصل. نحن نقدم مجموعة متنوعة من بوليميرات الحمض النووي (Taq ، Bst ، Pfu) ومزيجات تفاعل البوليميراز المتسلسل المقابلة ، تغطي مجموعة واسعة من السيناريوهات مثل الدقة العالية ، والخصوصية العالية ، والتضخيم السريع. توفر مجموعات سلسلة Scarlet ™ حلاً مثاليًا لتفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل المباشر للدم ، وتستخدم مجموعة التنميط الجيني PrimeSNP ™ طريقة تفاعل البلمرة المتسلسل التنافسي Allele Specific PCR للتنميط الجيني لعينات الحمض النووي المنقى. يتم أيضًا توفير dNTPs و NTPs عالية الجودة (مجموعة ، مزيج).

تمت دراسة الحمض النووي الريبي (RNA) ، باعتباره مادة أساسية لنقل المعلومات الجينية وتنظيم الخلايا ، على نطاق واسع في علم الأحياء الجزيئي. مثل الحمض النووي ، يتم تجميع الحمض النووي الريبي في شكل سلاسل نيوكليوتيد ولكن بخلاف الحمض النووي ، يوجد الحمض النووي الريبي في الطبيعة في شكل طيات أحادية الجديلة بدلاً من الخيوط المزدوجة المزدوجة. نحن نقدم RNasin (مثبط RNase) و M-MLV العكسي لتوفير حل كامل للمواد الخام لأبحاث الحمض النووي الريبي. تم تصميم سلسلة miAnalysis ™ للبحث الكمي في microRNA. وسلسلة VirusMag ™ مصممة لعزل الحمض النووي الريبي / الحمض النووي الفيروسي أو الحمض النووي البكتيري.

في SBS Genetech ، نحن في طليعة تقديم حلول للتضخيم متساوي الحرارة على أساس منصتنا ذات المستوى العالمي. يقع Bst DNA / RNA Polymerase في قلب هذه المنصة ، وهو مزيج من بوليميراز Bst ونسخة عكسية شديدة الثبات للحرارة. بناءً على هذا الإنزيم الخاص ، قمنا بتطوير سلسلة ميكروبيدات تضخيم متساوي الحرارة مجففة بالتجميد PrimeIamp TM. هذه السلسلة عبارة عن مزيج رئيسي جاهز للاستخدام ، والذي يمكنه إجراء تضخيم متساوي الحرارة مباشرةً عند إضافة القوالب والبرايمر. مع تقنية التجفيف بالتجميد ، يتم تجميد هذه الخلطات الرئيسية بالتجميد في ميكروبيدات صلبة ، والتي يمكن نقلها وتخزينها في درجة حرارة الغرفة براحة كبيرة.

أصبحت تقنية إسكات الحمض النووي الريبي أداة قوية لدراسة وظيفة الجينات. يعتمد نجاح أي تجربة RNA على جودة عالية من siRNA وكاشف تعداء فعال. مع التعديل الكيميائي ، تتمتع siRNA المعدلة كيميائيًا باستقرار أعلى بكثير من siRNA الشائع. لا يؤدي التعديل الكيميائي إلى تحسين عمر سيرنا في المصل وزراعة الخلايا فحسب ، بل يعزز أيضًا نشاطها في المختبر. بالنسبة إلى كاشف تعداء العدوى ، يمكن استخدام كاشف تعداء siRNA الجاهز للاستخدام ، Sirnafectamine ، لمجموعة واسعة من خطوط الخلايا ، مع الحد الأدنى من السمية الخلوية وأفضل حالة خلوية بعد تعداء العدوى. نظرًا لأن Sirnafectamine سيحمي الحمض النووي الريبي أثناء العملية برمتها ، فإن التركيز المنخفض جدًا من siRNA يمكن أن ينتج كفاءة عالية في إسكات الجينات.

تعد تنقية الحمض النووي مكونًا مهمًا في البيولوجيا الجزيئية ولها مجموعة واسعة من التطبيقات في الطب والعلوم البيولوجية. تستخدم مجموعة تنقية الحمض النووي الخاصة بنا تقنية عمود هلام السيليكا من الدرجة الأولى (SiMax ™ Spin Column و SiMax ™ Genomic DNA Extraction و SiMax ™ PCR Products / Agarose Gel Purification و SiMax ™ Plasmid DNA Miniprep) وتقنية الخرز المغناطيسي (الخرز المغناطيسي VirusMag ™ ، الفواصل المغناطيسية VSep ™ ، مجموعة عزل DNA / RNA بخطوة واحدة VirusMag ™ ، مجموعة عزل DNA / RNA من VirusMag) ، والتي يمكنها تنقية الحمض النووي من مصادر مختلفة بسرعة وبشكل موثوق. نقاء الحمض النووي المنقى بواسطة مجموعتنا مرتفع للغاية وهو مناسب للعديد من التطبيقات النهائية مثل تحديد التسلسل والاستنساخ والانقسام.

تُستخدم علامات الحمض النووي لتحديد الحجم التقريبي للجزيئات الموجودة على الهلام أثناء الرحلان الكهربائي ، بناءً على مبدأ أن الوزن الجزيئي يتناسب عكسيًا مع التنقل عبر مصفوفة الهلام. نحن نقدم معايير وزن جزيئي وفيرة للحمض النووي والتي يمكن استخدامها لأطوال أجزاء مختلفة. تمت تنقية شظايا علامات الحمض النووي الخاصة بنا بشكل منفصل عن طريق تقنية خاصة ، لذا فإن جودتها تتفوق على معايير الصناعة.

كريسبر (جمشتهى رعلى سبيل المثال أنامتباعد سهورت صأليندروميك رepeats) هي عائلة من تسلسلات الحمض النووي الموجودة في جينومات الكائنات بدائية النواة مثل البكتيريا والعتائق. تشتمل تقنية تحرير الجينات القائمة على هذا النظام على مجموعة متنوعة من التطبيقات. هنا ، نقدم العديد من نوكليازات Cas ، و sgRNAs الاصطناعية ، و T7 Endonuclease I بجودة عالية لتحسين دقة وكفاءة تجاربك.


نتائج

حذف واستبدال مواقع التقييد باستخدام "حذف جيبسون"

تجميع جيبسون هو تقنية استنساخ قوية تسمح بالتجميع بدون ترك أثر لقطع من الحمض النووي ذات التسلسلات المتماثلة [4]. هنا تحدنا طريقة الاستنساخ هذه لتجميع قطع الحمض النووي مع التسلسلات المتماثلة الموجودة في عدد محدد من القواعد بعيدًا عن نهاية الحمض النووي (الشكل 1). باستخدام هذا النهج ، سيتم إنشاء رفرف من التسلسل غير المتماثل وإزالته على الأرجح بواسطة نشاط نوكلياز خارجي 3′- & GT 5 لبوليميراز Phusion الموجود في مزيج Gibson (الشكل 1g و h). ثم يتم سد الفجوة وربطها ، مما يؤدي إلى فقدان الحمض النووي بين التسلسلات المتماثلة ونهاية الحمض النووي. اختبرنا هذا النهج باستخدام بلازميد صغير ومنخفض التعقيد (pUC19) وحاولنا حذف موقع تقييد (Kpnأنا/Acc65I) واستبدالها بأخرى مختلفة (AflII) (الشكل 2). لاختبار ما إذا كان حذف جيبسون يظهر تحيزًا واضحًا تجاه تراكب معين ، استخدمنا إنزيمين يتعرفان على تسلسل الحمض النووي نفسه ولكننا ننتج نتوءات معاكسة (نيوسكيزومرات): 5 ′ متدلية مع Acc65 أنا و 3 معلقة مع Kpn1. تقطع هذه الإنزيمات البلازميد في الطرف الخامس من إنزيم β-galactosidase المشفر ، والذي استخدمناه لفحص منتجات الاستنساخ. استبدلنا Kpnأنا/Acc65 أنا موقع مع Aflموقع II باستخدام حذف جيبسون. على وجه الخصوص ، استخدمنا قطع الحمض النووي المزدوجة حبلا (أوليجوس الملدنة) بالإضافة إلى أوليجوس أحادية الخيط كحمض نووي مانح للتجميع. يحتوي الحمض النووي للمانح على موقع تقييد AflII محاطًا بـ 20 نيوكليوتيد على كل جانب ، متماثل مع DNA pUC19 ، يحيط بـ Kpnأنا/Accموقع 65I (الشكل 2 أ ، مربعات حمراء وصفراء). تم اختبار كل من التوجهات الأمامية والعكسية عندما استخدمنا الحمض النووي للمتبرع بحبل واحد (الشكل.2 ب).

مقارنة بين مجموعة حذف جيبسون وجيبسون الكلاسيكية. أثناء تفاعل جيبسون ، يمكن أن تتحد قطعتان من الحمض النووي الخطي مع متواليات متماثلة في نهايتها لتشكيل DNA مُجمَّع (اللوحة اليسرى). نوكلياز خارجي (T5) 5′- & gt 3 يمضغ نهايات الحمض النووي ويعرض التسلسل المتماثل (الخطوط البرتقالية والصفراء) ثم يكون قادرًا على الصلابة (أ-ب). يمتد بوليميراز DNA Phusion DNA من النهايات الثلاثية (ج) وسوف يقوم Taq ligase بربط النكات (د). حذف جيبسون (اللوحة اليمنى) هو تطبيق بديل لطريقة تجميع جيبسون الكلاسيكية التي تستفيد من وجود تسلسلات متماثلة عدة قواعد بعيدًا عن نهايات الحمض النووي (ه الأحمر والأصفر = DNA متماثل أزرق وبني = DNA غير متماثل). هذا يسمح بحذف التسلسلات غير المتماثلة وتجميع القطعتين الخطيتين (F-ح). الحمض النووي الذي تم إنشاؤه (ز، الخط البني) على الأرجح بواسطة نشاط نوكلياز خارجي 3′- & GT 5 لبوليميراز Phusion في مزيج Gibson والنيكل المملوء والمربوط

اختبار حذف جيبسون. أ تم قطع البلازميد pUC19 مع Kpnأنا أو Accتم استبدال 65I ومواقع التقييد الموجودة في نهاية 5 من جين β-galactosidase بـ AflII موقع التقييد باستخدام حذف جيبسون. تمثل المربعات الحمراء والصفراء التسلسلات المتماثلة لـ 20 نيوكليوتيد لكل منها. يتم عرض صورة لمستعمرات بكتيريا زرقاء (من المحتمل أن يكون حذف جيبسون ناجحًا) والأبيض (حذف جيبسون غير ناجح) تم تحويلها باستخدام منتجات حذف جيبسون. ب في المخططات اليسرى ، يتم عرض الحمض النووي المضاف إلى كل تفاعلات حذف جيبسون. يوضح الجدول عدد المستعمرات البيضاء أو الزرقاء بعد التحول والطلاء لكل تفاعل حذف جيبسون. تم الإبلاغ عن عدد النسخ الصحيحة بعد القطع التشخيصي وتسلسل Sanger في الأعمدة الأخيرة. يتم عرض نتائج تجربتين مستقلتين

لتحديد ما إذا كان حذف جيبسون قد حدث بشكل صحيح ، أجرينا أولاً ملاحظة نوعية للمستعمرات المطلية على وسائط مكملة بـ X-gal ، وهي ركيزة من إنزيم β-galactosidase. لأننا استبدلنا موقع واحد لتقييد النوكليوتيدات 6 (Kpnأنا/Acc65I) مع موقع مختلف لتقييد النوكليوتيدات 6 (AflII) ، ظل إنزيم β-galactosidase نشطًا على الرغم من التغيير الصغير في تسلسل النوكليوتيدات. وبالتالي ، يجب أن تظهر المستعمرات التي تعبر عن بلازميد مع حذف جيبسون الصحيح باللون الأزرق ، حيث يعالج إنزيم β-galactosidase ركيزة X-gal (الشكل 2 أ). ثم أجرينا قطعًا تشخيصية للحمض النووي باستخدام Kpnانا و Aflثانيًا. لتبسيط المراقبة المباشرة لنطاقات الحمض النووي الصحيحة على مادة هلامية أجريناها Aflالثاني أو Kpnأنا هضم مع XmnI (ملف إضافي 2: الشكل S1). تم أيضًا تسلسل مجموعة فرعية من المنتجات الناجحة Sanger للتحقق من التجميع الصحيح.

تم إجراء حذف Gibson مع قطع المتجه باستخدام Kpnأنا (الشكل 2 ب ، العلاج 1 ، 3 ، 5 ، 7) أو Acc65I (الشكل 2 ب ، العلاج 2 ، 4 ، 6 ، 8) في وجود الفوسفاتاز القلوي المعوي (CIP). تم استخدام oligos الملدنة التكميلية (الشكل 2 ب ، العلاج 3 و 4) أو أوليجوس الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل (الشكل 2 ب ، العلاج 5-8) كدنا مانح. كعناصر تحكم ، تم استخدام نواقل القطع لحذف جيبسون في غياب DNA المتبرع (الشكل 2 ب ، العلاج 3 ، 5 ، 7) ، أو تم تحويل نواقل القطع نفسها مباشرة إلى خلايا مختصة دون تفاعل جيبسون. هذا العلاج الأخير هو أفضل تحكم لأنه يسمح بقياس البلازميد غير المقطوع الموجود في تفاعل جيبسون.

أظهرت النتائج أن حذف جيبسون هو طريقة استنساخ فعالة للغاية ، حيث كانت المستعمرات زرقاء بشكل ساحق (أكثر من 94٪ لجميع الظروف الشكل 2) وكانت الخلفية من البلازميد غير المقطوع (التحويل المباشر للبلازميد المقطوع) منخفضة للغاية. علاوة على ذلك ، فإن معظم المستعمرات التي تم تحليلها تظهر الاستبدال الصحيح لـ Kpnأنا موقع بامتداد Aflالموقع الثاني (الشكل 2 ب الجدول والملف الإضافي 2: الشكل S1). علاوة على ذلك ، لاحظنا عدم تفضيل 5 ′ على 3 ′ متراكمة لحذف جيبسون (الشكل 2 ب ، المعالجات 3 ، 5 ، 7 مقابل 4 ، 6 ، 8). ومن المثير للاهتمام ، أن oligos المفردة التي تقطعت بها السبل ، مع عدم وجود تفضيل تجاه الخيط الأمامي أو العكسي ، تكون فعالة مثل oligoes الملدنة المزدوجة التي تقطعت بها السبل عند استخدامها كدنا مانح (الشكل 2 ب ، العلاج 3،4 مقابل 5-8).

يعد تحويل موقع تقييد إلى موقع مختلف ضروريًا في بعض الأحيان لجعل موقع تقييد فريدًا أو لإنشاء موقع تقييد فريد جديد مناسب لاتباع خطوات الاستنساخ. غالبًا ما تتطلب هذه المهام التي تبدو سهلة ، إجراءً شاقًا باستخدام إجراءات الاستنساخ القياسية. لذلك قمنا باختبار نهج Gibson Deletion الخاص بنا لهذه التطبيقات باستخدام pUC19 plasmid الذي يحتوي على اثنين Pvuالثاني مواقع وثلاثة نسبأنا المواقع. تم إجراء حذف جيبسون باستخدام أوليجوس خصلة واحدة من شأنها الحفاظ على واحد Pvuموقع II وقم بتحويل الموقع الثاني إلى ملف Aflالموقع الثاني (الشكل 3 أ ، اللوحة العلوية). تم قطع الناقل طوال الليل باستخدام PvuII في وجود الفوسفاتيز المعوي للعجول (CIP) وتم تنقية منتج الهضم ببساطة على عمود تنقية وتركيز PCR. تم إجراء حذف جيبسون في تفاعل واحد يخلط متجه القطع المنقى وأوليغنوكليوتيد الحمض النووي الفرديين مع مزيج تفاعل جيبسون (الشكل 3 ب والملف الإضافي 3: الشكل S2).

استخدام حذف جيبسون لتغيير أو حذف أو الاحتفاظ بموقع محظور. أ رسم تخطيطي لمجموعتي التغييرات التي تم إدخالها في pUC19 باستخدام حذف جيبسون: أعلى = صنع PvuII موقع فريد يغير موقعًا إلى ملف Aflالثاني الموقع والمحافظة على الآخر PvuII موقع القاع = صنع نسبأنا موقع فريد يحذف موقعًا ، ويحافظ على موقعًا ثانيًا ويغير موقعًا ثالثًا نسبأنا موقع في ملف Aflالموقع الثاني. ب النتائج من الاستنساخ المصورة في أ

تم تنفيذ إجراء مماثل باستخدام عمود منقى نسبأنا pUC19 ناقلات وقليل حبلا واحد من شأنه أن يحافظ على واحد نسبأنا موقع القضاء على الثانية نسبأنا موقع ، وتحور الثالث نسبأنا موقع في ملف Aflالموقع الثاني (الشكل 3 أ الألواح السفلية). للتحقق من التجميع الصحيح ، قمنا بعزل الحمض النووي وقطعناه Pvuالثاني و Xmnأنا أو Aflالثاني و Xmnأنا من أجل pUC19 مع التغيير PvuII المواقع (المجموعة 1) ، ومع نسبانا و نديأنا أو Aflالثاني و Xmnأنا من أجل pUC19 مع التغيير نسبأنا المواقع (المجموعة 2). من بين المستعمرات التسعة عشر التي تم تحليلها ، أظهرت 4 مستعمرات التجميع الصحيح للمجموعة 1 من المستعمرات الـ 13 التي تم تحليلها ، وأظهرت 9 مستعمرات أنماط هضم صحيحة للمجموعة 2. لقد تحققنا أيضًا من التجميعات من خلال تسلسل سانجر الذي أظهر معظم التجمعات الصحيحة (الشكل 3 ب والملف الإضافي 3: الشكل S2).

بشكل عام ، أظهرنا أنه يمكن أيضًا تطبيق تجميع Gibson على الحمض النووي الذي يحتوي على متواليات متماثلة لا تحيط مباشرة بنهاية الحمض النووي. هذا النهج ، المسمى "حذف جيبسون" ، ينتج بكفاءة الحمض النووي المجمّع المستنفد من المناطق غير المتجانسة بين التسلسلات المتجانسة ونهاية الحمض النووي. لذلك يمكن استخدام حذف جيبسون لتغيير مواقع القيود أو صيانتها أو إزالتها بسهولة وفعالية.

حذف كمية متزايدة من الحمض النووي باستخدام حذف جيبسون

أظهرنا أن حذف جيبسون يسمح بحذف / استبدال موقع التقييد. ثم نهدف إلى اختبار مقدار الحمض النووي الذي يمكن حذفه باستخدام حذف جيبسون. تحقيقا لهذه الغاية ، تم تصميم تسعة أوليجوس من الحمض النووي من متبرع منفرد تقطعت بهم السبل ، مع كل منها يحتوي على متواليات متماثلة مع ناقل المتلقي عند زيادة عدد النيوكليوتيدات بعيدًا عن نهاية الحمض النووي (الشكل 4 أ). تم تصميم هذه oligos لحذف 0 (تكامل دقيق للتسلسلات المرافقة لـ Kpnأنا موقع استبدلت للتو بامتداد Aflالموقع الثاني) ، 5 ، 10 ، 15 ، 20 ، 25 ، 30 ، 40 ، 50 ، و 100 نيوكليوتيدات من كل طرف Kpnقطعت (الشكل 4 أ). كل قلة أيضا تحل محل Kpnأنا موقع بامتداد Aflالموقع الثاني (الشكل 4 أ). كعنصر تحكم ، تم استخدام ناقل القطع في غياب DNA المتبرع لتفاعل جيبسون. لإجراء أول اختبار نوعي لنجاح التجميع ، قمنا بإحصاء عدد المستعمرات التي نمت على ألواح الوسائط المكملة بالمضادات الحيوية المناسبة للاختيار (كاربينيسيلين). يشير عدد كبير من المستعمرات الموجودة على اللوحة إلى احتمالية أعلى لنجاح تفاعل جيبسون ، حيث يعني هذا أن المُدخل والناقل قد تم تجميعهما (الشكل 4 ب و ج). يتم دعم هذا الافتراض من خلال العدد المحدود من المستعمرات الموجودة على لوحة التحكم بعد تحويل ناقل القطع فقط (خلفية البلازميد غير المقطوع). لتحليل أكثر شمولاً للتجميع الصحيح ، تم اختيار 8 مستعمرات من كل لوحة ، وعزل الحمض النووي وقطعه بكلتا الطريقتين. Kpnانا و Aflالثاني لتحديد ما إذا كان Aflتم استبدال موقع II بشكل صحيح بـ Kpnأنا موقع على رد فعل جيبسون الناجح (الشكل 4 د ، هـ وملف إضافي 4: الشكل S3). من التجميعات الناجحة ، تم تسلسل اثنين إلى خمسة منها Sanger لتأكيد التجميع الصحيح.

زيادة عمليات الحذف باستخدام تفاعل جيبسون. أ تم قطع البلازميد pUC19 مع Kpnتم استبدال أنا وموقع التقييد هذا بـ Aflموقع II باستخدام حذف جيبسون. تم استخدام oligos واحد الذين تقطعت بهم السبل كما AflII DNA المتبرع بالموقع لتفاعل جيبسون. تم تصميم قليل النوكليوتيدات المستخدمة لحذف 0 ، 10 (5 على كل جانب) ، 20 (10 على كل جانب) ، 30 (15 على كل جانب) ، 40 (20 على كل جانب) ، 50 (25 على كل جانب) ، 60 (30 على كل جانب) و 80 (40 على كل جانب) و 100 (50 على كل جانب) و 200 (100 على كل جانب) نيوكليوتيدات تحيط Kpnأنا/Aflالثاني المواقع. تمثل الخطوط والمربعات الحمراء والصفراء متواليات متجانسة من 20 nt على قليلات النوكليوتيدات المفردة التي تقطعت بها السبل (خطوط صفراء وحمراء) وعلى المتجه (المربعات الصفراء والحمراء). ب-ج بعد تفاعل جيبسون ، تم تحويل كل عينة وتم طلاء 1/10 أو 9/10 من البكتيريا المحولة على ألواح LB مكملة بالكاربينيسيلين. يوضح الجدول عدد المستعمرات المتنامية لكل تفاعل ممثلة أيضًا في الرسم البياني الشريطي في ج. د-ه عدد النسخ الصحيحة بعد القطع التشخيصي Kpnانا و Aflالثاني (د) أو بعد تسلسل Sanger لمجموعة فرعية من العينات (ه)

تظهر نتائج القطع التشخيصي (ملف إضافي 4: الشكل S3) أنه مع حذف عدد أكبر من النيوكليوتيدات من طرفي الحمض النووي للناقل ، فإن تفاعل حذف جيبسون ، كما هو متوقع ، ينخفض ​​في الكفاءة ، حتى لو كان جيدًا لا يزال من الممكن العثور على كمية (66 مستعمرة) من المستعمرات تنمو على أطباق مع الانتقاء بعد حذف 200 نيوكليوتيد (100 من كل جانب من المستعمرات الجديدة). Aflموقع التقييد الثاني) (الشكل 4 ب و ج). بعد قطع التشخيص وتقدير Kpnأنا-Aflأظهر الاستبدال الثاني ، حذف ما يصل إلى 100 نيوكليوتيد (50 على كل جانب) معدل نجاح يزيد عن 75٪ (باستثناء حذف 60 نيوكليوتيد الذي أظهر في التجربة المقدمة معدل نجاح 37.5٪ فقط ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى صغر حجم العينة ) (الشكل 4 د). عندما تمت محاولة حذف 200 نيوكليوتيد ، تم عرض 2 فقط من أصل 8 استنساخ Kpnأنا-AflII الاستبدال (معدل نجاح 25٪). يشير هذا إلى أن حذف أكثر من 100 نيوكليوتيد (50 من كل جانب) بواسطة Gibson Deletion له كفاءة أقل.

الحمض النووي الذي أظهر Kpnأنا-Aflتم استبدال تسلسل Sanger لتأكيد حدوث تجميع Gibson الصحيح. أظهر تسلسل سانجر أنه لم يكن صحيحًا بالضرورة أنه كلما تم حذف المزيد من الحمض النووي ، قل عدد الأخطاء التي أدخلتها الجمعية. بالنسبة إلى عمليات حذف النيوكليوتيدات 10 (5 على كل جانب) و 20 (10 على كل جانب) و 60 (30 على كل جانب) و 100 (50 على كل جانب) ، تم العثور على اثنين على الأقل من النسخ المتسلسلة لديها التسلسل الصحيح . غالبًا ما كانت التجميعات غير الصحيحة غير صحيحة بسبب النيوكليوتيدات المحذوفة الإضافية قبل أو بعد الإدخال Aflالموقع الثاني. ومع ذلك ، أظهر كلا النسختين المتسلسلة للحذف الأكثر شمولاً (200 نيوكليوتيدات حول قطع التقييد) التجميع الصحيح (الشكل 4 هـ).

بشكل عام ، تُظهر هذه النتائج أنه يمكن حذف مئات النيوكليوتيدات بسهولة حول موقع تقييد باستخدام DNA خيط واحد في تفاعل حذف Gibson. كما هو متوقع ، لوحظ انخفاض في الكفاءة في التفاعلات التي تهدف إلى حذف أكثر من 100 نيوكليوتيد.

حذف كمية متزايدة من الحمض النووي والإدخال المتزامن للحمض النووي المعقد

لاختبار كفاءة حذف جيبسون باستخدام الحمض النووي الأكثر تعقيدًا كحمض نووي متبرع بدلاً من قليل النوكليوتيدات القصير ، أجرينا تجميع جيبسون باستخدام كاسيت لتعبير RFP (بروتين الفلورسنت الأحمر). تم إجراء PCR لشريط طلب تقديم العروض باستخدام قالب بلازميد وأشعال تحتوي على أذرع متجانسة مكملة للحمض النووي الذي يحيط بـ Kpnأنا موقع على البلازميد pUC19. تم تصميم العديد من البادئات لحذف كميات متزايدة من الحمض النووي الذي يحيط بـ Kpnأنا موقع على رد فعل حذف جيبسون (الشكل 5 أ وملف إضافي 1). يمكن فحص المستعمرات البكتيرية التي تعبر عن كميات عالية من بروتين RFP (مثل التعبير عن البلازميدات ذات عدد النسخ العالي مثل pUC19) بسهولة كمستعمرات حمراء على الألواح لهذا السبب تم اختيار كاسيت RFP كطريقة بسيطة لفحص المستعمرات التي تعبر عن البلازميدات المجمعة مع تفاعل جيبسون الصحيح (الشكل 5 ب). إدخال كاسيت طلب تقديم العروض والحذف المتزامن لما يصل إلى 60 نيوكليوتيد يحيط بـ Kpnأنا موقع التقييد (30 نيوكليوتيد على كل جانب من Kpnالموقع الأول) باستخدام حذف جيبسون أنتج أكثر من 90٪ مستعمرات حمراء (الشكل 5 ج). ومع ذلك ، من أجل حذف 200 نيوكليوتيد (100 على كل جانب) ، نمت عدد قليل من المستعمرات المحولة على ألواح الانتقاء وكانت 8.3٪ فقط من المستعمرات حمراء (الشكل 5 ج).

حذف كمية متزايدة من الحمض النووي والإدخال المتزامن للحمض النووي المعقد. أ رسم تخطيطي لنهج التجميع المتبع للتجارب المعروضة. تم قطع البلازميد pUC19 Kpnتم تقديم I و RFP إلى ناقل القطع باستخدام مجموعة Gibson. تم إنتاج الإدخالات المختلفة باستخدام PCR ، كل منها يستخدم بادئات مختلفة بأضرار متماثلة مختلفة لحذف كميات متزايدة من النيوكليوتيدات حول Kpnأنا الموقع عند رد فعل حذف جيبسون. تم تصميم أشرطة طلب تقديم العروض بحيث تحتوي على 20 نيوكليوتيدات للتماثل مع البلازميد (ممثلة بالخطوط والمربعات الحمراء والصفراء). تم تصميم بادئات RFP لحذف 0 ، 10 (5 على كل جانب) ، 20 (10 على كل جانب) ، 30 (15 على كل جانب) ، 40 (20 على كل جانب) ، 50 (25 على كل جانب) ، 60 (30 على كل جانب) و 200 (100 على كل جانب) نيوكليوتيدات حول Kpnأنا موقع. ب تم تحويل تفاعلات جيبسون وطليها على ألواح كاربينيسيلين (1/10 أو 9/10 من خليط التحويل). تظهر المستعمرات التي تعبر عن الحمض النووي التي خضعت لتجميع ناجح على الأرجح ، باللون الأحمر بسبب التعبير عن طلب تقديم العروض الذي تم إدخاله. قد يؤدي التجمع غير الصحيح إلى مستعمرة بيضاء. ج تم عد وتسجيل عدد المستعمرات الحمراء مقابل البيضاء. د عدد النسخ الصحيحة بعد تسلسل سانجر. تم إجراء تفاعلات حذف جيبسون بحضانة 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أو مع حضانة مسبقة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل حضانة 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إضافية.

أظهر تسلسل البلازميدات المسترجعة من المستعمرات الحمراء أنه عند حذف جيبسون ، خضع معظم الحمض النووي للتجميع الصحيح (الشكل 5 د). حذف 200 نيوكليوتيدات حول Kpnلم تسفر المواقع عن أي تكامل صحيح لشريط طلب تقديم العروض. على الرغم من أننا تمكنا من الحصول على مستعمرات حمراء من هذا التجميع الأكثر تحديًا ، إلا أن تسلسل Sanger لتسلسلات محاطة RFP كشفت عن عمليات حذف صحيحة فقط على جانب واحد (5 نهاية أو 3 نهاية) من RFP وحذف جزئي أو بدون حذف على الجانب الآخر من RFP. كاسيت طلب تقديم العروض. أظهرت بعض النسخ أيضًا إدخالات جديدة بين شريط RFP والتسلسلات المحذوفة (ملف إضافي 5: الشكل S4). بناءً على هذه النتائج ، اختبرنا أيضًا ما إذا كانت الحضانة 37 درجة مئوية لتفاعل جيبسون قبل الحضانة عند 50 درجة مئوية (انظر الطرق) زادت من كفاءة حذف جيبسون. درجة الحرارة المثلى للنوكلياز الخارجي T5 ، اللازمة لفضح التسلسل المتماثل قبل التلدين ، هي 37 درجة مئوية ، وبالتالي افترضنا أن الحضانة المسبقة عند 37 درجة مئوية ستزيد من المضغ ، وربما يزيد من نجاح تجميعات حذف جيبسون رد الفعل مع التسلسلات الأطول ليتم حذفها. لذلك تم تحضين تفاعلات حذف جيبسون لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية قبل الحضانة عند 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لاحقة. لم يحسن الحضانة المسبقة عند 37 درجة مئوية تفاعل حذف جيبسون ، بل إنها قللت من عدد التجمعات الصحيحة كما هو محدد بواسطة تسلسل الحمض النووي للبلازميدات التي تم الحصول عليها بعد تفاعل حذف جيبسون الذي تم إجراؤه بالتوازي مع أو بدون الحضانة المسبقة 37 درجة مئوية ( الشكل 5 د).

تظهر نتائجنا بشكل عام أنه يمكن تطبيق حذف جيبسون للحذف المتزامن للحمض النووي وتجميع الحمض النووي المعقد مع انخفاض كفاءة التجميع مع زيادة كميات الحمض النووي المحذوف.


تم النشر بواسطة الجمعية الملكية بموجب شروط رخصة المشاع الإبداعي http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ ، والتي تسمح بالاستخدام غير المقيد ، بشرط ذكر المؤلف والمصدر الأصليين.

مراجع

. 2006 علم الأحياء عالي الإنتاجية في عصر ما بعد الجينوم. J. فاسك. تدخل. راديول . 17، 1077-1085. (دوى: 10.1097 / 01.rvi.0000228840.12260.ff) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

كاميرون دي ، باشور سي جيه ، كولينز جي

. 2014 تاريخ موجز للبيولوجيا التركيبية. نات. القس ميكروبيول . 12، 381 - 390. (دوى: 10.1038 / nrmicro3239) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2006 الفحص المجهري عالي الإنتاجية لبيولوجيا الأنظمة. نات. القس مول. خلية بيول . 7، 690 - 696. (دوى: 10.1038 / nrm1979) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2012 استراتيجيات لإنتاج بروتينات حقيقية النواة النشطة في نظام التعبير البكتيري. باك الآسيوية. جيه تروب. بيوميد. 2، 159–162. (دوى: 10.1016 / S2221-1691 (11) 60213-X) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2014 تعبير البروتين المؤتلف في الإشريكية القولونية: التطورات والتحديات. أمام. ميكروبيول . 5، 172. (دوى: 10.3389 / fmicb.2014.00172) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2001 البروتينات عالية الإنتاجية: تعبير البروتين وتنقيته في عالم ما بعد الجينوم. البروتين Expr. بوريف . 22، 159–164.(دوى: 10.1006 / prep.2001.1465) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2000 تصميم طرق عالية الإنتاجية لإنتاج البروتين للبيولوجيا الهيكلية. بنية 8، R177 – R185. (دوى: 10.1016 / S0969-2126 (00) 00193-3) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Vincentelli R، Cimino A، Geerlof A، Kubo A، Satou Y، Cambillau C

. 2011 فحص وتنقية تعبير البروتين عالي الإنتاجية في الإشريكية القولونية . أساليب 55، 65-72. (دوى: 10.1016 / j.ymeth.2011.08.010) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2011 بناء إنتاجية عالية وفحص تعبير صغير الحجم للمتجهات متعددة العلامات في الإشريكية القولونية . أساليب 55، 29 - 37. (دوى: 10.1016 / j.ymeth.2011.08.002) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Mlynek G، Lehner A، Neuhold J، Leeb S، Kostan J، Charnagalov A، Stolt-Bergner P، Djinovic-Carugo K، Pinotsis N

. 2014 مركز الدراسات الهيكلية المُحسَّنة (COSS) لمنصة الأتمتة في الاستنساخ والتعبير وتنقية البروتينات المفردة ومجمعات البروتين والبروتين. أحماض أمينية 46، 1565-1582. (دوى: 10.1007 / s00726-014-1699-x) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Dieckman L ، Gu M ، Stols L ، Donnelly MI ، Collart FR

. 2002 طرق إنتاجية عالية لاستنساخ الجينات والتعبير عنها. البروتين Expr. بوريف. 25، 1-7. (دوى: 10.1006 / prep.2001.1602) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2013 مصنع بوليميراز الحمض النووي الريبي والنسخ الأثري. تشيم. القس . 113، 8350-8376. (دوى: 10.1021 / cr400148k) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Jia B، Li Z، Liu J، Sun Y، Jia X، Xuan YH، Zhang J، Jeon CO

. 2015 البروتياز المعتمد على الزنك AMZ-tk من الأركشين المحبة للحرارة هو عضو جديد في عائلة بروتين archaemetzincin. أمام. ميكروبيول. 6، 1380. (دوى: 10.3389 / fmicb.2015.01380) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

جيا ب ، ليو ج ، فان دويت إل ، صن واي ، شوان يه ، تشيونغ جي دبليو

. 2015 التنميط البروتيني لاستجابات الإجهاد الحراري والأكسدة والملح في Thermococcus kodakarensis كود 1. أمام. ميكروبيول. 6، 605. (دوى: 10.3389 / fmicb.2015.00605) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2013 الإنزيمات متعددة الوظائف في العتائق: الاختلاط وضوء القمر. المتطرفون 17، ١٩٣-٢٠٣. (دوى: 10.1007 / s00792-012-0509-1) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

هولز سي ، لويكينج أ ، بوفيكامب لام ، جوتجار سي ، بولوتينا إن ، ليهراش إتش ، كاهيل دي جي

. 2001 مكتبة تعبيرات (كدنا) بشرية في الخميرة المخصبة لإطارات القراءة المفتوحة. الدقة الجينوم . 11، 1730 - 1735. (دوى: 10.1101 / gr.181501) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

بوسو ك ، نوردهوف إي ، لوبرت سي ، ليهراش إتش ، والتر جي

. 2000 مكتبة (كدنا) بشرية لفحص التعبير البروتيني عالي الإنتاجية. علم الجينوم 65، 1-8. (دوى: 10.1006 / geno.2000.6141) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2004 مسارات عديدة للعديد من الحيوانات المستنسخة: نظرة مقارنة على طرق الاستنساخ عالية الإنتاجية. الدقة الجينوم . 14، 2020-2028. (دوى: 10.1101 / gr.2528804) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Cao Y، Sun J، Zhu J، Li L، Liu G

. 2010 PrimerCE: تصميم بادئات للاستنساخ والتعبير الجيني. مول. التكنولوجيا الحيوية . 46، 113-117. (دوى: 10.1007 / s12033-010-9276-3) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

كاميلو سم ، ليما مدير عام ، مالوف ف في ، جويدو آر في ، بوليكاربوف الأول

. 2015 HTP-OligoDesigner: أداة تصميم تمهيدي عبر الإنترنت لاستنساخ الجينات عالي الإنتاجية وتوليد الطفرات الموجهة بالموقع. J. كومبوت. بيول . 23، ٢٧-٢٩. (دوى: 10.1089 / cmb.2015.0148) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

أوتو ب ، لارسون ب ، كروجر إس

. 2002 تنقية آلية عالية الإنتاجية لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام جسيمات بارامغناطيسية Wizard® MagneSil ™. مختبر J. آلي . 7، 120-124. (دوى: 10.1016 / s1535-5535-04-00232-1) الباحث العلمي من Google

Xiong AS ، Yao QH ، Peng RH ، Duan H ، Li X ، Fan HQ ، Cheng ZM ، Li Y

. 2006 توليف دقيق قائم على PCR لتسلسل الحمض النووي الطويل. نات. بروتوك . 1، 791-797. (دوى: 10.1038 / nprot.2006.103) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Yehezkel TB، Linshiz G، Buaron H، Kaplan S، Shabi U، Shapiro E

. 2008 من جديد تخليق الحمض النووي باستخدام جزيء واحد PCR. الدقة الأحماض النووية. 36، e107. (دوى: 10.1093 / nar / gkn457) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

كلاين جيه سي ، لاجوي إم جيه ، شوارتز جيه جيه ، ستراوتش إم ، نيلسون جيه ، بيكر دي ، شندور جيه

. 2016 التجميع الزوجي المتعدد لأوليغنوكليوتيدات الحمض النووي المشتقة من الصفيف. الدقة الأحماض النووية . 44، هـ 43. (دوى: 10.1093 / nar / gkv1177) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2014 على نطاق واسع من جديد توليف الحمض النووي: التقنيات والتطبيقات. نات. أساليب 11، 499-507. (دوى: 10.1038 / nmeth.2918) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Quan J، Saaem I، Tang N، Ma S، Negre N، Gong H، White KP، Tian J

. 2011 تركيب الجينات المتوازية على الرقاقة وتطبيقها لتحسين تعبير البروتين. نات. التكنولوجيا الحيوية . 29، 449-452. (دوى: 10.1038 / nbt.1847) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

2015 Codon الأمثل هو محدد رئيسي لاستقرار mRNA. زنزانة 160، 1111-1124. (دوى: 10.1016 / j.cell.2015.02.029) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

فيستا إف ، ستيل جي ، بيان إكس ، لابائر ج

. 2013 إنشاء مكتبة الاستنساخ والتعبير عالية الإنتاجية للبروتيوميات الوظيفية. البروتيوميات 13، ١٣٨١-١٣٩٩. (دوى: 10.1002 / pmic.201200456) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2009 إنتاج البروتين عالي الإنتاجية (HTPP): مراجعة لتقنيات التمكين لتسريع إنتاج البروتين. طرق مول. بيول. 498، 1–18. (دوى: 10.1007 / 978-1-59745-196-3_1) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

بلوميل بي جي ، مارتن بي إيه ، روبيل آر إل ، ستيفن إي ، فوكس بي جي

. 2006 إنتاج خطوة واحدة بكفاءة عالية للبلازميدات التعبيرية من استنساخ (كدنا) باستخدام نظام استنساخ فليكسي فيكتور. البروتين Expr. بوريف . 47، 562-570. (دوى: 10.1016 / j.pep.2005.11.007) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

2008 استكشاف ORFeome البشري: إعداد عالي الإنتاجية لنسخ ORF والتوصيف الفعال لمنتجاتها البروتينية. الدقة DNA . 15، 137 - 149. (دوى: 10.1093 / dnares / dsn004) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

إنجلر سي ، كاندزيا آر ، ماريلونيت إس

. 2008 طريقة استنساخ دقيقة واحدة ، خطوة واحدة ، ذات قدرة إنتاجية عالية. بلوس واحد 3، e3647. (دوى: 10.1371 / journal.pone.0003647) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

ويتمان إل ، جور إم ، نيس J ، ثيودورو إي ، جوستافسون سي ، مينشول ج

. 2013 الاستنساخ السريع لشظايا الجينات باستخدام نظام ناقل إلكترا. جينيه. م. التكنولوجيا الحيوية . 33، 42. (دوى: 10.1089 / gen.33.11.20) الباحث العلمي من Google

Chen WH ، Qin ZJ ، Wang J ، Zhao GP

. 2013 طريقة الربط MASTER (نهايات قابلة للتخصيص بمساعدة المثيلة) لتجميع الحمض النووي السلس. الدقة الأحماض النووية. 41، e93. (دوى: 10.1093 / nar / gkt122) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2015 التطورات الحديثة في تقنيات تجميع الحمض النووي. FEMS الخميرة الدقة . 15، 1–9. (دوى: 10.1111 / 1567-1364.12171) PubMed ، الباحث العلمي من Google

إسبوزيتو د ، غارفي لوس أنجلوس ، تشاكيات سي إس

. 2009 استنساخ البوابة للتعبير عن البروتين. طرق مول. بيول. 498، 31-54. (دوى: 10.1007 / 978-1-59745-196-3_3) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Cheo DL، Titus SA، Byrd DRN، Hartley JL، Temple GF، Brasch MA

. 2004 تجميع واستنساخ مقاطع DNA متعددة باستخدام في المختبر إعادة التركيب الخاصة بالموقع: التحليل الوظيفي لاستنساخ التعبير متعدد الأجزاء. الدقة الجينوم . 14، 2111-2120. (دوى: 10.1101 / gr.2512204) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

تشانغ واي ، ويرلينج يو ، إيدلمان دبليو

. 2012 SLiCE: طريقة استنساخ DNA جديدة تعتمد على خلاصة الخلايا البكتيرية. الدقة الأحماض النووية. 40، e55. (دوى: 10.1093 / nar / gkr1288) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2015 طريقة بسيطة وفعالة لاستنساخ الحمض النووي باستخدام SLiCE من الإشريكية القولونية سلالات المختبر وتطبيقه على الطفرات الموجهة من موقع SLiP. BMC Biotechnol . 15، 47. (دوى: 10.1186 / s12896-015-0162-8) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2015 تقييم طرق تحضير مستخلص استنساخ الربط السلس من أ الإشريكية القولونية سلالة المختبر. شرجي. بيوتشيم . 486، 51-53. (دوى: 10.1016 / j.ab.2015.06.031) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2015 مستخلص استنساخ ربط سلس (SLiCE) بسيط ومنخفض التكلفة محلي الصنع كبديل لمجموعة استنساخ الحمض النووي غير الملحومة المتوفرة تجارياً. بيوتشيم. بيوفيز. اعادة عد. 4، 148-151. (دوى: 10.1016 / j.bbrep.2015.09.005) PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 1990 الاستنساخ المستقل للربط لمنتجات PCR (LIC-PCR). الدقة الأحماض النووية. 18، 6069-6074. (دوى: 10.1093 / nar / 18.20.6069) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

جيبسون دي جي ، يونغ إل ، تشوانغ آر واي ، فينتر جي سي ، هاتشيسون كاليفورنيا ، سميث هو

. 2009 تجميع إنزيمي لجزيئات الحمض النووي يصل إلى عدة مئات من الكيلوبات. نات. أساليب 6، 343-345. (دوى: 10.1038 / nmeth.1318) Crossref و PubMed و ISI و Google Scholar

إيروين كر ، فارمر أ ، ويلر دو ، إيفانز دي إتش

. 2012 In-fusion® الاستنساخ باستخدام بوليميراز DNA لفيروس اللقاح. طرق مول. بيول . 890، 23 - 35. (دوى: 10.1007 / 978-1-61779-876-4_2) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

كلوك هي ، كويزيما إي جيه ، كنوث ميغاواط ، ليزلي سا

. 2008 الجمع بين طريقة التمديد التمهيدي غير المكتملة للبوليميراز للاستنساخ والطفرات مع الفحص المجهري لتسريع جهود علم الجينوم الهيكلي. البروتينات 71، 982-994. (دوى: 10.1002 / prot.21786) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2007 تسخير إعادة التركيب المتماثل في المختبر لتوليد الحمض النووي المؤتلف عبر SLIC. نات. أساليب 4، 251-256. (دوى: 10.1038 / nmeth1010) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2010 Interlap extension استنساخ PCR: طريقة بسيطة وموثوقة لإنشاء البلازميدات المؤتلفة. التقنيات الحيوية 48، 463-465. (دوى: 10.2144 / 000113418) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

ستيفنسون جيه ، كريسر جونيور ، فان إل ، براون إيه جيه

. 2013 مقارنة عملية لتقنيات الاستنساخ المستقلة عن الربط. بلوس واحد 8، e83888. (دوى: 10.1371 / journal.pone.0083888) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

توماس إس ، ماينارد إن دي ، جيل ج

. 2015 بناء مكتبة DNA باستخدام Gibson Assembly®. نات. أساليب 12، 11. (دوى: 10.1038 / nmeth.f.384) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2014 الاستنساخ عالي الإنتاجية والتعبير وتنقية هيدرولازات الجليكوزيد باستخدام الاستنساخ المستقل للربط (LIC). البروتين Expr. بوريف. 99، 35-42. (دوى: 10.1016 / j.pep.2014.03.008) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

شميد-بورغك جيه إل ، شميدت تي ، كايزر الخامس ، هونينج ك ، هورنونج ف

. 2013 تقنية استنساخ مستقلة عن الربط لتجميع عالي الإنتاجية لجينات المستجيب الشبيه بمنشط النسخ. نات. التكنولوجيا الحيوية . 31، 76-81. (دوى: 10.1038 / nbt.2460) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

يوان H و Peng L و Han Z و Xie JJ و Liu XP

. 2015 مكتبة التعبير المؤتلف Pyrococcus furiosus تم إنشاؤها بواسطة الاستنساخ عالي الإنتاجية: أداة مفيدة لعلم الجينوم الوظيفي والهيكلية. أمام. ميكروبيول. 6، 943. (دوى: 10.3389 / fmicb.2015.00943) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

لي إن ، فرانكلين سي ، هاميلتون إب

. 1987 الارتباط الناجم عن الأرابينوز لبروتين AraC بـ araI2 ينشط محفز أوبرا أراباد. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 84، 8814-8818. (دوى: 10.1073 / pnas.84.24.8814) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

جوزمان إل إم ، بيلين D ، كارسون إم جي ، بيكويث جي

. 1995 التنظيم الدقيق والتعديل والتعبير عالي المستوى بواسطة ناقلات تحتوي على مروج أرابينوز PBAD. J. باكتيريول . 177، 4121–4130. كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

أوتو سم ، نياجرو إف ، سو X ، رولينغز كاليفورنيا

. 1995 التعبير عن عامل نخر ورم القطط المأشوب سام الإشريكية القولونية . كلين. التشخيص. مختبر. إمونول . 2، ٧٤٠-٧٤٦. PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2010 استراتيجيات لتحسين التعبير البروتيني في بكتريا قولونية . بالعملة. بروتوك. علوم البروتين. 5، 21-29. (دوى: 10.1002 / 0471140864.ps0524s61) الباحث العلمي من Google

2008 إنتاج البروتين وتنقيته. نات. أساليب 5، 135 - 146. (دوى: 10.1038 / nmeth.f.202) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 1986 استخدام الجراثيم T7 RNA polymerase لتوجيه التعبير الانتقائي عالي المستوى للجينات المستنسخة. جيه مول. بيول . 189، 113-130. (دوى: 10.1016 / 0022-2836 (86) 90385-2) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2000 انخفاض تعبير الخلفية وتحسين استقرار البلازميد مع نواقل الحيوانات الأليفة في BL21 (DE3). التقنيات الحيوية 29، ١٢٣٤-١٢٣٨. كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2004 T7 الليزوزيم يقمع نسخ بوليميريز T7 RNA عن طريق زعزعة استقرار المركب المفتوح أثناء البدء. J. بيول. تشيم . 279، 16136-16143. (دوى: 10.1074 / jbc.M400139200) كروسريف ، الباحث العلمي من Google

. 1996 الإفراط في إنتاج البروتينات في الإشريكية القولونية: مضيفات متحولة تسمح بتركيب بعض البروتينات الغشائية والبروتينات الكروية بمستويات عالية. جيه مول. بيول . 260، 289 - 298. (دوى: 10.1006 / jmbi.1996.0399) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

ضبط 2008 الإشريكية القولونية لفرط بروتين الغشاء. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 105، 14 371-14 376. (دوى: 10.1073 / pnas.0804090105) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 1983 مقارنة بدء تخليق البروتين في بدائيات النواة ، حقيقيات النوى ، والعضيات. ميكروبيول. القس . 47، 1–45. PubMed ، الباحث العلمي من Google

Cheong DE، Ko KC، Han Y، Jeon HG، Sung BH، Kim GJ، Choi JH، Song JJ

. 2015 تعزيز التعبير الوظيفي للبروتينات غير المتجانسة من خلال الاستبدال العشوائي للرموز الجينية في منطقة الترميز 5 '. التكنولوجيا الحيوية. بيونج . 112، ٨٢٢-٨٢٦. (دوى: 10.1002 / bit.25478) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

2013 التعبير الجيني الدقيق والموثوق من خلال عناصر النسخ القياسية وبدء الترجمة. نات. أساليب 10، 354-360. (دوى: 10.1038 / nmeth.2404) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Liebeton K ، Lengefeld J ، Eck J

. 2014 يؤثر تكوين النوكليوتيدات لتسلسل المباعد على إنتاجية التعبير عن الجينات المعبر عنها بشكل غير متجانس في العصوية الرقيقة . J. Biotechnol . 191، 214 - 220. (دوى: 10.1016 / j.jbiotec.2014.06.027) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2012 صقل شبكات الجينات باستخدام تكرار تسلسل بسيط. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 109، 16 817-16822. (دوى: 10.1073 / pnas.1205693109) كروسريف ، الباحث العلمي من Google

ميرزاده K ، مارتينيز الخامس ، توددو إس ، جونتور إس ، هيرجارد إم جي ، إيلوفسون أ ، نورهولم إم إتش ، دالي دو

. 2015 إنتاج البروتين المحسن في الإشريكية القولونية عن طريق تحسين ندوب الاستنساخ عند تقاطع تسلسل ترميز ناقل. موالفة ACS. بيول . 4، 959-965. (دوى: 10.1021 / acssynbio.5b00033) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2005 تنظيم الترجمة عبر بنية mRNA في بدائيات النوى وحقيقيات النوى. الجين 361، 13 - 37. (دوى: 10.1016 / j.gene.2005.06.037) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

غولترمان L، بورش جنسن M، بنتين تي

. 2011 ضبط تعبير البروتين باستخدام مكتبات كودون مترادفة تستهدف منطقة ترميز 5-mRNA. هندسة البروتين. ديس. سيل . 24، 123 - 129. (دوى: 10.1093 / بروتين / gzq086) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

بنتيل ك ، سافرت ف ، راوشر آر ، إغناتوفا زد ، بلوثجن إن

. 2013 بدء الترجمة الفعالة يفرض استخدام الكودون عند بدء الجين. مول. النظام. بيول . 9، 675. (دوى: 10.1038 / msb.2013.32) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Goodman DB ، Church GM ، Kosuri S.

. 2013 أسباب وتأثيرات انحياز كودون N- طرفي في الجينات البكتيرية. علم 342، 475-479. (دوى: 10.1126 / العلوم .1241934) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

2010 آلية محفوظة تطوريًا للتحكم في كفاءة ترجمة البروتين. زنزانة 141، 344–354. (دوى: 10.1016 / j.cell.2010.03.031) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

2016 تأثير Codon على تعبير البروتين في بكتريا قولونية يرتبط بمستويات الرنا المرسال. طبيعة سجية 529، 358 - 363. (دوى: 10.1038 / nature16509) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Castillo-Mendez MA، Jacinto-Loeza E، Olivares-Trejo JJ، Guarneros-Pena G، Hernandez-Sanchez J

. تعزز الكودونات المحتوية على الأدينين 2012 تخليق البروتين عن طريق تعزيز ارتباط الرنا المرسال للوحدات الفرعية الريبوزومية 30S بشرط عدم استنفاد الحمض الريبي النووي النقال المحدد. بيوكيمي 94، ٦٦٢ - ٦٧٢. (دوى: 10.1016 / j.biochi.2011.09.019) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2014 طريقة لتعزيز التعبير البروتيني المتعلق بالأكسدة النباتية وتطبيقاته في المختبر الحد من thioredoxins البلاستيدات الخضراء. البروتين Expr. بوريف . 101، 152-156. (دوى: 10.1016 / j.pep.2014.07.001) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

كريشنا راو DV ، Rao JV ، Narasu ML ، Bhujanga Rao AK

. 2008 تحسين محتوى AT من الكودونات مباشرة بعد كودون البدء وتقييم ظروف الثقافة للتعبير عالي المستوى عن G-CSF البشري المؤتلف في الإشريكية القولونية . مول. التكنولوجيا الحيوية . 38، ٢٢١ - ٢٣٢. (دوى: 10.1007 / s12033-007-9018-3) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Care S ، Bignon C ، Pelissier MC ، Blanc E ، Canard B ، Coutard B

. 2008 ترجمة البروتينات المؤتلفة في بكتريا قولونية يمكن تحسينها بواسطة في السيليكو إنشاء وفحص مكتبات عشوائية لمنطقة 70 / + 96 mRNA فيما يتعلق بكودون بدء الترجمة. الدقة الأحماض النووية . 36، e6. (دوى: 10.1093 / nar / gkm1097) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Salis HM ، Mirsky EA ، Voigt CA

. 2009 التصميم الآلي لمواقع ربط الريبوسوم الاصطناعية للتحكم في التعبير البروتيني. نات. التكنولوجيا الحيوية . 27، ٩٤٦-٩٥٠. (دوى: 10.1038 / nbt.1568) Crossref و PubMed و ISI و Google Scholar

. 2010 RBSDesigner: برنامج لتصميم مواقع ربط الريبوسوم الاصطناعية التي تعطي المستوى المطلوب من التعبير البروتيني. المعلوماتية الحيوية 26، ٢٦٣٣-٢٦٣٤. (دوى: 10.1093 / المعلوماتية الحيوية / btq458) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Seo SW و Yang JS و Kim I و Yang J و Min BE و Kim S و Jung GY

. 2013 التصميم التنبئي لمنطقة بدء ترجمة mRNA للتحكم في كفاءة الترجمة بدائية النواة. متعب. م . 15، 67-74. (دوى: 10.1016 / j.ymben.2012.10.006) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Bonde MT، Pedersen M، Klausen MS، Jensen SI، Wulff T، Harrison S، Nielsen AT، Herrgard MJ، Sommer MOA

. 2016 ضبط متوقع لتعبير البروتين في البكتيريا. نات. أساليب 13، 233-236. (دوى: 10.1038 / nmeth.3727) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

ريف ب ، هارجست تي ، جيلبرت سي ، إليس تي

. 2014 توقع معدلات بدء الترجمة لتصميم البيولوجيا التركيبية. أمام. بيونج. التكنولوجيا الحيوية . 2، 1. (doi: 10.3389 / fbioe.2014.00001) Crossref، PubMed، Google Scholar

. 1989 الاستنساخ الجزيئي: دليل معمل ، الطبعة الثانية. نيويورك ، نيويورك: مطبعة كولد سبرينغ. منحة جوجل

. 2004 نظرة عامة على علامات التقارب لتنقية البروتين. بالعملة. بروتوك. علوم البروتين. 9، 9. (دوى: 10.1002 / 0471140864.ps0909s36) PubMed ، الباحث العلمي من Google

كوستا S ، ألميدا أ ، كاسترو أ ، دومينجيز إل

. 2014 علامات الانصهار لقابلية ذوبان البروتين وتنقيته والمناعة في الإشريكية القولونية: نظام رواية Fh8. أمام. ميكروبيول. 5، 63. (دوى: 10.3389 / fmicb.2014.00063) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2013 عدة علامات تقارب شائعة الاستخدام في التنقية الكروماتوغرافية. J. الشرج. طرق علم . 2013، 581093. (دوى: 10.1155 / 2013/581093) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2001 وجهات نظر كروماتوغرافيا تقارب المعدن الثابت. J. Biochem. بيوفيز. أساليب 49، 335-360. (دوى: 10.1016 / S0165-022X (01) 00207-X) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

شميدت PM ، Sparrow LG ، Attwood RM ، Xiao X ، Adams TE ، McKimm-Breschkin JL

. 2012 إنزال FLAG! كيف يتحدى تعبير خلية الحشرات نظام العلامات الراسخ. بلوس واحد 7، e37779. (دوى: 10.1371 / journal.pone.0037779) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2007 نظام Strep-tag للتنقية بخطوة واحدة واكتشاف التقارب العالي أو التقاط البروتينات. نات. بروتوك . 2، ١٥٢٨-١٥٣٥. (دوى: 10.1038 / nprot.2007.209) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

دايسون إم آر ، شادبولت إس بي ، فينسينت كي جي ، بيريرا آر إل ، مكافيرتي جي

. 2004 إنتاج بروتينات الثدييات القابلة للذوبان في الإشريكية القولونية: تحديد خصائص البروتين التي ترتبط بالتعبير الناجح. BMC Biotechnol . 4، 32. (دوى: 10.1186 / 1472-6750-4-32) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Zuo X، Li S، Hall J، Mattern MR، Tran H، Shoo J، Tan R، Weiss SR، Butt TR

. 2005 التعبير المحسن وتنقية بروتينات الغشاء عن طريق اندماج SUMO في الإشريكية القولونية . J. الهيكل. Funct. علم الجينوم 6، 103-111. (دوى: 10.1007 / s10969-005-2664-4) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

هامون J ، Palanivelu DV ، Chen J ، Patel C ، Minor DL

. 2009 شاشة بروتين فلورية خضراء لتحديد بروتينات الغشاء المعبر عنها جيدًا من مجموعة من الكائنات الحية المتطرفة. علوم البروتين . 18، ١٢١ - ١٣٣. (دوى: 10.1002 / pro.18) PubMed ، الباحث العلمي من Google

ليليوس جي ، بيرسون إم ، بولو إل ، موسباخ ك

. 1991 ترسيب تقارب المعادن للبروتينات التي تحمل ذيول تقارب متعدد الهيستدين المتصل وراثيا. يورو. J. Biochem . 198، 499-504. (دوى: 10.1111 / j.1432-1033.1991.tb16042.x) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2003 التعبير عالي المستوى والتنقية السريعة لجينات الكودون النادرة من العتائق شديدة الحرارة بواسطة نظام الاندماج الجيني GST. تشروماتوجر. تحليل ب. تكنول. بيوميد. علوم الحياة . 786، 177 - 185. (دوى: 10.1016 / S1570-0232 (02) 00810-3) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

كولمان MA ، Lao VH ، Segelke BW ، Beernink PT

. 2004 فحص عالي الإنتاجية قائم على التألق لتعبير البروتين القابل للذوبان. J. بروتيوم الدقة . 3، 1024-1032. (دوى: 10.1021 / pr049912g) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

هيويت SN، Choi R، Kelley A، Crowther GJ، Napuli AJ، Van Voorhis WC

. 2011 التعبير عن البروتينات في الإشريكية القولونية كاندماج مع بروتين ربط المالتوز لإنقاذ الأهداف غير المعبر عنها في خط أنابيب تنقية وتعبير البروتين عالي الإنتاجية. اكتا Crystallogr. الطائفة. F الهيكل. بيول. كريست. كومون . 67، 1006-1009. (دوى: 10.1107 / s1744309111022159) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2006 تعزيز التعبير البروتيني القابل للذوبان من خلال استخدام علامات الانصهار. بالعملة. رأي. التكنولوجيا الحيوية . 17، 353 - 358. (دوى: 10.1016 / j.copbio.2006.06.003) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

كوستا إس جيه ، كويلو إي ، فرانكو إل ، ألميدا أ ، كاسترو إيه ، دومينجيز إل

. 2013 علامة Fh8: شريك اندماج لتنقية البروتين بطريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة في الإشريكية القولونية . البروتين Expr. بوريف. 92، ١٦٣-١٧٠. (دوى: 10.1016 / j.pep.2013.09.013) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

مكلوسكي أج ، بون جنرال موتورز ، غاريبي ي

. 2007 استراتيجية تنقية ترادفية سريعة وشاملة للبروتينات المؤتلفة. علوم البروتين . 16، ٢٧٢٦-٢٧٣٢. (دوى: 10.1110 / ps.072894407) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2010 مجموعات العلامات شائعة الاستخدام لتنقية التقارب الترادفي. التكنولوجيا الحيوية. تطبيق بيوتشيم . 55، 73-83. (دوى: 10.1042 / ba20090273) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2000 طوبولوجيا الغشاء وإدخال البروتينات الغشائية: البحث عن إشارات طوبوجينية. ميكروبيول. مول. بيول. القس . 64، 13 - 33. (دوى: 10.1128 / mmbr.64.1.13-33.2000) Crossref و PubMed و ISI و Google Scholar

2005 خط أنابيب قابل للتطوير يعتمد على GFP لفحص البروتين الغشائي الزائد وتنقيته. علوم البروتين. 14، 2011-2017. (دوى: 10.1110 / ps.051466205) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

درو د ، ليرش إم ، كونجي إي ، سلوتبوم دي جي ، دي جير جي دبليو

. 2006 التحسين من الإفراط في التعبير عن البروتين الغشائي وتنقيته باستخدام اندماج GFP. نات. أساليب 3، 303 - 313. (دوى: 10.1038 / nmeth0406-303) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

درو د ، نيوستيد إس ، سونودا واي ، كيم إتش ، فون هايجن جي ، إيواتا إس

. 2008 مخطط التحسين القائم على GFP للإفراط في التعبير وتنقية بروتينات الغشاء حقيقية النواة في خميرة الخميرة . نات. بروتوك. 3، 784-798. (دوى: 10.1038 / nprot.2008.44) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Backmark AE، Olivier N، Snijder A، Gordon E، Dekker N، Ferguson AD

. 2013 مسبار الفلورسنت للفحص عالي الإنتاجية لتعبير بروتين الغشاء. علوم البروتين . 22، ١١٢٤-١١٣٢. (دوى: 10.1002 / pro.2297) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Zhang YB، Howitt J، McCorkle S، Lawrence P، Springer K، Freimuth P

. 2004 تراكم البروتين أثناء الإفراط في التعبير المحدود بامتدادات الببتيد ذات الشحنة السلبية الصافية الكبيرة. البروتين Expr. بوريف. 36، 207-216. (دوى: 10.1016 / j.pep.2004.04.020) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Roosild TP، Greenwald J، Vega M، Castronovo S، Riek R، Choe S

. 2005 بنية NMR لـ Mistic ، بروتين متكامل الغشاء للتعبير عن بروتين الغشاء. علم 307، ١٣١٧-١٣٢١. (دوى: 10.1126 / العلوم. 1106392) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

ليفياتان إس ، ساوادا ك ، مورياما واي ، نيلسون إن

. 2010 طريقة اندماجية للإفراط في التعبير عن بروتينات الغشاء في الإشريكية القولونية . J. بيول. تشيم . 285، 23548–23 556. (دوى: 10.1074 / jbc.M110.125492) كروسريف ، الباحث العلمي من Google

. 2001 فحص التعبير القابل للذوبان عن البروتينات المؤتلفة في شكل 96 بئر. شرجي. بيوتشيم . 297، 79-85. (دوى: 10.1006 / abio.2001.5331) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2013 التقدير الكمي الفوري عالي الإنتاجية لتعبير البروتين ونقاوته استنادًا إلى إيقاف / إيقاف تشغيل / إيقاف بروتين أصفر ضوئيًا. علوم البروتين. 22، 1109-1117. (دوى: 10.1002 / pro.2286) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

2016 تصميم آلي قائم على الهيكل والتسلسل للبروتينات من أجل التعبير البكتيري العالي والاستقرار. مول. زنزانة 63، 337–346. (دوى: 10.1016 / j.molcel.2016.06.012) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

2015 إعادة تشكيل البروتينات بوساطة القص والإجهاد من الركام وأجسام التضمين. كيمبيوتشيم 16، 393–396. (دوى: 10.1002 / cbic.201402427) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

. 2011 نظرة عامة على الكواشف الأنزيمية لإزالة علامات التقارب. البروتين Expr. بوريف. 80، 283 - 293. (دوى: 10.1016 / j.pep.2011.08.005) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2011 حساسية المنظفات المتغيرة للبروتياز المستخدمة في إزالة علامة تقارب البروتين المؤتلف. البروتين Expr. بوريف. 78، 139 - 142. (دوى: 10.1016 / j.pep.2011.04.011) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

ديفيس جي جي ، وانغ كيو إم ، كوكس جي إيه ، جونسون آر بي ، واكولتشيك إم ، دوتسون كاليفورنيا ، فياريال إي سي

. 1997 التعبير عن فيروس الأنف المؤتلف وتنقيته 14 بروتيناز 3CD ومقارنته ببروتينيز 3C. قوس. بيوتشيم. بيوفيز . 346، 125-130. (دوى: 10.1006 / abbi.1997.0291) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

جوزيف ب.

. 2015 نظرة عامة على معلمات التعبير البروتيني المؤتلف في الإشريكية القولونية . J. خلية علوم. هناك . 6، 5. (دوى: 10.4172 / 2157-7013.1000221) كروسريف ، الباحث العلمي من Google

وو X ، يورنفال إتش ، بيرندت دينار كويتي ، أوبرمان يو

. يكشف تحسين Codon لعام 2004 عن العوامل الحاسمة للتعبير عالي المستوى لجينين من الكودونات النادرة في الإشريكية القولونية: استقرار الحمض النووي الريبي والبنية الثانوية ولكن ليس وفرة الحمض النووي الريبي. بيوتشيم. بيوفيز. الدقة. كومون . 313، 89-96. (دوى: 10.1016 / j.bbrc.2003.11.091) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

برينز WA، Aslund F، Holmgren A، Beckwith J

. 1997 دور مسارات thioredoxin و glutaredoxin في تقليل روابط ثاني كبريتيد البروتين في الإشريكية القولونية السيتوبلازم . J. بيول. تشيم. 272، 15 661-15 667. (دوى: 10.1074 / jbc.272.25.15661) كروسريف ، الباحث العلمي من Google

تشانغ المفوض السامي ، سيسنيروس آر جيه ، دنلاب آر بي ، جونسون إل إف

. 1989 التوليف الفعال لمركب الفأر thymidylate في الإشريكية القولونية . الجين 84، 487-491. (دوى: 10.1016 / 0378-1119 (89) 90525-8) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

وينر إم ، أندرسون سي ، جيربسيث ب ، ويلز إس ، جونسون براون بي ، فيلانكورت بي

. 1994 ناقل ومضيفي نظام Studier pET. إستراتيجيات. مول. بيول . 7، 41-43. منحة جوجل

2003 التعبير عن المؤتلف مثل IRP المتصورة المنجلية البروتين الذي يربط على وجه التحديد IREs البلازمية المفترضة. مول. بيوتشيم. باراسيتول . 126، 231 - 238. (دوى: 10.1016 / S0166-6851 (02) 00278-5) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Schlegel S ، Lofblom J ، Lee C ، Hjelm A ، Klepsch M ، Strous M ، Drew D ، Slotboom DJ ، de Gier JW

. 2012 تحسين إفراط بروتين الغشاء في الإشريكية القولونية سلالة Lemo21 (DE3). جيه مول. بيول . 423، 648-659. (دوى: 10.1016 / j.jmb.2012.07.019) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

لوبيز بي جيه ، مارشاند الأول ، جويس سا ، دريفوس م

. 1999 النصف الطرفي C من RNase E ، الذي ينظم الإشريكية القولونية التحلل ، يشارك في تدهور الرنا المرسال ولكن ليس معالجة الرنا الريباسي في الجسم الحي . مول. ميكروبيول . 33، ١٨٨-١٩٩. (دوى: 10.1046 / j.1365-2958.1999.01465.x) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2013 توسيع نطاق إنتاج البروتين المؤتلف في الإشريكية القولونية . التكنولوجيا الحيوية. بادئة رسالة . 35، 1971-1981. (دوى: 10.1007 / s10529-013-1396-y) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

موراتا تي ، شينوزوكا واي ، أوباتا واي ، يوكوياما ك

. 2008 فسفرة اثنين من عوامل النسخ حقيقية النواة ، بروتين Jun dimerization 2 وعامل نسخ التنشيط 2 ، في الإشريكية القولونية بواسطة Jun N-terminal kinase 1. شرجي. بيوتشيم . 376، 115 - 121. (دوى: 10.1016 / j.ab.2008.01.038) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

2002 الارتباط بالجليكوزيل المرتبط بـ N في العطيفة الصائمية ونقل وظيفته إلى بكتريا قولونية . علم 298، 1790 - 1793. (دوى: 10.1126 / العلوم .298.5599.1790) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Ihssen J، Kowarik M، Dilettoso S، Tanner C، Wacker M، Thony-Meyer L

. 2010 إنتاج لقاحات البروتين السكري في الإشريكية القولونية . ميكروب. حقيقة الخلية . 9، 61. (دوى: 10.1186 / 1475-2859-9-61) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

ليزاك سي ، فان واي واي ، ويبر تي سي ، إيبي إم

. 2011 الارتباط بالجليكوزيل المرتبط بـ N لشظايا الأجسام المضادة في الإشريكية القولونية . Bioconjug. تشيم . 22، 488-496. (دوى: 10.1021 / bc100511k) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2012 إعادة التكوين الوظيفي لمسار سومويل قابل للضبط يعتمد على E3 في الإشريكية القولونية . بلوس واحد 7، e38671. (دوى: 10.1371 / journal.pone.0038671) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Magnani R ، Chaffin B ، Dick E ، Bricken ML ، Houtz RL ، Bradley LH

. 2012 استخدام نظام التعبير المشترك كالمودولين ليسين ميثيل ترانسفيراز لتوليد مكتبة اندماجية للبروتينات المعدلة بعد متعدية. البروتين Expr. بوريف. 86، 83-88. (دوى: 10.1016 / j.pep.2012.09.012) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

دورونيو آر جيه ، جاكسون-ماتشلسكي إي ، هيوكروث رو ، أولينز بو ، ديفين سي إس ، يونيموتو دبليو ، سلايس إل دبليو ، تايلور إس إس ، جوردون جي

. 1990 بروتين N- ميريستول في الإشريكية القولونية: إعادة تشكيل تعديل البروتين حقيقية النواة في البكتيريا. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 87، 1506-1510. (دوى: 10.1073 / pnas.87.4.1506) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Ren Y و Yao X و Dai H و Li S و Fang H و Chen H و Zhou C

. 2011 إنتاج ثيموسين α1-acetylated Nα بوصة الإشريكية القولونية . ميكروب. حقيقة الخلية . 10، 26. (دوى: 10.1186 / 1475-2859-10-26) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Gubellini F ، Verdon G ، Karpowich NK ، Luff JD ، Boel G ، Gauthier N ، Handelman SK ، Ades SE ، Hunt JF

. 2011 الاستجابة الفسيولوجية لإفراط بروتين الغشاء في ه. القولونية. مول. بروتينات الخلية 10، M111.007930. (دوى: 10.1074 / mcp.M111.007930) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

2011 التغلب على الحواجز التي تحول دون تحديد بنية بروتين الغشاء. نات. التكنولوجيا الحيوية . 29، 335 - 340. (دوى: 10.1038 / nbt.1833) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Marreddy RKR ، Geertsma ER ، Poolman B

. 2011 إنتاج بروتين الغشاء المؤتلف: الماضي والحاضر والمستقبل. في التركيب والوظيفة فوق الجزيئات 10 (محرران

Brnjas-Kraljević J، Pifat-Mrzljak G

) ، ص 41 - 74. دوردريخت ، هولندا: سبرينغر. كروسريف ، الباحث العلمي من Google

Luirink J ، Yu Z ، Wagner S ، de Gier JW

. 2012 التكاثر الحيوي لبروتينات الغشاء الداخلي في الإشريكية القولونية . بيوكيم. بيوفيز. اكتا . 1817، 965-976. (دوى: 10.1016 / j.bbabio.2011.12.006) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Kwon SK ، Kim SK ، Lee DH ، Kim JF

. 2015 علم الجينوم المقارن والتطور التجريبي لـ الإشريكية القولونية تكشف سلالات BL21 (DE3) عن طبيعة هروب السمية من إنتاج البروتين الغشائي المفرط. علوم. اعادة عد . 5، 16076. (دوى: 10.1038 / srep16076) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Wagner S، Baars L، Ytterberg AJ، Klussmeier A، Wagner CS، Nord O، Nygren PÅ، van Wijk KJ، de Gier JW

. 2007 عواقب فرط إفراز البروتين الغشائي في الإشريكية القولونية . مول. سل. البروتيوميات 6، 1527-1550. (دوى: 10.1074 / mcp.M600431-MCP200) كروسريف ، الباحث العلمي من Google

Chen Y، Song J، Sui SF، Wang DN

. سهلت 2003 DnaK و DnaJ عملية الطي وتقليل تكوين الجسم المتضمن لناقل المغنيسيوم CorA الذي يتم التعبير عنه بشكل مفرط في الإشريكية القولونية . البروتين Expr. بوريف. 32، ٢٢١-٢٣١. (دوى: 10.1016 / S1046-5928 (03) 00233-X) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Link AJ، Skretas G، Strauch EM، Chari NS، Georgiou G

. 2008 الإنتاج الفعال لمستقبلات البروتين G المدمجة في الأغشية والقابلة للذوبان في المنظفات في الإشريكية القولونية . علوم البروتين . 17، ١٨٥٧-١٨٦٣. (دوى: 10.1110 / ps.035980.108) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

سكريتاس جي ، ماكينو تي ، فاراداراجان إن ، بوغسون إم ، جورجيو جي

. 2012 الجينات متعددة النسخ التي تعزز إنتاج مستقبلات البروتين المقترنة بالثدييات في الإشريكية القولونية . متعب. م . 14، 591-602. (دوى: 10.1016 / j.ymben.2012.05.001) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2009 التحليل الجيني لتعبير مستقبلات البروتين المقترن G في الإشريكية القولونية: الدور التثبيطي لـ DnaJ على التكامل الغشائي لمستقبلات القنب المركزية البشرية. التكنولوجيا الحيوية. بيونج . 102، 357 - 367. (دوى: 10.1002 / bit.22097) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Schlegel S، Hjelm A، Baumgarten T، Vikstrom D، de Gier JW

. 2014 إنتاج بروتين الغشاء البكتيري. بيوكيم. بيوفيز. اكتا . 1843، ١٧٣٩-١٧٤٩. (دوى: 10.1016 / j.bbamcr.2013.10.023) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

سيزونوف جي ، جوزيلو بيتي دي ، داري آر

. 2007 الإشريكية القولونية علم وظائف الأعضاء في مرق Luria-Bertani. J. باكتيريول . 189، 8746-8749. (دوى: 10.1128 / jb.01368-07) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2005 إنتاج البروتين عن طريق الحث الذاتي في مزارع اهتزاز عالية الكثافة. البروتين Expr. بوريف. 41، 207-234. (دوى: 10.1016 / j.pep.2005.01.016) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Losen M، Frölich B، Pohl M، Büchs J

. 2004 تأثير الحد من الأكسجين والتكوين المتوسط ​​على الإشريكية القولونية التخمير في مزارع اهتزاز القارورة. التكنولوجيا الحيوية. بروغ . 20، 1062-1068. (دوى: 10.1021 / bp034282t) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2006 إنتاج البروتينات المؤتلفة عن طريق زراعة الخلايا عالية الكثافة الإشريكية القولونية . تشيم. م. تكنول . 61، 876-885. (دوى: 10.1016 / j.ces.2005.03.031) كروسريف ، الباحث العلمي من Google

Song JM ، An YJ ، Kang MH ، Lee YH ، Cha SS

. 2012 تعتبر الزراعة عند درجة حرارة 6-10 درجة مئوية استراتيجية فعالة للتغلب على عدم قابلية ذوبان البروتينات المؤتلفة في الإشريكية القولونية . البروتين Expr. بوريف. 82، 297-301. (دوى: 10.1016 / j.pep.2012.01.020) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Castellanos-Mendoza A، Castro-Acosta RM، Olvera A، Zavala G، Mendoza-Vera M، García-Hernández E، Alagón A، Trujillo-Roldán MA، Valdez-Cruz NA

. 2014 تأثير التحكم في الأس الهيدروجيني في تكوين أجسام متضمنة أثناء إنتاج sphingomyelinase-D المؤتلف في الإشريكية القولونية . ميكروب. حقيقة الخلية. 13، 1-14. (دوى: 10.1186 / s12934-014-0137-9) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Yang Q و Xu J و Li M و Lei X و An L.

. 2003 تعبير عالي المستوى عن إنزيم سم الثعبان القابل للذوبان ، gloshedobin ، in بكتريا قولونية في وجود أيونات معدنية. التكنولوجيا الحيوية. بادئة رسالة . 25، 607-610. (دوى: 10.1023 / A: 1023067626846) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2005 التعبير القابل للذوبان عن البروتينات المؤتلفة في سيتوبلازم الإشريكية القولونية . ميكروب. حقيقة الخلية. 4، 1-8. (دوى: 10.1186 / 1475-2859-4-1) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2015 Triton X-100 يعزز الذوبان ونسبة إفراز بولولاناز المعرض للتجميع المنتج في الإشريكية القولونية . بيوريسور. تكنول . 194، 137-143. (دوى: 10.1016 / j.biortech.2015.07.024) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

موندال إس ، شيت د ، براسانا سي ، أتريا إتش إس

. 2013 إنتاجية عالية من البروتينات في بكتريا قولونية لدراسات الرنين المغناطيسي النووي. حال. بيوسكي. التكنولوجيا الحيوية . 4، 751-767. (دوى: 10.4236 / abb.2013.46099) كروسريف ، الباحث العلمي من Google

. 2015 التغلب على مشكلة الذوبان في بكتريا قولونية: الأساليب المتاحة لإنتاج البروتين المؤتلف. طرق مول. بيول. 1258، 27-44. (دوى: 10.1007 / 978-1-4939-2205-5_2) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2011 ضبط معلمات التعبير المختلفة لتحقيق البروتينات المؤتلفة القابلة للذوبان في بكتريا قولونية: مزايا الغربلة عالية الإنتاجية. التكنولوجيا الحيوية. ي . 6، ٧١٥-٧٣٠. (دوى: 10.1002 / biot.201100025) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Ukkonen K، Mayer S، Vasala A، Neubauer P

. 2013 إن استخدام التغذية البطيئة للجلوكوز كمصدر داعم للكربون في وسيط الحث الذاتي للاكتوز يحسن من متانة تعبير البروتين في ظروف تهوية مختلفة. البروتين Expr. بوريف. 91، 147-154. (دوى: 10.1016 / j.pep.2013.07.016) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2013 التعبير في الإشريكية القولونية: أن تصبح أسرع وأكثر تعقيدًا. بالعملة. رأي. هيكل. بيول . 23، 326 - 334. (دوى: 10.1016 / j.sbi.2013.01.006) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Rohe P، Venkanna D، Kleine B، Freudl R، Oldiges M

. 2012 سير عمل آلي لتعزيز تحسين العمليات الحيوية الميكروبية على منصة مفاعل ميكروبي جديد. ميكروب. حقيقة الخلية. 11، 1-14. (دوى: 10.1186 / 1475-2859-11-144) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Long Q و Liu X و Yang Y و Li L و Harvey L و McNeil B و Bai Z

. 2014 تطوير وتطبيق تكنولوجيا الزراعة عالية الإنتاجية في تطوير العمليات الحيوية. J. Biotechnol . 192، 323 - 338. (دوى: 10.1016 / j.jbiotec.2014.03.028) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

جرونزيل ف ، بيلاريك إم ، شتاينبروك د ، نيوباور أ ، براند إي ، كومك إم يو ، نيوباور بي ، كراوس إم

. 2014 طريقة الزراعة على نطاق صغير تمكن من إنتاج البلازميد السريع في الإشريكية القولونية . التكنولوجيا الحيوية. ي . 9، 128-136. (دوى: 10.1002 / biot.201300177) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

كونغ F ، يوان L ، Zheng YF ، Chen W

. 2012 المعالجة التلقائية للسوائل لعلوم الحياة: مراجعة نقدية للوضع الحالي للفن. مختبر J. آلي . 17، 169 - 185. (دوى: 10.1177 / 2211068211435302) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

هيوز SR ، بوت TR ، Bartolett S ، Riedmuller SB ، Farrelly P

. 2011 تصميم وبناء منصة بيولوجيا جزيئية روبوتية متكاملة عالية الإنتاجية من الجيل الأول لتطبيقات الطاقة الحيوية. مختبر J. آلي . 16، 292-307. (دوى: 10.1016 / j.jala.2011.04.004) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2015 التنقية الآلية عالية الإنتاجية للبروتينات المؤتلفة ذات العلامات المتقاربة. طرق مول. بيول. 1286، 97-106. (دوى: 10.1007 / 978-1-4939-2447-9_9) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2016 تحضير العينة الآلي. علم 351، 300-302. (دوى: 10.1126 / العلوم .351.6270.300) كروسريف ، الباحث العلمي من Google

. 2013 إنتاج البولي ببتيد المؤتلف في بكتريا قولونية: نحو نهج عقلاني لتحسين غلة البروتينات الوظيفية. ميكروب. حقيقة الخلية . 12، 101. (دوى: 10.1186 / 1475-2859-12-101) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google


تم النشر بواسطة الجمعية الملكية بموجب شروط رخصة المشاع الإبداعي http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ ، والتي تسمح بالاستخدام غير المقيد ، بشرط ذكر المؤلف والمصدر الأصليين.

مراجع

. 2006 علم الأحياء عالي الإنتاجية في عصر ما بعد الجينوم. J. فاسك. تدخل. راديول . 17، 1077-1085. (دوى: 10.1097 / 01.rvi.0000228840.12260.ff) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

كاميرون دي ، باشور سي جيه ، كولينز جي

. 2014 تاريخ موجز للبيولوجيا التركيبية. نات. القس ميكروبيول . 12، 381 - 390. (دوى: 10.1038 / nrmicro3239) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2006 الفحص المجهري عالي الإنتاجية لبيولوجيا الأنظمة. نات. القس مول. خلية بيول . 7، 690 - 696. (دوى: 10.1038 / nrm1979) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2012 استراتيجيات لإنتاج بروتينات حقيقية النواة النشطة في نظام التعبير البكتيري. باك الآسيوية. جيه تروب. بيوميد. 2، 159–162. (دوى: 10.1016 / S2221-1691 (11) 60213-X) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2014 تعبير البروتين المؤتلف في الإشريكية القولونية: التطورات والتحديات. أمام. ميكروبيول . 5، 172. (دوى: 10.3389 / fmicb.2014.00172) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2001 البروتينات عالية الإنتاجية: تعبير البروتين وتنقيته في عالم ما بعد الجينوم. البروتين Expr. بوريف . 22، 159–164. (دوى: 10.1006 / prep.2001.1465) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2000 تصميم طرق عالية الإنتاجية لإنتاج البروتين للبيولوجيا الهيكلية. بنية 8، R177 – R185. (دوى: 10.1016 / S0969-2126 (00) 00193-3) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Vincentelli R، Cimino A، Geerlof A، Kubo A، Satou Y، Cambillau C

. 2011 فحص وتنقية تعبير البروتين عالي الإنتاجية في الإشريكية القولونية . أساليب 55، 65-72. (دوى: 10.1016 / j.ymeth.2011.08.010) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2011 بناء إنتاجية عالية وفحص تعبير صغير الحجم للمتجهات متعددة العلامات في الإشريكية القولونية . أساليب 55، 29 - 37. (دوى: 10.1016 / j.ymeth.2011.08.002) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Mlynek G، Lehner A، Neuhold J، Leeb S، Kostan J، Charnagalov A، Stolt-Bergner P، Djinovic-Carugo K، Pinotsis N

. 2014 مركز الدراسات الهيكلية المُحسَّنة (COSS) لمنصة الأتمتة في الاستنساخ والتعبير وتنقية البروتينات المفردة ومجمعات البروتين والبروتين. أحماض أمينية 46، 1565-1582. (دوى: 10.1007 / s00726-014-1699-x) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Dieckman L ، Gu M ، Stols L ، Donnelly MI ، Collart FR

. 2002 طرق إنتاجية عالية لاستنساخ الجينات والتعبير عنها. البروتين Expr. بوريف. 25، 1-7. (دوى: 10.1006 / prep.2001.1602) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2013 مصنع بوليميراز الحمض النووي الريبي والنسخ الأثري. تشيم. القس . 113، 8350-8376. (دوى: 10.1021 / cr400148k) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Jia B، Li Z، Liu J، Sun Y، Jia X، Xuan YH، Zhang J، Jeon CO

. 2015 البروتياز المعتمد على الزنك AMZ-tk من الأركشين المحبة للحرارة هو عضو جديد في عائلة بروتين archaemetzincin. أمام. ميكروبيول. 6، 1380. (دوى: 10.3389 / fmicb.2015.01380) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

جيا ب ، ليو ج ، فان دويت إل ، صن واي ، شوان يه ، تشيونغ جي دبليو

. 2015 التنميط البروتيني لاستجابات الإجهاد الحراري والأكسدة والملح في Thermococcus kodakarensis كود 1. أمام. ميكروبيول. 6، 605. (دوى: 10.3389 / fmicb.2015.00605) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2013 الإنزيمات متعددة الوظائف في العتائق: الاختلاط وضوء القمر. المتطرفون 17، ١٩٣-٢٠٣. (دوى: 10.1007 / s00792-012-0509-1) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

هولز سي ، لويكينج أ ، بوفيكامب لام ، جوتجار سي ، بولوتينا إن ، ليهراش إتش ، كاهيل دي جي

. 2001 مكتبة تعبيرات (كدنا) بشرية في الخميرة المخصبة لإطارات القراءة المفتوحة. الدقة الجينوم . 11، 1730 - 1735. (دوى: 10.1101 / gr.181501) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

بوسو ك ، نوردهوف إي ، لوبرت سي ، ليهراش إتش ، والتر جي

. 2000 مكتبة (كدنا) بشرية لفحص التعبير البروتيني عالي الإنتاجية. علم الجينوم 65، 1-8. (دوى: 10.1006 / geno.2000.6141) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2004 مسارات عديدة للعديد من الحيوانات المستنسخة: نظرة مقارنة على طرق الاستنساخ عالية الإنتاجية. الدقة الجينوم . 14، 2020-2028. (دوى: 10.1101 / gr.2528804) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Cao Y، Sun J، Zhu J، Li L، Liu G

. 2010 PrimerCE: تصميم بادئات للاستنساخ والتعبير الجيني. مول. التكنولوجيا الحيوية . 46، 113-117. (دوى: 10.1007 / s12033-010-9276-3) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

كاميلو سم ، ليما مدير عام ، مالوف ف في ، جويدو آر في ، بوليكاربوف الأول

. 2015 HTP-OligoDesigner: أداة تصميم تمهيدي عبر الإنترنت لاستنساخ الجينات عالي الإنتاجية وتوليد الطفرات الموجهة بالموقع. J. كومبوت. بيول . 23، ٢٧-٢٩. (دوى: 10.1089 / cmb.2015.0148) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

أوتو ب ، لارسون ب ، كروجر إس

. 2002 تنقية آلية عالية الإنتاجية لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام جسيمات بارامغناطيسية Wizard® MagneSil ™. مختبر J. آلي . 7، 120-124. (دوى: 10.1016 / s1535-5535-04-00232-1) الباحث العلمي من Google

Xiong AS ، Yao QH ، Peng RH ، Duan H ، Li X ، Fan HQ ، Cheng ZM ، Li Y

. 2006 توليف دقيق قائم على PCR لتسلسل الحمض النووي الطويل. نات. بروتوك . 1، 791-797. (دوى: 10.1038 / nprot.2006.103) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Yehezkel TB، Linshiz G، Buaron H، Kaplan S، Shabi U، Shapiro E

. 2008 من جديد تخليق الحمض النووي باستخدام جزيء واحد PCR. الدقة الأحماض النووية. 36، e107. (دوى: 10.1093 / nar / gkn457) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

كلاين جيه سي ، لاجوي إم جيه ، شوارتز جيه جيه ، ستراوتش إم ، نيلسون جيه ، بيكر دي ، شندور جيه

. 2016 التجميع الزوجي المتعدد لأوليغنوكليوتيدات الحمض النووي المشتقة من الصفيف. الدقة الأحماض النووية . 44، هـ 43. (دوى: 10.1093 / nar / gkv1177) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2014 على نطاق واسع من جديد توليف الحمض النووي: التقنيات والتطبيقات. نات. أساليب 11، 499-507. (دوى: 10.1038 / nmeth.2918) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Quan J، Saaem I، Tang N، Ma S، Negre N، Gong H، White KP، Tian J

. 2011 تركيب الجينات المتوازية على الرقاقة وتطبيقها لتحسين تعبير البروتين. نات. التكنولوجيا الحيوية . 29، 449-452. (دوى: 10.1038 / nbt.1847) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

2015 Codon الأمثل هو محدد رئيسي لاستقرار mRNA. زنزانة 160، 1111-1124. (دوى: 10.1016 / j.cell.2015.02.029) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

فيستا إف ، ستيل جي ، بيان إكس ، لابائر ج

. 2013 إنشاء مكتبة الاستنساخ والتعبير عالية الإنتاجية للبروتيوميات الوظيفية. البروتيوميات 13، ١٣٨١-١٣٩٩. (دوى: 10.1002 / pmic.201200456) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2009 إنتاج البروتين عالي الإنتاجية (HTPP): مراجعة لتقنيات التمكين لتسريع إنتاج البروتين. طرق مول. بيول. 498، 1–18. (دوى: 10.1007 / 978-1-59745-196-3_1) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

بلوميل بي جي ، مارتن بي إيه ، روبيل آر إل ، ستيفن إي ، فوكس بي جي

. 2006 إنتاج خطوة واحدة بكفاءة عالية للبلازميدات التعبيرية من استنساخ (كدنا) باستخدام نظام استنساخ فليكسي فيكتور. البروتين Expr. بوريف . 47، 562-570. (دوى: 10.1016 / j.pep.2005.11.007) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

2008 استكشاف ORFeome البشري: إعداد عالي الإنتاجية لنسخ ORF والتوصيف الفعال لمنتجاتها البروتينية. الدقة DNA . 15، 137 - 149. (دوى: 10.1093 / dnares / dsn004) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

إنجلر سي ، كاندزيا آر ، ماريلونيت إس

. 2008 طريقة استنساخ دقيقة واحدة ، خطوة واحدة ، ذات قدرة إنتاجية عالية. بلوس واحد 3، e3647. (دوى: 10.1371 / journal.pone.0003647) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

ويتمان إل ، جور إم ، نيس J ، ثيودورو إي ، جوستافسون سي ، مينشول ج

. 2013 الاستنساخ السريع لشظايا الجينات باستخدام نظام ناقل إلكترا. جينيه. م. التكنولوجيا الحيوية . 33، 42. (دوى: 10.1089 / gen.33.11.20) الباحث العلمي من Google

Chen WH ، Qin ZJ ، Wang J ، Zhao GP

. 2013 طريقة الربط MASTER (نهايات قابلة للتخصيص بمساعدة المثيلة) لتجميع الحمض النووي السلس. الدقة الأحماض النووية. 41، e93. (دوى: 10.1093 / nar / gkt122) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2015 التطورات الحديثة في تقنيات تجميع الحمض النووي. FEMS الخميرة الدقة . 15، 1–9. (دوى: 10.1111 / 1567-1364.12171) PubMed ، الباحث العلمي من Google

إسبوزيتو د ، غارفي لوس أنجلوس ، تشاكيات سي إس

. 2009 استنساخ البوابة للتعبير عن البروتين. طرق مول. بيول. 498، 31-54. (دوى: 10.1007 / 978-1-59745-196-3_3) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Cheo DL، Titus SA، Byrd DRN، Hartley JL، Temple GF، Brasch MA

. 2004 تجميع واستنساخ مقاطع DNA متعددة باستخدام في المختبر إعادة التركيب الخاصة بالموقع: التحليل الوظيفي لاستنساخ التعبير متعدد الأجزاء. الدقة الجينوم . 14، 2111-2120. (دوى: 10.1101 / gr.2512204) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

تشانغ واي ، ويرلينج يو ، إيدلمان دبليو

. 2012 SLiCE: طريقة استنساخ DNA جديدة تعتمد على خلاصة الخلايا البكتيرية. الدقة الأحماض النووية. 40، e55. (دوى: 10.1093 / nar / gkr1288) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2015 طريقة بسيطة وفعالة لاستنساخ الحمض النووي باستخدام SLiCE من الإشريكية القولونية سلالات المختبر وتطبيقه على الطفرات الموجهة من موقع SLiP. BMC Biotechnol . 15، 47. (دوى: 10.1186 / s12896-015-0162-8) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2015 تقييم طرق تحضير مستخلص استنساخ الربط السلس من أ الإشريكية القولونية سلالة المختبر. شرجي. بيوتشيم . 486، 51-53. (دوى: 10.1016 / j.ab.2015.06.031) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2015 مستخلص استنساخ ربط سلس (SLiCE) بسيط ومنخفض التكلفة محلي الصنع كبديل لمجموعة استنساخ الحمض النووي غير الملحومة المتوفرة تجارياً. بيوتشيم. بيوفيز. اعادة عد. 4، 148-151. (دوى: 10.1016 / j.bbrep.2015.09.005) PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 1990 الاستنساخ المستقل للربط لمنتجات PCR (LIC-PCR). الدقة الأحماض النووية. 18، 6069-6074. (دوى: 10.1093 / nar / 18.20.6069) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

جيبسون دي جي ، يونغ إل ، تشوانغ آر واي ، فينتر جي سي ، هاتشيسون كاليفورنيا ، سميث هو

. 2009 تجميع إنزيمي لجزيئات الحمض النووي يصل إلى عدة مئات من الكيلوبات. نات. أساليب 6، 343-345. (دوى: 10.1038 / nmeth.1318) Crossref و PubMed و ISI و Google Scholar

إيروين كر ، فارمر أ ، ويلر دو ، إيفانز دي إتش

. 2012 In-fusion® الاستنساخ باستخدام بوليميراز DNA لفيروس اللقاح. طرق مول. بيول . 890، 23 - 35. (دوى: 10.1007 / 978-1-61779-876-4_2) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

كلوك هي ، كويزيما إي جيه ، كنوث ميغاواط ، ليزلي سا

. 2008 الجمع بين طريقة التمديد التمهيدي غير المكتملة للبوليميراز للاستنساخ والطفرات مع الفحص المجهري لتسريع جهود علم الجينوم الهيكلي. البروتينات 71، 982-994. (دوى: 10.1002 / prot.21786) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2007 تسخير إعادة التركيب المتماثل في المختبر لتوليد الحمض النووي المؤتلف عبر SLIC. نات. أساليب 4، 251-256. (دوى: 10.1038 / nmeth1010) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2010 Interlap extension استنساخ PCR: طريقة بسيطة وموثوقة لإنشاء البلازميدات المؤتلفة. التقنيات الحيوية 48، 463-465. (دوى: 10.2144 / 000113418) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

ستيفنسون جيه ، كريسر جونيور ، فان إل ، براون إيه جيه

. 2013 مقارنة عملية لتقنيات الاستنساخ المستقلة عن الربط. بلوس واحد 8، e83888. (دوى: 10.1371 / journal.pone.0083888) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

توماس إس ، ماينارد إن دي ، جيل ج

. 2015 بناء مكتبة DNA باستخدام Gibson Assembly®. نات. أساليب 12، 11. (دوى: 10.1038 / nmeth.f.384) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2014 الاستنساخ عالي الإنتاجية والتعبير وتنقية هيدرولازات الجليكوزيد باستخدام الاستنساخ المستقل للربط (LIC). البروتين Expr. بوريف. 99، 35-42. (دوى: 10.1016 / j.pep.2014.03.008) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

شميد-بورغك جيه إل ، شميدت تي ، كايزر الخامس ، هونينج ك ، هورنونج ف

. 2013 تقنية استنساخ مستقلة عن الربط لتجميع عالي الإنتاجية لجينات المستجيب الشبيه بمنشط النسخ. نات. التكنولوجيا الحيوية . 31، 76-81. (دوى: 10.1038 / nbt.2460) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

يوان H و Peng L و Han Z و Xie JJ و Liu XP

. 2015 مكتبة التعبير المؤتلف Pyrococcus furiosus تم إنشاؤها بواسطة الاستنساخ عالي الإنتاجية: أداة مفيدة لعلم الجينوم الوظيفي والهيكلية. أمام. ميكروبيول. 6، 943. (دوى: 10.3389 / fmicb.2015.00943) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

لي إن ، فرانكلين سي ، هاميلتون إب

. 1987 الارتباط الناجم عن الأرابينوز لبروتين AraC بـ araI2 ينشط محفز أوبرا أراباد. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 84، 8814-8818. (دوى: 10.1073 / pnas.84.24.8814) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

جوزمان إل إم ، بيلين D ، كارسون إم جي ، بيكويث جي

. 1995 التنظيم الدقيق والتعديل والتعبير عالي المستوى بواسطة ناقلات تحتوي على مروج أرابينوز PBAD. J. باكتيريول . 177، 4121–4130. كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

أوتو سم ، نياجرو إف ، سو X ، رولينغز كاليفورنيا

. 1995 التعبير عن عامل نخر ورم القطط المأشوب سام الإشريكية القولونية . كلين. التشخيص. مختبر. إمونول . 2، ٧٤٠-٧٤٦. PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2010 استراتيجيات لتحسين التعبير البروتيني في بكتريا قولونية . بالعملة. بروتوك. علوم البروتين. 5، 21-29. (دوى: 10.1002 / 0471140864.ps0524s61) الباحث العلمي من Google

2008 إنتاج البروتين وتنقيته. نات. أساليب 5، 135 - 146. (دوى: 10.1038 / nmeth.f.202) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 1986 استخدام الجراثيم T7 RNA polymerase لتوجيه التعبير الانتقائي عالي المستوى للجينات المستنسخة. جيه مول. بيول . 189، 113-130. (دوى: 10.1016 / 0022-2836 (86) 90385-2) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2000 انخفاض تعبير الخلفية وتحسين استقرار البلازميد مع نواقل الحيوانات الأليفة في BL21 (DE3). التقنيات الحيوية 29، ١٢٣٤-١٢٣٨. كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2004 T7 الليزوزيم يقمع نسخ بوليميريز T7 RNA عن طريق زعزعة استقرار المركب المفتوح أثناء البدء. J. بيول. تشيم . 279، 16136-16143. (دوى: 10.1074 / jbc.M400139200) كروسريف ، الباحث العلمي من Google

. 1996 الإفراط في إنتاج البروتينات في الإشريكية القولونية: مضيفات متحولة تسمح بتركيب بعض البروتينات الغشائية والبروتينات الكروية بمستويات عالية. جيه مول. بيول . 260، 289 - 298. (دوى: 10.1006 / jmbi.1996.0399) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

ضبط 2008 الإشريكية القولونية لفرط بروتين الغشاء. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 105، 14 371-14 376. (دوى: 10.1073 / pnas.0804090105) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 1983 مقارنة بدء تخليق البروتين في بدائيات النواة ، حقيقيات النوى ، والعضيات. ميكروبيول. القس . 47، 1–45. PubMed ، الباحث العلمي من Google

Cheong DE، Ko KC، Han Y، Jeon HG، Sung BH، Kim GJ، Choi JH، Song JJ

. 2015 تعزيز التعبير الوظيفي للبروتينات غير المتجانسة من خلال الاستبدال العشوائي للرموز الجينية في منطقة الترميز 5 '. التكنولوجيا الحيوية. بيونج . 112، ٨٢٢-٨٢٦. (دوى: 10.1002 / bit.25478) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

2013 التعبير الجيني الدقيق والموثوق من خلال عناصر النسخ القياسية وبدء الترجمة. نات. أساليب 10، 354-360. (دوى: 10.1038 / nmeth.2404) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Liebeton K ، Lengefeld J ، Eck J

. 2014 يؤثر تكوين النوكليوتيدات لتسلسل المباعد على إنتاجية التعبير عن الجينات المعبر عنها بشكل غير متجانس في العصوية الرقيقة . J. Biotechnol . 191، 214 - 220. (دوى: 10.1016 / j.jbiotec.2014.06.027) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2012 صقل شبكات الجينات باستخدام تكرار تسلسل بسيط. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 109، 16 817-16822. (دوى: 10.1073 / pnas.1205693109) كروسريف ، الباحث العلمي من Google

ميرزاده K ، مارتينيز الخامس ، توددو إس ، جونتور إس ، هيرجارد إم جي ، إيلوفسون أ ، نورهولم إم إتش ، دالي دو

. 2015 إنتاج البروتين المحسن في الإشريكية القولونية عن طريق تحسين ندوب الاستنساخ عند تقاطع تسلسل ترميز ناقل. موالفة ACS. بيول . 4، 959-965. (دوى: 10.1021 / acssynbio.5b00033) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2005 تنظيم الترجمة عبر بنية mRNA في بدائيات النوى وحقيقيات النوى. الجين 361، 13 - 37. (دوى: 10.1016 / j.gene.2005.06.037) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

غولترمان L، بورش جنسن M، بنتين تي

. 2011 ضبط تعبير البروتين باستخدام مكتبات كودون مترادفة تستهدف منطقة ترميز 5-mRNA. هندسة البروتين. ديس. سيل . 24، 123 - 129. (دوى: 10.1093 / بروتين / gzq086) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

بنتيل ك ، سافرت ف ، راوشر آر ، إغناتوفا زد ، بلوثجن إن

. 2013 بدء الترجمة الفعالة يفرض استخدام الكودون عند بدء الجين. مول. النظام. بيول . 9، 675. (دوى: 10.1038 / msb.2013.32) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Goodman DB ، Church GM ، Kosuri S.

. 2013 أسباب وتأثيرات انحياز كودون N- طرفي في الجينات البكتيرية. علم 342، 475-479. (دوى: 10.1126 / العلوم .1241934) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

2010 آلية محفوظة تطوريًا للتحكم في كفاءة ترجمة البروتين. زنزانة 141، 344–354. (دوى: 10.1016 / j.cell.2010.03.031) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

2016 تأثير Codon على تعبير البروتين في بكتريا قولونية يرتبط بمستويات الرنا المرسال. طبيعة سجية 529، 358 - 363. (دوى: 10.1038 / nature16509) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Castillo-Mendez MA، Jacinto-Loeza E، Olivares-Trejo JJ، Guarneros-Pena G، Hernandez-Sanchez J

. تعزز الكودونات المحتوية على الأدينين 2012 تخليق البروتين عن طريق تعزيز ارتباط الرنا المرسال للوحدات الفرعية الريبوزومية 30S بشرط عدم استنفاد الحمض الريبي النووي النقال المحدد. بيوكيمي 94، ٦٦٢ - ٦٧٢. (دوى: 10.1016 / j.biochi.2011.09.019) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2014 طريقة لتعزيز التعبير البروتيني المتعلق بالأكسدة النباتية وتطبيقاته في المختبر الحد من thioredoxins البلاستيدات الخضراء. البروتين Expr. بوريف . 101، 152-156. (دوى: 10.1016 / j.pep.2014.07.001) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

كريشنا راو DV ، Rao JV ، Narasu ML ، Bhujanga Rao AK

. 2008 تحسين محتوى AT من الكودونات مباشرة بعد كودون البدء وتقييم ظروف الثقافة للتعبير عالي المستوى عن G-CSF البشري المؤتلف في الإشريكية القولونية . مول. التكنولوجيا الحيوية . 38، ٢٢١ - ٢٣٢. (دوى: 10.1007 / s12033-007-9018-3) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Care S ، Bignon C ، Pelissier MC ، Blanc E ، Canard B ، Coutard B

. 2008 ترجمة البروتينات المؤتلفة في بكتريا قولونية يمكن تحسينها بواسطة في السيليكو إنشاء وفحص مكتبات عشوائية لمنطقة 70 / + 96 mRNA فيما يتعلق بكودون بدء الترجمة. الدقة الأحماض النووية . 36، e6. (دوى: 10.1093 / nar / gkm1097) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Salis HM ، Mirsky EA ، Voigt CA

. 2009 التصميم الآلي لمواقع ربط الريبوسوم الاصطناعية للتحكم في التعبير البروتيني. نات. التكنولوجيا الحيوية . 27، ٩٤٦-٩٥٠. (دوى: 10.1038 / nbt.1568) Crossref و PubMed و ISI و Google Scholar

. 2010 RBSDesigner: برنامج لتصميم مواقع ربط الريبوسوم الاصطناعية التي تعطي المستوى المطلوب من التعبير البروتيني. المعلوماتية الحيوية 26، ٢٦٣٣-٢٦٣٤. (دوى: 10.1093 / المعلوماتية الحيوية / btq458) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Seo SW و Yang JS و Kim I و Yang J و Min BE و Kim S و Jung GY

. 2013 التصميم التنبئي لمنطقة بدء ترجمة mRNA للتحكم في كفاءة الترجمة بدائية النواة. متعب. م . 15، 67-74. (دوى: 10.1016 / j.ymben.2012.10.006) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Bonde MT، Pedersen M، Klausen MS، Jensen SI، Wulff T، Harrison S، Nielsen AT، Herrgard MJ، Sommer MOA

. 2016 ضبط متوقع لتعبير البروتين في البكتيريا. نات. أساليب 13، 233-236. (دوى: 10.1038 / nmeth.3727) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

ريف ب ، هارجست تي ، جيلبرت سي ، إليس تي

. 2014 توقع معدلات بدء الترجمة لتصميم البيولوجيا التركيبية. أمام. بيونج. التكنولوجيا الحيوية . 2، 1. (doi: 10.3389 / fbioe.2014.00001) Crossref، PubMed، Google Scholar

. 1989 الاستنساخ الجزيئي: دليل معمل ، الطبعة الثانية. نيويورك ، نيويورك: مطبعة كولد سبرينغ. منحة جوجل

. 2004 نظرة عامة على علامات التقارب لتنقية البروتين. بالعملة. بروتوك. علوم البروتين. 9، 9. (دوى: 10.1002 / 0471140864.ps0909s36) PubMed ، الباحث العلمي من Google

كوستا S ، ألميدا أ ، كاسترو أ ، دومينجيز إل

. 2014 علامات الانصهار لقابلية ذوبان البروتين وتنقيته والمناعة في الإشريكية القولونية: نظام رواية Fh8. أمام. ميكروبيول. 5، 63. (دوى: 10.3389 / fmicb.2014.00063) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2013 عدة علامات تقارب شائعة الاستخدام في التنقية الكروماتوغرافية. J. الشرج. طرق علم . 2013، 581093. (دوى: 10.1155 / 2013/581093) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2001 وجهات نظر كروماتوغرافيا تقارب المعدن الثابت. J. Biochem. بيوفيز. أساليب 49، 335-360. (دوى: 10.1016 / S0165-022X (01) 00207-X) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

شميدت PM ، Sparrow LG ، Attwood RM ، Xiao X ، Adams TE ، McKimm-Breschkin JL

. 2012 إنزال FLAG! كيف يتحدى تعبير خلية الحشرات نظام العلامات الراسخ. بلوس واحد 7، e37779. (دوى: 10.1371 / journal.pone.0037779) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2007 نظام Strep-tag للتنقية بخطوة واحدة واكتشاف التقارب العالي أو التقاط البروتينات. نات. بروتوك . 2، ١٥٢٨-١٥٣٥. (دوى: 10.1038 / nprot.2007.209) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

دايسون إم آر ، شادبولت إس بي ، فينسينت كي جي ، بيريرا آر إل ، مكافيرتي جي

. 2004 إنتاج بروتينات الثدييات القابلة للذوبان في الإشريكية القولونية: تحديد خصائص البروتين التي ترتبط بالتعبير الناجح. BMC Biotechnol . 4، 32. (دوى: 10.1186 / 1472-6750-4-32) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Zuo X، Li S، Hall J، Mattern MR، Tran H، Shoo J، Tan R، Weiss SR، Butt TR

. 2005 التعبير المحسن وتنقية بروتينات الغشاء عن طريق اندماج SUMO في الإشريكية القولونية . J. الهيكل. Funct. علم الجينوم 6، 103-111. (دوى: 10.1007 / s10969-005-2664-4) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

هامون J ، Palanivelu DV ، Chen J ، Patel C ، Minor DL

. 2009 شاشة بروتين فلورية خضراء لتحديد بروتينات الغشاء المعبر عنها جيدًا من مجموعة من الكائنات الحية المتطرفة. علوم البروتين . 18، ١٢١ - ١٣٣. (دوى: 10.1002 / pro.18) PubMed ، الباحث العلمي من Google

ليليوس جي ، بيرسون إم ، بولو إل ، موسباخ ك

. 1991 ترسيب تقارب المعادن للبروتينات التي تحمل ذيول تقارب متعدد الهيستدين المتصل وراثيا. يورو. J. Biochem . 198، 499-504. (دوى: 10.1111 / j.1432-1033.1991.tb16042.x) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2003 التعبير عالي المستوى والتنقية السريعة لجينات الكودون النادرة من العتائق شديدة الحرارة بواسطة نظام الاندماج الجيني GST. تشروماتوجر. تحليل ب. تكنول. بيوميد. علوم الحياة . 786، 177 - 185. (دوى: 10.1016 / S1570-0232 (02) 00810-3) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

كولمان MA ، Lao VH ، Segelke BW ، Beernink PT

. 2004 فحص عالي الإنتاجية قائم على التألق لتعبير البروتين القابل للذوبان. J. بروتيوم الدقة . 3، 1024-1032. (دوى: 10.1021 / pr049912g) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

هيويت SN، Choi R، Kelley A، Crowther GJ، Napuli AJ، Van Voorhis WC

. 2011 التعبير عن البروتينات في الإشريكية القولونية كاندماج مع بروتين ربط المالتوز لإنقاذ الأهداف غير المعبر عنها في خط أنابيب تنقية وتعبير البروتين عالي الإنتاجية. اكتا Crystallogr. الطائفة. F الهيكل. بيول. كريست. كومون . 67، 1006-1009. (دوى: 10.1107 / s1744309111022159) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2006 تعزيز التعبير البروتيني القابل للذوبان من خلال استخدام علامات الانصهار. بالعملة. رأي. التكنولوجيا الحيوية . 17، 353 - 358. (دوى: 10.1016 / j.copbio.2006.06.003) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

كوستا إس جيه ، كويلو إي ، فرانكو إل ، ألميدا أ ، كاسترو إيه ، دومينجيز إل

. 2013 علامة Fh8: شريك اندماج لتنقية البروتين بطريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة في الإشريكية القولونية . البروتين Expr. بوريف. 92، ١٦٣-١٧٠. (دوى: 10.1016 / j.pep.2013.09.013) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

مكلوسكي أج ، بون جنرال موتورز ، غاريبي ي

. 2007 استراتيجية تنقية ترادفية سريعة وشاملة للبروتينات المؤتلفة. علوم البروتين . 16، ٢٧٢٦-٢٧٣٢. (دوى: 10.1110 / ps.072894407) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2010 مجموعات العلامات شائعة الاستخدام لتنقية التقارب الترادفي. التكنولوجيا الحيوية. تطبيق بيوتشيم . 55، 73-83. (دوى: 10.1042 / ba20090273) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2000 طوبولوجيا الغشاء وإدخال البروتينات الغشائية: البحث عن إشارات طوبوجينية. ميكروبيول. مول. بيول. القس . 64، 13 - 33. (دوى: 10.1128 / mmbr.64.1.13-33.2000) Crossref و PubMed و ISI و Google Scholar

2005 خط أنابيب قابل للتطوير يعتمد على GFP لفحص البروتين الغشائي الزائد وتنقيته. علوم البروتين. 14، 2011-2017. (دوى: 10.1110 / ps.051466205) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

درو د ، ليرش إم ، كونجي إي ، سلوتبوم دي جي ، دي جير جي دبليو

. 2006 التحسين من الإفراط في التعبير عن البروتين الغشائي وتنقيته باستخدام اندماج GFP. نات. أساليب 3، 303 - 313. (دوى: 10.1038 / nmeth0406-303) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

درو د ، نيوستيد إس ، سونودا واي ، كيم إتش ، فون هايجن جي ، إيواتا إس

. 2008 مخطط التحسين القائم على GFP للإفراط في التعبير وتنقية بروتينات الغشاء حقيقية النواة في خميرة الخميرة . نات. بروتوك. 3، 784-798. (دوى: 10.1038 / nprot.2008.44) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Backmark AE، Olivier N، Snijder A، Gordon E، Dekker N، Ferguson AD

. 2013 مسبار الفلورسنت للفحص عالي الإنتاجية لتعبير بروتين الغشاء. علوم البروتين . 22، ١١٢٤-١١٣٢. (دوى: 10.1002 / pro.2297) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Zhang YB، Howitt J، McCorkle S، Lawrence P، Springer K، Freimuth P

. 2004 تراكم البروتين أثناء الإفراط في التعبير المحدود بامتدادات الببتيد ذات الشحنة السلبية الصافية الكبيرة. البروتين Expr. بوريف. 36، 207-216. (دوى: 10.1016 / j.pep.2004.04.020) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Roosild TP، Greenwald J، Vega M، Castronovo S، Riek R، Choe S

. 2005 بنية NMR لـ Mistic ، بروتين متكامل الغشاء للتعبير عن بروتين الغشاء. علم 307، ١٣١٧-١٣٢١. (دوى: 10.1126 / العلوم. 1106392) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

ليفياتان إس ، ساوادا ك ، مورياما واي ، نيلسون إن

. 2010 طريقة اندماجية للإفراط في التعبير عن بروتينات الغشاء في الإشريكية القولونية . J. بيول. تشيم . 285، 23548–23 556. (دوى: 10.1074 / jbc.M110.125492) كروسريف ، الباحث العلمي من Google

. 2001 فحص التعبير القابل للذوبان عن البروتينات المؤتلفة في شكل 96 بئر. شرجي. بيوتشيم . 297، 79-85. (دوى: 10.1006 / abio.2001.5331) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2013 التقدير الكمي الفوري عالي الإنتاجية لتعبير البروتين ونقاوته استنادًا إلى إيقاف / إيقاف تشغيل / إيقاف بروتين أصفر ضوئيًا. علوم البروتين. 22، 1109-1117. (دوى: 10.1002 / pro.2286) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

2016 تصميم آلي قائم على الهيكل والتسلسل للبروتينات من أجل التعبير البكتيري العالي والاستقرار. مول. زنزانة 63، 337–346. (دوى: 10.1016 / j.molcel.2016.06.012) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

2015 إعادة تشكيل البروتينات بوساطة القص والإجهاد من الركام وأجسام التضمين. كيمبيوتشيم 16، 393–396. (دوى: 10.1002 / cbic.201402427) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

. 2011 نظرة عامة على الكواشف الأنزيمية لإزالة علامات التقارب. البروتين Expr. بوريف. 80، 283 - 293. (دوى: 10.1016 / j.pep.2011.08.005) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2011 حساسية المنظفات المتغيرة للبروتياز المستخدمة في إزالة علامة تقارب البروتين المؤتلف. البروتين Expr. بوريف. 78، 139 - 142. (دوى: 10.1016 / j.pep.2011.04.011) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

ديفيس جي جي ، وانغ كيو إم ، كوكس جي إيه ، جونسون آر بي ، واكولتشيك إم ، دوتسون كاليفورنيا ، فياريال إي سي

. 1997 التعبير عن فيروس الأنف المؤتلف وتنقيته 14 بروتيناز 3CD ومقارنته ببروتينيز 3C. قوس. بيوتشيم. بيوفيز . 346، 125-130. (دوى: 10.1006 / abbi.1997.0291) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

جوزيف ب.

. 2015 نظرة عامة على معلمات التعبير البروتيني المؤتلف في الإشريكية القولونية . J. خلية علوم. هناك . 6، 5. (دوى: 10.4172 / 2157-7013.1000221) كروسريف ، الباحث العلمي من Google

وو X ، يورنفال إتش ، بيرندت دينار كويتي ، أوبرمان يو

. يكشف تحسين Codon لعام 2004 عن العوامل الحاسمة للتعبير عالي المستوى لجينين من الكودونات النادرة في الإشريكية القولونية: استقرار الحمض النووي الريبي والبنية الثانوية ولكن ليس وفرة الحمض النووي الريبي. بيوتشيم. بيوفيز. الدقة. كومون . 313، 89-96. (دوى: 10.1016 / j.bbrc.2003.11.091) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

برينز WA، Aslund F، Holmgren A، Beckwith J

. 1997 دور مسارات thioredoxin و glutaredoxin في تقليل روابط ثاني كبريتيد البروتين في الإشريكية القولونية السيتوبلازم . J. بيول. تشيم. 272، 15 661-15 667. (دوى: 10.1074 / jbc.272.25.15661) كروسريف ، الباحث العلمي من Google

تشانغ المفوض السامي ، سيسنيروس آر جيه ، دنلاب آر بي ، جونسون إل إف

. 1989 التوليف الفعال لمركب الفأر thymidylate في الإشريكية القولونية . الجين 84، 487-491. (دوى: 10.1016 / 0378-1119 (89) 90525-8) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

وينر إم ، أندرسون سي ، جيربسيث ب ، ويلز إس ، جونسون براون بي ، فيلانكورت بي

. 1994 ناقل ومضيفي نظام Studier pET. إستراتيجيات. مول. بيول . 7، 41-43. منحة جوجل

2003 التعبير عن المؤتلف مثل IRP المتصورة المنجلية البروتين الذي يربط على وجه التحديد IREs البلازمية المفترضة. مول. بيوتشيم. باراسيتول . 126، 231 - 238. (دوى: 10.1016 / S0166-6851 (02) 00278-5) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Schlegel S ، Lofblom J ، Lee C ، Hjelm A ، Klepsch M ، Strous M ، Drew D ، Slotboom DJ ، de Gier JW

. 2012 تحسين إفراط بروتين الغشاء في الإشريكية القولونية سلالة Lemo21 (DE3). جيه مول. بيول . 423، 648-659. (دوى: 10.1016 / j.jmb.2012.07.019) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

لوبيز بي جيه ، مارشاند الأول ، جويس سا ، دريفوس م

. 1999 النصف الطرفي C من RNase E ، الذي ينظم الإشريكية القولونية التحلل ، يشارك في تدهور الرنا المرسال ولكن ليس معالجة الرنا الريباسي في الجسم الحي . مول. ميكروبيول . 33، ١٨٨-١٩٩. (دوى: 10.1046 / j.1365-2958.1999.01465.x) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2013 توسيع نطاق إنتاج البروتين المؤتلف في الإشريكية القولونية . التكنولوجيا الحيوية. بادئة رسالة . 35، 1971-1981. (دوى: 10.1007 / s10529-013-1396-y) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

موراتا تي ، شينوزوكا واي ، أوباتا واي ، يوكوياما ك

. 2008 فسفرة اثنين من عوامل النسخ حقيقية النواة ، بروتين Jun dimerization 2 وعامل نسخ التنشيط 2 ، في الإشريكية القولونية بواسطة Jun N-terminal kinase 1. شرجي. بيوتشيم . 376، 115 - 121. (دوى: 10.1016 / j.ab.2008.01.038) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

2002 الارتباط بالجليكوزيل المرتبط بـ N في العطيفة الصائمية ونقل وظيفته إلى بكتريا قولونية . علم 298، 1790 - 1793. (دوى: 10.1126 / العلوم .298.5599.1790) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Ihssen J، Kowarik M، Dilettoso S، Tanner C، Wacker M، Thony-Meyer L

. 2010 إنتاج لقاحات البروتين السكري في الإشريكية القولونية . ميكروب. حقيقة الخلية . 9، 61. (دوى: 10.1186 / 1475-2859-9-61) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

ليزاك سي ، فان واي واي ، ويبر تي سي ، إيبي إم

. 2011 الارتباط بالجليكوزيل المرتبط بـ N لشظايا الأجسام المضادة في الإشريكية القولونية . Bioconjug. تشيم . 22، 488-496. (دوى: 10.1021 / bc100511k) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2012 إعادة التكوين الوظيفي لمسار سومويل قابل للضبط يعتمد على E3 في الإشريكية القولونية . بلوس واحد 7، e38671. (دوى: 10.1371 / journal.pone.0038671) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Magnani R ، Chaffin B ، Dick E ، Bricken ML ، Houtz RL ، Bradley LH

. 2012 استخدام نظام التعبير المشترك كالمودولين ليسين ميثيل ترانسفيراز لتوليد مكتبة اندماجية للبروتينات المعدلة بعد متعدية. البروتين Expr. بوريف. 86، 83-88. (دوى: 10.1016 / j.pep.2012.09.012) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

دورونيو آر جيه ، جاكسون-ماتشلسكي إي ، هيوكروث رو ، أولينز بو ، ديفين سي إس ، يونيموتو دبليو ، سلايس إل دبليو ، تايلور إس إس ، جوردون جي

. 1990 بروتين N- ميريستول في الإشريكية القولونية: إعادة تشكيل تعديل البروتين حقيقية النواة في البكتيريا. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 87، 1506-1510. (دوى: 10.1073 / pnas.87.4.1506) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Ren Y و Yao X و Dai H و Li S و Fang H و Chen H و Zhou C

. 2011 إنتاج ثيموسين α1-acetylated Nα بوصة الإشريكية القولونية . ميكروب. حقيقة الخلية . 10، 26. (دوى: 10.1186 / 1475-2859-10-26) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Gubellini F ، Verdon G ، Karpowich NK ، Luff JD ، Boel G ، Gauthier N ، Handelman SK ، Ades SE ، Hunt JF

. 2011 الاستجابة الفسيولوجية لإفراط بروتين الغشاء في ه. القولونية. مول. بروتينات الخلية 10، M111.007930. (دوى: 10.1074 / mcp.M111.007930) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

2011 التغلب على الحواجز التي تحول دون تحديد بنية بروتين الغشاء. نات. التكنولوجيا الحيوية . 29، 335 - 340. (دوى: 10.1038 / nbt.1833) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Marreddy RKR ، Geertsma ER ، Poolman B

. 2011 إنتاج بروتين الغشاء المؤتلف: الماضي والحاضر والمستقبل. في التركيب والوظيفة فوق الجزيئات 10 (محرران

Brnjas-Kraljević J، Pifat-Mrzljak G

) ، ص 41 - 74. دوردريخت ، هولندا: سبرينغر. كروسريف ، الباحث العلمي من Google

Luirink J ، Yu Z ، Wagner S ، de Gier JW

. 2012 التكاثر الحيوي لبروتينات الغشاء الداخلي في الإشريكية القولونية . بيوكيم. بيوفيز. اكتا . 1817، 965-976. (دوى: 10.1016 / j.bbabio.2011.12.006) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Kwon SK ، Kim SK ، Lee DH ، Kim JF

. 2015 علم الجينوم المقارن والتطور التجريبي لـ الإشريكية القولونية تكشف سلالات BL21 (DE3) عن طبيعة هروب السمية من إنتاج البروتين الغشائي المفرط. علوم. اعادة عد . 5، 16076. (دوى: 10.1038 / srep16076) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Wagner S، Baars L، Ytterberg AJ، Klussmeier A، Wagner CS، Nord O، Nygren PÅ، van Wijk KJ، de Gier JW

. 2007 عواقب فرط إفراز البروتين الغشائي في الإشريكية القولونية . مول. سل. البروتيوميات 6، 1527-1550. (دوى: 10.1074 / mcp.M600431-MCP200) كروسريف ، الباحث العلمي من Google

Chen Y، Song J، Sui SF، Wang DN

. سهلت 2003 DnaK و DnaJ عملية الطي وتقليل تكوين الجسم المتضمن لناقل المغنيسيوم CorA الذي يتم التعبير عنه بشكل مفرط في الإشريكية القولونية . البروتين Expr. بوريف. 32، ٢٢١-٢٣١. (دوى: 10.1016 / S1046-5928 (03) 00233-X) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Link AJ، Skretas G، Strauch EM، Chari NS، Georgiou G

. 2008 الإنتاج الفعال لمستقبلات البروتين G المدمجة في الأغشية والقابلة للذوبان في المنظفات في الإشريكية القولونية . علوم البروتين . 17، ١٨٥٧-١٨٦٣. (دوى: 10.1110 / ps.035980.108) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

سكريتاس جي ، ماكينو تي ، فاراداراجان إن ، بوغسون إم ، جورجيو جي

. 2012 الجينات متعددة النسخ التي تعزز إنتاج مستقبلات البروتين المقترنة بالثدييات في الإشريكية القولونية . متعب. م . 14، 591-602. (دوى: 10.1016 / j.ymben.2012.05.001) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2009 التحليل الجيني لتعبير مستقبلات البروتين المقترن G في الإشريكية القولونية: الدور التثبيطي لـ DnaJ على تكامل الغشاء لمستقبلات القنب المركزية البشرية. التكنولوجيا الحيوية. بيونج . 102، 357 - 367. (دوى: 10.1002 / bit.22097) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Schlegel S، Hjelm A، Baumgarten T، Vikstrom D، de Gier JW

. 2014 إنتاج بروتين الغشاء البكتيري. بيوكيم. بيوفيز. اكتا . 1843، ١٧٣٩-١٧٤٩. (دوى: 10.1016 / j.bbamcr.2013.10.023) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

سيزونوف جي ، جوزيلو بيتي دي ، داري آر

. 2007 الإشريكية القولونية علم وظائف الأعضاء في مرق Luria-Bertani. J. باكتيريول . 189، 8746-8749. (دوى: 10.1128 / jb.01368-07) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2005 إنتاج البروتين عن طريق الحث الذاتي في مزارع اهتزاز عالية الكثافة. البروتين Expr. بوريف. 41، 207-234. (دوى: 10.1016 / j.pep.2005.01.016) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Losen M، Frölich B، Pohl M، Büchs J

. 2004 تأثير الحد من الأكسجين والتكوين المتوسط ​​على الإشريكية القولونية التخمير في مزارع اهتزاز القارورة. التكنولوجيا الحيوية. بروغ . 20، 1062-1068. (دوى: 10.1021 / bp034282t) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2006 إنتاج البروتينات المؤتلفة عن طريق زراعة الخلايا عالية الكثافة الإشريكية القولونية . تشيم. م. تكنول . 61، 876-885. (دوى: 10.1016 / j.ces.2005.03.031) كروسريف ، الباحث العلمي من Google

Song JM ، An YJ ، Kang MH ، Lee YH ، Cha SS

. 2012 تعتبر الزراعة عند درجة حرارة 6-10 درجة مئوية استراتيجية فعالة للتغلب على عدم قابلية ذوبان البروتينات المؤتلفة في الإشريكية القولونية . البروتين Expr. بوريف. 82، 297-301. (دوى: 10.1016 / j.pep.2012.01.020) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Castellanos-Mendoza A، Castro-Acosta RM، Olvera A، Zavala G، Mendoza-Vera M، García-Hernández E، Alagón A، Trujillo-Roldán MA، Valdez-Cruz NA

. 2014 تأثير التحكم في الأس الهيدروجيني في تكوين أجسام متضمنة أثناء إنتاج sphingomyelinase-D المؤتلف في الإشريكية القولونية . ميكروب. حقيقة الخلية. 13، 1-14. (دوى: 10.1186 / s12934-014-0137-9) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Yang Q و Xu J و Li M و Lei X و An L.

. 2003 تعبير عالي المستوى عن إنزيم سم الثعبان القابل للذوبان ، gloshedobin ، in بكتريا قولونية في وجود أيونات معدنية. التكنولوجيا الحيوية. بادئة رسالة . 25، 607-610. (دوى: 10.1023 / A: 1023067626846) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2005 التعبير القابل للذوبان عن البروتينات المؤتلفة في سيتوبلازم الإشريكية القولونية . ميكروب. حقيقة الخلية. 4، 1-8. (دوى: 10.1186 / 1475-2859-4-1) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2015 Triton X-100 يعزز قابلية الذوبان والإفراز للبولولانيز المعرض للتجميع المنتج في الإشريكية القولونية . بيوريسور. تكنول . 194، 137-143. (دوى: 10.1016 / j.biortech.2015.07.024) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

موندال إس ، شيت د ، براسانا سي ، أتريا إتش إس

. 2013 إنتاجية عالية من البروتينات في بكتريا قولونية لدراسات الرنين المغناطيسي النووي. حال. بيوسكي. التكنولوجيا الحيوية . 4، 751-767. (دوى: 10.4236 / abb.2013.46099) كروسريف ، الباحث العلمي من Google

. 2015 التغلب على مشكلة الذوبان في بكتريا قولونية: الأساليب المتاحة لإنتاج البروتين المؤتلف. طرق مول. بيول. 1258، 27-44. (دوى: 10.1007 / 978-1-4939-2205-5_2) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2011 ضبط معلمات التعبير المختلفة لتحقيق بروتينات قابلة للذوبان في المؤتلف بكتريا قولونية: مزايا الغربلة عالية الإنتاجية. التكنولوجيا الحيوية. ي . 6، ٧١٥-٧٣٠. (دوى: 10.1002 / biot.201100025) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Ukkonen K، Mayer S، Vasala A، Neubauer P

. 2013 إن استخدام التغذية البطيئة للجلوكوز كمصدر داعم للكربون في وسط الحث الذاتي للاكتوز يحسن من متانة تعبير البروتين في ظروف تهوية مختلفة. البروتين Expr. بوريف. 91، 147-154. (دوى: 10.1016 / j.pep.2013.07.016) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2013 التعبير في الإشريكية القولونية: أن تصبح أسرع وأكثر تعقيدًا. بالعملة. رأي. هيكل. بيول . 23، 326 - 334. (دوى: 10.1016 / j.sbi.2013.01.006) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Rohe P، Venkanna D، Kleine B، Freudl R، Oldiges M

. 2012 سير عمل آلي لتعزيز تحسين العمليات الحيوية الميكروبية على منصة مفاعل ميكروبي جديد. ميكروب. حقيقة الخلية. 11، 1-14. (دوى: 10.1186 / 1475-2859-11-144) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

Long Q و Liu X و Yang Y و Li L و Harvey L و McNeil B و Bai Z

. 2014 تطوير وتطبيق تكنولوجيا الزراعة عالية الإنتاجية في تطوير العمليات الحيوية. J. Biotechnol . 192، 323 - 338. (دوى: 10.1016 / j.jbiotec.2014.03.028) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

جرونزيل ف ، بيلاريك إم ، شتاينبروك د ، نيوباور أ ، براند إي ، كومك إم يو ، نيوباور بي ، كراوس إم

. 2014 طريقة الزراعة على نطاق صغير تمكن من إنتاج البلازميد السريع في الإشريكية القولونية . التكنولوجيا الحيوية. ي . 9، 128-136. (دوى: 10.1002 / biot.201300177) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

كونغ F ، يوان L ، Zheng YF ، Chen W

. 2012 المعالجة التلقائية للسوائل لعلوم الحياة: مراجعة نقدية للوضع الحالي للفن. مختبر J. آلي . 17، 169 - 185. (دوى: 10.1177 / 2211068211435302) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

هيوز SR ، بوت TR ، Bartolett S ، Riedmuller SB ، Farrelly P

. 2011 تصميم وبناء منصة بيولوجيا جزيئية روبوتية متكاملة عالية الإنتاجية من الجيل الأول لتطبيقات الطاقة الحيوية. مختبر J. آلي . 16، 292-307. (دوى: 10.1016 / j.jala.2011.04.004) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2015 التنقية الآلية عالية الإنتاجية للبروتينات المؤتلفة ذات العلامات المتقاربة. طرق مول. بيول. 1286، 97-106. (دوى: 10.1007 / 978-1-4939-2447-9_9) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2016 تحضير العينة الآلي. علم 351، 300-302. (دوى: 10.1126 / العلوم .351.6270.300) كروسريف ، الباحث العلمي من Google

. 2013 إنتاج البولي ببتيد المؤتلف في بكتريا قولونية: نحو نهج عقلاني لتحسين غلة البروتينات الوظيفية. ميكروب. حقيقة الخلية . 12، 101. (دوى: 10.1186 / 1475-2859-12-101) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google


لماذا لا يكون للنوكلياز الخارجي T5 نشاط نوكلياز داخلي في تجميع جيبسون؟ - مادة الاحياء

أدت الآفات ومسببات الأمراض النباتية الناشئة إلى خفض غلة المحاصيل وجودتها ، الأمر الذي هدد الأمن الغذائي العالمي. لعبت طرق التربية التقليدية ، ونهج التربية المعتمدة على الواسمات الجزيئية ، واستخدام المحاصيل المعدلة وراثيًا دورًا حاسمًا في تعزيز الأمن الغذائي في جميع أنحاء العالم. ومع ذلك ، فإن استخداماتها في تحسين المحاصيل كانت محدودة للغاية بسبب المحاذير المتعددة. لقد تغلبت أدوات تحرير الجينوم مثل نوكليازات المستجيب الشبيهة بالمنشط النسخي والمجمعة بانتظام بين التكرارات المتناظرة القصيرة (CRISPR) المرتبطة بالنوكلياز الداخلي Cas9 (CRISPR / Cas9) بشكل فعال على قيود أساليب التربية التقليدية وتم قبولها على نطاق واسع لتحسين المحاصيل. من بين أدوات تحرير الجينوم ، برز نظام CRISPR / Cas9 كأقوى أداة لتحرير الجينوم بسبب كفاءته ، ولطفه ، ومرونته ، وتكلفته المنخفضة ، وقدرته على التكيف. تشير الأدلة المتراكمة إلى أن تحرير الجينوم له إمكانات كبيرة في تحسين مقاومة الأمراض في نباتات المحاصيل. في هذا الاستعراض ، قدمنا ​​مقدمة موجزة لآليات أنظمة تحرير الجينوم المختلفة ثم ناقشنا التطورات الأخيرة في تحرير الجينوم القائم على نظام CRISPR / Cas9 من أجل تعزيز مقاومة أمراض الأرز من خلال استراتيجيات مختلفة. ناقشت هذه المراجعة أيضًا التطبيقات المحتملة لأساليب تحرير الجينوم التي تم تطويرها مؤخرًا مثل CRISPR / Cas12a (المعروف سابقًا باسم Cpf1) والمحررين الأساسيين لتعزيز مقاومة أمراض الأرز.

أرز (أرز أسيوي L.) بمثابة مصدر مهم للكربوهيدرات لأكثر من ثلثي سكان العالم. إن تزايد عدد السكان المقترن بالتغير المناخي وظهور مسببات الأمراض النباتية الجديدة له تأثير كبير على إنتاجية الأرز العالمية. خلال العقود القليلة الماضية ، ساهمت مناهج التربية التقليدية بما في ذلك التكاثر بالطفرات والتربية الجزيئية بشكل كبير في تطوير استراتيجيات فعالة لمقاومة الأمراض في الأرز كما هو مطلوب لتعزيز الأمن الغذائي العالمي. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب تستغرق وقتًا طويلاً وتتطلب عمالة مكثفة. تقنيات نقل الجينات عن طريق أجروباكتريومأدى التحول القائم على التحول والنهج الأخرى إلى تحسن كبير في الغلة والجودة ومقاومة الأمراض في النباتات. ومع ذلك ، فإن لوائح السلامة الأحيائية ، والقضايا الاجتماعية والأخلاقية المتعلقة بالمحاصيل المحورة جينيا كانت دائمًا عائقًا رئيسيًا أمام قبول الجمهور لهذه المحاصيل المعدلة وراثيًا (Lusser et al ، 2012). بعد ذلك ، فإن الاستراتيجيات الأفضل لأصناف الأرز عالية الغلة والمقاومة للإجهاد هي الحاجة إلى الساعة لزيادة إنتاجية الأرز وضمان الأمن الغذائي العالمي.

أمراض النبات هي المعوقات الرئيسية التي تهدد التنمية الزراعية والأمن الغذائي العالمي. المحاصيل عرضة لمجموعة واسعة من مسببات الأمراض بما في ذلك البكتيريا والفيروسات والفطريات ، والتي تسبب خسائر اقتصادية كبيرة (منظمة الأغذية والزراعة ، 2017). تؤثر العوامل الممرضة على نمو المحاصيل وتطورها ، مما يؤدي إلى خسارة كبيرة في الغلة وبالتالي خلق عقبات أمام الزراعة المستدامة. استراتيجيات إدارة الأمراض المتعددة وأدوات تقييم المخاطر ، بما في ذلك استخدام بروتوكولات التنبؤ بالأمراض ، والاستخدام التجميعي للمواد الكيميائية ومبيدات الفطريات وعوامل المكافحة البيولوجية ، وتناوب المحاصيل وتربية العائل المقاومة كانت قيد الممارسة لفترة طويلة جدًا (Ul Haq and Ijaz ، 2020) . ومع ذلك ، فإن معظم هذه الاستراتيجيات غير كافية لتحقيق النجاحات في العديد من النظم المرضية بسبب التنوع في مجموعة المضيف من مسببات الأمراض النباتية ، والسمية البيئية ، والتباين في تقييم رد فعل مقاومة الأمراض وأنظمة التنبؤ بالأمراض غير الفعالة. لذلك ، فإن فهم الآلية الجزيئية التي تحكم التفاعل بين المضيف ومسببات الأمراض أمر أساسي لتطوير استراتيجية فعالة لمقاومة المرض.

تستخدم النباتات استجابات مقاومة متعددة لمنع استعمار الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض. من ناحية ، عادة ما يتم تنظيم مقاومة النبات لمسببات الأمراض النباتية من خلال المقاومة (ص) الجينات التي تشفر بروتينات متكررة غنية بالنيوكليوتيدات (NB-LRRs) ، والتي تحيد النشاط الجزيئي لبروتينات المستجيب الممرض في الخلية النباتية (Cui et al ، 2015). من ناحية أخرى ، فإن الطفرة المستهدفة أو الضربة القاضية للإصابة (س) الجين (الجينات) الذي يعمل كعامل توافق مع المضيف الممرض يحفز أيضًا المناعة المتنحية ضد مسببات الأمراض النباتية المكيفة (van Schie and Takken ، 2014). نظرًا لأن غالبية أمراض النبات تنشأ بسبب التفاعل المتوافق بين المضيف والممرض ، مما يؤدي إلى تغيير س- الجينات التي تعزز التوافق يمكن أن تكون مهمة للغاية في تطوير استراتيجيات واسعة النطاق ودائمة للتربية الجزيئية لمقاومة الأمراض (van Schie and Takken ، 2014).

في الآونة الأخيرة ، أدى ظهور العديد من تقنيات التربية الجديدة ، بما في ذلك منصات التكاثر السريع ، والتنميط الجيني عالي الإنتاجية ، والتحرير الدقيق للجينوم المقترن بالهندسة الوراثية ، إلى إنتاج أنواع متعددة من المحاصيل عالية الإنتاجية خالية من الأمراض (Li et al ، 2020). من بينها ، ظهرت مناهج تحرير الجينوم كأدوات ثورية لتحسين المحاصيل (Voytas and Gao ، 2014). يتم تمثيل أدوات تحرير الجينوم بواسطة نوكليازات محددة التسلسل (SSNs) التي تقدم كسرًا مزدوجًا للحمض النووي الذي تقطعت به السبل في منطقة جينومية معينة وبالتالي تحفيز مسارات إصلاح الحمض النووي للمضيف إما عن طريق إعادة التركيب المتماثل (HR) أو من خلال الانضمام غير المتماثل (NHEJ) ( ساندر وجونج ، 2014). في حين أن NHEJ هي طريقة عرضة للخطأ تخلق طفرات عشوائية تؤدي إلى تحول الإطار وضرب الجين المستهدف ، فإن مسار الموارد البشرية يكون أكثر دقة مما يؤدي إلى استبدال الجينات أو الضربة الجينية عند توفر قوالب الحمض النووي للمانحين (بالتيس وآخرون ، 2015). ومع ذلك ، تؤدي هذه العمليات الطبيعية لإصلاح الحمض النووي إلى حدوث طفرة تؤدي إلى تغيير سمة معينة. أدوات تحرير الجينوم المتعددة بما في ذلك نوكلياز إصبع الزنك (ZFNs) ، نوكليازات المستجيب الشبيه بالمنشط النسخي (TALENs) والمُطَوَّرة مؤخرًا التكرارات القصيرة المتناظرة القصيرة (CRISPR) المرتبطة بـ Cas9 (CRISPR / Cas9) التي سهلت إدخال العناصر المهمة من الناحية الزراعية الصفات في العديد من الأنواع النباتية (Zaidi et al ، 2018). من بين هذه المنصات ، يتمتع نظام CRISPR / Cas9 بقبول أكبر من قبل المجتمع العلمي لبساطته وخصوصية عالية للانقسام المستهدف والمشاركة في كيمياء البروتين غير المعقدة والتطبيق العالمي (Zaidi et al ، 2018). ما هو أكثر من ذلك ، أنه تم بالفعل الإبلاغ عن مقاومة مرض CRISPR / Cas بوساطة العديد من مسببات الأمراض النباتية بما في ذلك البكتيريا (Peng et al ، 2017) والفطريات (Wang et al ، 2016) والفيروسات (Chandrasekaran et al ، 2016 Zaidi et al ، 2016) في محاصيل مختلفة بما في ذلك الأرز (Sun et al ، 2017 Li SY et al ، 2018 Tomlinson et al ، 2019 He et al ، 2020) إما عن طريق التعديل المحدد المستهدف لجينات المضيف أو عن طريق التغيير الدقيق لجينومات الممرض. في هذه المراجعة ، قمنا بتلخيص الاستراتيجيات المختلفة المرتبطة بتحرير الجينوم وتطبيقاتها اللاحقة في تحسين المحاصيل مع التركيز على تسليط الضوء على التطورات في نظام CRISPR / Cas9 ودوره في منح مقاومة للأمراض في الأرز.

تحرير الجينوم هو نهج جديد حيث يتم استخدام SSNs لإجراء تعديلات دقيقة في الحمض النووي الجيني. يؤدي إنشاء فاصل مزدوج تقطعت به السبل (DSB) إلى تنشيط آلية إصلاح الحمض النووي للخلية ، إما من خلال طريقة NHEJ أو HR. يدمج NHEJ طفرات الإدراج والحذف (InDel) بينما ينتج عن طريقة الموارد البشرية إدخال الجينات أو استبدالها بشكل أكثر دقة. نوكليازات ضخمة مثل I-Sceشكّل إنزيم نوكلياز أنا من الخميرة أقدم نظام معروف لتحرير الجينوم (Paques and Duchateau ، 2007). ومع ذلك ، فهذه هي الأقل كفاءة بين أدوات التحرير بسبب الاتصال غير الواضح بين بقايا بروتين نوكلياز الضخمة وتسلسل الحمض النووي المستهدف المحدد المقابل (Hsu et al ، 2014). ZFNs هي SSNs التي تربط الحمض النووي من خلال مجموعة هندسية من أشكال أصابع الزنك (Carroll ، 2011). يستلزم إصبع الزنك المحدد حوالي 30 من الأحماض الأمينية في تكوين محفوظ & # x003b2 & # x003b2 & # x003b1. مجال الانقسام غير المحدد فوكأنا قاتمة بطبيعتها وعلى هذا النحو تم تصميم زوج من ZFNs لجلب فوكأنا مونومرات قريبة من هدف الحمض النووي المحدد لإنشاء DSB (Bogdanove and Voytas ، 2011) (الشكل 1-أ). تم استخدام ZFNs بنجاح كأداة لتحرير الجينوم في مجموعة واسعة من المحاصيل والنباتات النموذجية بما في ذلك أرابيدوبسيسوالتبغ والذرة (Cai et al، 2009 Shukla et al، 2009 Osakabe et al، 2010). ومع ذلك ، فإن استخدامها كأداة تحرير محدود للغاية بسبب العديد من القيود بما في ذلك الارتباط غير المستهدف لأشكال أصابع الزنك والتفاعلات متعددة الأوجه بين بقايا الأحماض الأمينية والتسلسل المستهدف (Carrol ، 2011 Voytas ، 2013).

على عكس ZFNs ، تم تصميم TALEN من خلال الجمع بين أ فوكأنا مجال نوكلياز مع مجال ربط DNA (TALE) منشط النسخ (الشكل 1-أ). TALEs هي بروتينات إفرازية من زانثوموناسالبكتيريا التي تتميز بوجود مجال التنشيط الحمضي الطرفي C وتسلسل إشارة التوطين النووي ومجال ربط الحمض النووي المركزي (DBD) وتسلسل إشارة الانتقال الطرفي N (Bogdanove et al ، 2010). TALEs هي المسؤولة في المقام الأول عن التنشيط النسخي لجينات القابلية للمرض في النباتات المضيفة. تم ترسيخ تالين في العديد من الأنواع النباتية ، بما في ذلك الأرز والقمح والتبغ والشعير (Wang et al، 2014 Li T et al، 2016 Blanvillain-Baufume et al، 2017). على الرغم من أن TALENs أكثر فاعلية من الناحية النوعية على ZFNs من حيث خصوصية الهدف العالية والنشاط المنخفض خارج الهدف ، يتم تمثيل TALE DBDs بهيكل تكرار شامل يعمل كقيد لاستخدامها الشامل في تحرير الجينومات المتعددة. على النقيض من ذلك ، فإن نظام CRISPR / Cas9 من النوع الثاني هو طريقة تحرير الجينوم الأكثر ابتكارًا والتي حلت محل ZFNs و TALENs نظرًا لكفاءتها وقوتها. تستخدم تقنية CRISPR / Cas9 نوكليازًا داخليًا للحمض النووي Cas9 جنبًا إلى جنب مع جزيء صغير من الحمض النووي الريبي (RNA) يسمى الدليل الفردي RNA (sgRNA) الذي ينظم DSB الخاص بموقع Cas9 في أهداف محددة (الشكل 1-أ). يعتمد ارتباط بنية Cas9-sgRNA بالحمض النووي المستهدف والانشقاق الناتج عن ذلك على وجود تسلسل عزر مجاور (PAM) (5 & # x02032 -NGG-3 & # x02032) عند نهاية الهدف 3 & # x02032 موقع. ومن ثم ، فإن متطلبات تسلسلات المباعدة المختلفة فقط تجعل CRISPR / Cas9 أداة تحرير بسيطة للغاية وفعالة للغاية تم استغلالها بشكل كبير في السنوات الأخيرة لتحسين النباتات النموذجية والمحاصيل الرئيسية (Ma et al، 2015 Xu et al، 2016 Zhang Y وآخرون ، 2020).

في حين أن تحسين السمات كان مثمرًا للغاية باستخدام CRISPR / Cas9 ، فإن الشرط الأساسي لتسلسل NGG PAM قد قيد استخدامه على المواقع المستهدفة المحتملة. في الآونة الأخيرة ، عملت العديد من المتغيرات Cas9 والبروتينات المتماثلة ، مثل Cas9-VRER و Cas9-VQR و Cas9-EQR و Cpf1-RVR و Cpf1-RR و SaCas9 ، على تحسين جدوى هندسة مجموعة واسعة من Cas9s مع خصائص PAM المحسنة للجينوم التحرير في الخلايا حقيقية النواة (Kleinstiver et al ، 2015 Gao et al ، 2017). استخدم Hu et al (2018) عملية التطور المستمر بمساعدة العاثيات لتطوير متغير SpCas9 ، يسمى xCas9 ، والذي يحتوي على نطاق أوسع من توافق PAM بما في ذلك NG و GAA و GAT ، وفي نفس الوقت خصوصية أكبر للحمض النووي وانخفاض على نطاق الجينوم نشاط خارج الهدف مقارنة بـ SpCas9. في الآونة الأخيرة ، تم تصميم محررات جديدة لقاعدة السيتوزين والأدينينالمكورات العنقودية الذهبية Cas9 (SaCas9-NG) ، متغيرات SpCas9-NG ، وسعت بشكل كبير المواقع المستهدفة في جينوم الأرز (Hua et al ، 2019). بالإضافة إلى ذلك ، قامت متغيرات SpCas9-NG بتوسيع نطاق تحرير الجينوم في البطاطس والطماطم بشكل كبير من خلال استهداف NGA و NGT PAMs غير الكنسية (Veillet et al ، 2020). مجتمعة ، سيكون الاستخدام الفعال لهذه المتغيرات Cas9 أمرًا بالغ الأهمية لتسريع تحسين الأرز من خلال تعزيز المقاومة لمسببات الأمراض النباتية المتعددة.

أدى ظهور نوكلياز داخلي آخر مرتبط بكريسبر من الفئة الثانية ، أو CRISPR / Cas12a أو Cpf1 ، إلى توسيع أفق تحرير الجينوم بدقة وكفاءة أكبر (Endo et al ، 2016) (الشكل 1-أ).بالمقارنة مع نظام CRISPR / Cas9 ، يتعرف CRISPR / Cas12a على T-rich (5 & # x02032 -TTTN-3 & # x02032 and 5 & # x02032 -TTN-3 & # x02032) PAMs في 5 & # x02032-نهاية الموقع المستهدف ، مما ينتج عنه بكفاءة عالية في الانقسام (Zetsche et al ، 2015). على عكس CRISPR / Cas9 الذي يتطلب 100 nt sgRNA ، لا يتطلب مجمع CRISPR / Cas12a & # x02019 t tracrRNA وبالتالي يمكنه تسهيل تحرير الجينات باستخدام crRNA فقط من 40-45 nt يتكون من التكرار والفاصل. وتشق مجالات RuvC و nuclease في Cas12a الهدف والشريط الثانوي للحمض النووي عند 23 و 17 نقطة أساس في اتجاه مجرى تسلسل PAM ، على التوالي ، مما يؤدي إلى نهايات متداخلة مع 5 نقاط أساس متراكمة (Zetsche et al ، 2015). في حد ذاته ، يؤدي تطوير طفرات أكبر باستخدام CRISPR / Cas12a إلى زيادة كفاءة إدخال الجينات المانحة بوساطة الموارد البشرية في الموقع الجيني المحدد. علاوة على ذلك ، يعمل Cas12a في وقت واحد باعتباره RNase لتحويل pre-crRNA إلى crRNA و nuclease لشق dsDNA ، مما يدل على النشاط الأنزيمي المزدوج (Zetsche et al ، 2015). لذلك ، لدى CRISPR / Cas12a القدرة على توليد عدة crRNA مدفوعة بمروج واحد ، مما يجعلها أبسط من نظام CRISPR / Cas9. علاوة على ذلك ، فإن الانقسام غير المستهدف بواسطة Cas12a أقل نسبيًا من Cas9. هذه الميزات تجعل CRISPR / Cas12a أكثر تقدمًا عن Cas9 ، مما يجعلها أداة مهمة لتحرير الجينوم في المستقبل (Zaidi et al ، 2017). Cas12a من فرانسيسيلا نوفيسيدا(FnCas12a) وتقويمها من بكتيريا Lachnospiraceae (LbCas12a) و Acedomonococcus ص. تم استخدام BV3L6 (AsCas12a) لإدخال طفرات مستهدفة في العديد من المحاصيل (Endo et al ، 2016). أظهرت التقارير الناشئة بالفعل التكيف الناجح لنظام CRISPR / Cas12a في تحسين الأرز (Yin et al ، 2017 Li S Y et al ، 2018). استخدم Yin et al (2017) CRISPR- LbCpf1 لاستهداف الجين النمائي المبكر EPFL9 (عامل تنميط البشرة مثل 9) ، وهو منظم إيجابي لتطور الثغور في الأرز. تُظهر النباتات المتحولة متماثلة اللواقح انخفاضًا بمقدار 8 أضعاف في كثافة الفم على سطح الورقة المحورية. وبالمثل ، أفاد Li S Y et al (2018) أن نموذج إصلاح المتبرع بالذراع المتماثل الأيسر فقط جيد بما يكفي لاستبدال الأليلات المستهدف بدقة في النوع البري OsALS (سينسيز أسيتولاكتات) الجين الذي ينتج عنه نباتات أرز مقاومة لمبيدات الأعشاب. في الآونة الأخيرة ، تم إجراء تقييم مقارن لثلاثة Cas9 (Cas9 D10A nickase و HiFi Cas9 nuclease و WT Cas9 nuclease) واثنين من نوكلياز Cas12a (LbCas12a و AsCas12a) لتحديد كفاءة الطفرات على موقع مستهدف واحد من الأرز فيتوين ديساتوراز(نظام التوزيع العام) الجين (Banakar et al ، 2020). أظهرت الدراسة أن LbCas12a يؤدي إلى حذف ما بين 2 إلى 20 نقطة أساس دون فقدان موقع PAM ، مما يؤدي إلى كفاءة تحرير أعلى على متغيرات Cas9 ، مما يشير إلى قدرة Cas12a على توليد طفرات مستهدفة محددة وقابلة للتوريث في الأرز وبالتالي يمكن استخدامها كأداة دقيقة لتحرير الجينوم لبرامج تحسين الأرز المستقبلية بما في ذلك تطوير أصناف الأرز المقاومة للأمراض.

على الرغم من أن استبدال الجينات القائم على الموارد البشرية هو نهج ممكن مع CRISPR / Cas9 و CRISPR / Cas12a ، فإن كفاءة تسليم نموذج الحمض النووي وإدخال الهدف منخفضة بشكل كبير. للتغلب على هذه المشكلة ، ظهرت تقنية المحرر الأساسي كنهج جديد ومتقدم لبدائل النيوكليوتيدات الدقيقة بطريقة قابلة للبرمجة دون الحاجة إلى DSB أو قالب المانح (الشكل 1-B) (Komor et al ، 2016). تتكون المحررون الأساسيون من مجال CRISPR / Cas9 غير نشط تحفيزيًا (dCas9 أو Cas9 nickase) ومجال نزع أمين السيتوزين أو الأدينوزين الذي يحول قاعدة إلى أخرى. هذه قادرة على عمل اختلافات أو بدائل أحادية القاعدة دون إنشاء DSB في DNA الهدف ، وبالتالي الحد من تكرار InDels. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام نظام التحرير الأساسي بكفاءة في إنشاء طفرات نقطية مستهدفة في مواقع داخلية متعددة في الأرز والقمح (Li C et al ، 2018). مؤخرًا ، rBE5 (hAID & # x0002A & # x02206 -XTEN-Cas9n-UGI-NLS) محرر قاعدة تم استخدامه للاستهداف Pi-d2، وهو جين أرز مهم زراعيًا يحتوي على طفرة نقطية تعدل الاستجابة الدفاعية لفطر عصف الأرز (Ren et al ، 2018). تم أيضًا استخدام محرري قاعدة السيتوزين والأدينين بكفاءة لإجراء تعديل دقيق للقاعدة (C إلى T أو A إلى G) في جينومات حقيقية النواة (Zong et al ، 2017 Hua et al ، 2018 Qin et al ، 2019). تم تحسين صناديق أدوات التحرير الأساسية بكفاءة وعرضها في العديد من المحاصيل بما في ذلك الأرز والقمح والذرة والطماطم (Lu and Zhu، 2017 Zong et al، 2017 Li C et al، 2018 Tang et al، 2019). مع مرور الوقت ، تم تطوير مجموعة واسعة من محرري قاعدة الأدينين (ABEs) ومحرري قاعدة السيتيدين (CBEs) لتعديل قاعدة محددة الهدف بشكل فعال (Mishra et al ، 2020). علاوة على ذلك ، تم تحقيق التحرير الدقيق للقاعدة في الحمض النووي الريبي باستخدام Cas13 غير نشط تحفيزيًا (dCas13) بالاشتراك مع أدينوسين ديميناز الذي يعمل على الحمض النووي الريبي (ADAR) لتوجيه الأدينوزين إلى تحويل الجينوزين (كوكس وآخرون ، 2017). Cas13 هو نوع RNA المرتبط بـ CRISPR من النوع الرابع الموجه RNase بينما تتوسط ADARs في التحرير الدقيق للنصوص (Nishikura ، 2010). تم استخدامهما معًا لتطوير نظام تحرير RNA يسمى RNA Editing من أجل استبدال قابل للبرمجة من A إلى I (REPAIR) له قابلية تطبيق كبيرة للبحث في العلاجات والتكنولوجيا الحيوية (Stafforst and Schneider ، 2012). ومع ذلك ، لم يتم استخدامه بعد في نظام المصنع.

يتضمن تحرير الجينوم التقليدي بما في ذلك نظام CRISPR / Cas9 تسليم أشرطة الحمض النووي التي تشفر آليات التحرير إلى جينوم المضيف. في كثير من الأحيان ، ينتج عن التكامل العشوائي لكاسيت التحرير تغييرات جينية غير مرغوب فيها وتأثيرات خارج الهدف (Zhang et al ، 2018). علاوة على ذلك ، فإن إدخال شريط التحرير في جينوم المضيف يثير مخاوف أخلاقية وتنظيمية (جونز ، 2015). لذلك ، يتزايد توافق العلماء مع استخدام تقنيات تحرير الجينوم الخالية من الحمض النووي لتقليل احتمالية حدوث طفرات خارج الهدف. يستفيد تحرير الجينوم الخالي من الحمض النووي من مجمعات CRISPR / Cas ribonucleoprotein (RNP) التي يتم توصيلها إلى الخلية عن طريق تحويل البروتوبلاست أو قصف الجسيمات مما يؤدي إلى تعديل الحمض النووي المستهدف. CRISPR-RNP عبارة عن مجموعة من بروتينات RNA و Cas9 الإرشادية الخاصة بـ CRISPR معًا لتشكيل مركب إنزيم نشط (Zhang et al ، 2018). تم الحصول على أول نباتات معدلة للجينوم خالية من الحمض النووي عن طريق نقل CRISPR / Cas RNPs إلى البروتوبلاست لـ أرابيدوبسيسوالتبغ والخس والأرز (Woo et al ، 2015). وبالمثل ، فقد تم إثبات نجاح عملية قصف الجسيمات بوساطة التحرير الخالي من الحمض النووي باستخدام CRISPR-Cas9 RNPs في الذرة (Svitashev et al ، 2016) والقمح (Liang et al ، 2017) والأرز (Toda et al ، 2019). في الأرز ، تم تسليم Cas9-gRNA RNPs مباشرة إلى الأنسجة الملقحة بكفاءة طفرة تتراوح من 14٪ إلى 64٪ (Toda et al ، 2019). في الذرة ، تم استخدام CRISPR / Cas9 RNPs لتوليد كل من الضربات القاضية وكذلك المسوخ (Svitashev et al ، 2016).

علاوة على ذلك ، تتمتع CRISPR / Cas-RNPs بكفاءة تحرير عالية نسبيًا وطفرات منخفضة خارج الهدف مقارنة بنظام CRISPR / Cas (Liang et al ، 2017 Toda et al ، 2019). في دراسة أخرى ، تم دمج التحرير الأساسي مع نظام التحرير الخالي من الحمض النووي لتسهيل معدل التحويل العالي من C إلى T (1.8 ٪) في القمح (Zong et al ، 2018). بشكل عام ، يتمتع نظام التحرير الدقيق الخالي من الجينات المحورة بإمكانيات هائلة لتحسين الأرز بالإضافة إلى أنواع المحاصيل المهمة الأخرى. على الرغم من أن استخدام CRISPR / Cas RNPs لا يزال في مهده ، إلا أنه يمكن استكشافه بشكل فعال لتسريع تكاثر محاصيل الأرز ويمكن أن تحصل المنتجات المعدلة على قبول أوسع في الجمهور للتغلب على العقبات التنظيمية للسلامة الأحيائية.

خلال النصف الأخير من القرن التاسع عشر وأوائل القرن العشرين ، لعبت تربية مقاومة العائل دورًا محوريًا في تحسين المحصول والسمات الزراعية الأخرى للأرز ، وبالتالي معالجة تحديات إطعام سكان العالم المتنامي. ومع ذلك ، فإن الطرق التقليدية للتكاثر بالمقاومة باهظة الثمن وتستغرق وقتًا طويلاً ، وفي بعض الأحيان يؤثر أليل المقاومة على نمو النبات وتطوره (Miah et al ، 2013). كشفت دراسات وراثية وجينومية واسعة النطاق عن تفاصيل جزيئية مهمة حول المناعة الفطرية للأرز ، بما في ذلك عدد كبير من الأهداف للسيطرة على العدوى المسببة للأمراض وتثبيطها. بينما طورت النباتات مقاومة (ص) الجينات التي يمكنها تحييد بروتينات الفوعة المشتقة من العوامل الممرضة أو المؤثرات وتنشيط المناعة المحفزة للمستجيب ، ولديهم أيضًا قابلية للتأثر (س) الجينات التي تشارك بشكل أساسي في العدوى الممرضة الناجحة. في سياق تحرير الجينوم ، تتضمن الإستراتيجية الأساسية لمقاومة الأمراض التخلص منها سالجينات من خلال الإصلاح القائم على مسار NHEJ المعرض للخطأ للحمض النووي المستهدف (الشكل 2-أ). بدلا من ذلك ، يطرق في ص أليل الجين إلى الموقع المستهدف من خلال آلية الموارد البشرية لديه القدرة على تطوير المقاومة في الأنماط الجينية الحساسة المقبولة على نطاق واسع (الشكل 2-B و -C). الى جانب ذلك ، أليلات معينة ص و ستختلف الجينات على مستوى النوكليوتيدات المفردة. وبالتالي ، فإن التحرير الدقيق عن طريق الاستبدال المستهدف أو التحرير الأساسي يمكن أن يولد متغيرات أليلية لمقاومة المرض (الشكل 2-B و -D). ثم مرة أخرى ، يمكن استخدام منصات التحرير للحث على مقاومة الأمراض عن طريق تغيير رابطة الدول المستقلة- مناطق تنظيم الجينات المستهدفة ومواقع السمات الكمية. تم تحقيق أكثر من مائة طفرة تنظيمية في الطماطم SlCLV3 مروج يستخدم نظام CRISPR / Cas9 (Rodriguez-Leal et al ، 2017). مثل هذه التعديلات يمكن أن تؤدي إلى تقييم منهجي ل رابطة الدول المستقلة- مناطق تنظيمية ذات سمات مقاومة ، والتي يمكن أن تعزز تكاثر الأرز (الشكل 2-د). التحرير المتزامن لعدة ملفات سيمكن أن تؤدي الجينات أو العناصر التنظيمية عبر منصة التحرير المتعدد (الشكل 2-E) بشكل أساسي إلى مقاومة واسعة النطاق للأمراض. يمكن مضاعفة sgRNAs المتعددة التي يقودها مروجون مستقلون في ناقل تعبير Cas9 أو Cpf1 / sgRNA واحد باستخدام استنساخ Golden Gate أو طريقة تجميع Gibson (Silva and Patron ، 2017). أظهر Wang et al (2017) جدوى تحرير الجينات المتعدد باستخدام نظام CRISPR / Cpf1. أدى ظهور منصات التحرير المتعددة إلى تسهيل واحدة أو أكثر من هذه الاستراتيجيات نحو تطوير المقاومة ضد الإجهاد الحيوي في المحاصيل خاصة في الأرز (Mishra et al ، 2018 Yin and Qiu ، 2019). تم استكشاف تطبيق أدوات كريسبر / كاس بشكل أساسي في الأرز ضد العدوى الفيروسية ، متبوعة بجهود لتحسين مقاومة الأمراض الفطرية والبكتيرية (الجدول 1). نناقش أدناه الدراسات الحديثة التي توضح قوة تقنية تحرير الجينوم في إنشاء مقاومة لفئات العوامل الممرضة هذه.

الجدول 1. قائمة الجينات المستهدفة بأدوات تحرير الجينوم لمقاومة أمراض الأرز.
منظور الممرضالجين المستهدفأداة التحريروظيفةالمرجعي
مقاومة العدوى البكتيريةOsSWEET13تالينمقاومة معززة لـ BLB لي وآخرون ، 2012
OsSWEET13تالينمقاومة معززة لـ BLB Zhou et al ، 2015
OsSWEET13تالينمقاومة معززة لـ BLB Blanvillain-Baufume et al، 2017
Os09g29100تالينمقاومة معززة لـ BLB Cai et al ، 2017
Os8N3(OsSWEET11)كريسبر / كاس 9مقاومة معززة لـ BLB كيم وآخرون ، 2019
OsSWEET11و OsSWEET14كريسبر / كاس 9مقاومة واسعة النطاق لـ BLB Xu وآخرون ، 2019
OsSWEET11, OsSWEET13وOsSWEET14كريسبر / كاس 9مقاومة واسعة النطاق لـ BLB أوليفيا وآخرون ، 2019
مقاومة العدوى الفطريةأوسيرف 922كريسبر / كاس 9تعزيز مقاومة مرض الانفجار وانج وآخرون ، 2016
OsSEC3Aكريسبر / كاس 9تعزيز مقاومة مرض الانفجار ما وآخرون ، 2018
OsPFT1كريسبر / كاس 9مقاومة لفحة غمد الأرز شاه وآخرون ، 2019
مقاومة العدوى الفيروسيةeIF4Gكريسبر / كاس 9مقاومة محسنة لأمراض التنغرو Macovei وآخرون ، 2018

TALENs ، نوكلياز مؤثر يشبه المنشط للنسخ ، CRISPR / Cas9 ، الكتلة المنتشرة بانتظام تكرار متناظر قصير / Cas9 BLB ، لفحة الأوراق البكتيرية.

لفحة الأوراق البكتيرية (BLB) ، التي تسببها & # x003b3 -بروتيوبكتيريوم Xanthomonas oryzaeالكهروضوئية. اوريزي (Xoo) ، أحد أكثر أمراض الأوعية الدموية تدميراً للأرز ، خاصة في مناطق زراعة الأرز الرئيسية في جنوب شرق آسيا وأفريقيا جنوب الصحراء. وهي مسؤولة بمفردها عن أكثر من 75٪ من خسارة الغلة مع تأثر ملايين الهكتارات من الأرز سنويًا (Varshney et al ، 2019). كان تحديد نباتات الأرز المقاومة وراثيا واستخدامها في التربية بمساعدة الجينوم أكثر الطرق فعالية لتطوير Xoo أصناف مقاومة. ومع ذلك ، فإن ظهور جديد وجديد Xoo كانت الأنواع هي التحدي الأكبر في السيطرة على المرض. ال Xoo يتم تحديد الإمراضية في الأرز بشكل أساسي من خلال حقن بروتينات مرتبطة بالحمض النووي تسمى TALEs والتي ترتبط بعناصر ربط المستجيب (EBEs) في محفزات س الجينات في الأرز (Cohn et al ، 2014). عادة ما تستهدف TALEs عائلة الجينات الحلوة التي تنقل السكر في الأرز والتي تكون مسؤولة بشكل أساسي عن إطلاق السكر في Apoplast كغذاء للـ Xoo مسببات الأمراض (Cohn et al ، 2014). تم العثور على حكايات متعددة بما في ذلك AvrXa7 و TalC و Tal5 و PthXo3 في ملفات مختلفة Xoo جميع السلالات تستهدف Os11N3 (المعروف أيضًا باسم OsSWEET14) في الأرز وبالتالي تم اعتبارها عوامل الحساسية الرئيسية المرتبطة بعدوى اللفحة البكتيرية (أنتوني وآخرون ، 2010 Li et al ، 2012 Hutin et al ، 2015). ينتج عن التحرير بوساطة TALEN تطوير الطفرات المرغوبة داخل Os11N3منطقة المروج التي تحتوي على EBE لـ AvrXa7 ، والتي تتداخل مع EBE آخر لـ PthXo3. نباتات الأرز المعدلة ذات الطفرة المتماثلة اللواقح المرغوبة لحذف 4 أو 9 نقاط أساس في الموقع المستهدف مقاومة للغاية للفحة البكتيرية (Li et al ، 2012). أبلغ Zhou et al (2015) أيضًا عن تحديد جين آخر لنقل السكروز OsSWEET13 كعامل حساسية للمرض لـ PthXo2 TALE (المستجيب المشابه لمنشط النسخ) المعتمد Xoo سلالة ، وحدد أيضًا أن السلالة المعتمدة على PthXo2 تحفز OsSWEET13 التعبير على وجه التحديد في إنديكا الأرز IR24 نظرًا لوجود موقع ربط مؤثر غامض غير موجود في أليلات جابونيكا الأرز Nipponbare و Kitaake. في دراسة أخرى ، حدث حذف 18 نقطة أساس بشكل طبيعي في يا بارثي و O. glaberrima من المتوقع أن تمنع أنواع الأرز البري ربط TALEs المعروف أنها تستهدف OsSWEET14ويمنح مقاومة لـ BLB (Hutin et al ، 2015). الأليل ، المسمىxa41(ر) مقاومة ضد نصف الاختبار Xoo سلالات. في الآونة الأخيرة ، استخدم Blanvillain-Baufume et al (2017) تركيبات TALEN لتطوير مكتبة أليل من OsSWEET14 منطقة المروج في الأرز لتقييم مستوى الحساسية لخطوط الأرز المعدلة التي تحمل طفرات في EBEs في AvrXa7 و Tal5 و TalC. وتؤدي خطوط الأرز مع تعطيل AvrXa7 و Tal5 EBEs إلى مقاومة Xooالتي تعتمد على حكايات المقابلة.

اضطراب CRISPR / Cas9 بوساطة لـ TALE EBEs لجينين قابلين للإصابة ، OsSWEET11 و OsSWEET14، في مجموعة متنوعة من الأرز ، تمت محاولة Kitaake لتسهيل مقاومة BLB واسعة النطاق في الأرز (Xu et al ، 2019). واحد من طافرة الأرز MS14K يوضح مقاومة واسعة النطاق لغالبية Xoo سلالات. علاوة على ذلك ، تم تحديد حكايتين شبيهتين بـ PthXo2 كعوامل ضراوة رئيسية في التوافق Xooسلالات. نظرًا لأن حكايات PthXo2 تستهدف بشكل أساسي جين القابلية للإصابة OsSWEET13 / Xa25، وهو تحليل لمتغيرات EBE في OsSWEET13 المروج عبر 3000 نوع من الأرز عن وجود 10 أصناف على الأقل Xa25-مثل أنماط الفرد. تم استخدام استراتيجية CRISPR / Cas9 أيضًا لتقديم InDels في EBE الخاص بـ OsSWEET13 مروج MS14K خط ، وخط أرز جديد مع ثلاثة OsSWEET EBEs تم تعديله ، مما أدى إلى مقاومة واسعة النطاق ضد جميع الاختبارات التي تم اختبارها Xoo سلالات (Xu et al ، 2019). يشير هذا إلى أن هندسة الجينوم لمواقع عامل القابلية للتطور المشترك TALE أمر بالغ الأهمية لمنع حساسية المستجيب المستحث ، وبالتالي تحقيق مقاومة BLB واسعة الطيف.

في الآونة الأخيرة ، استخدم Kim et al (2019) نظام CRISPR / Cas9 لضرب الأرز بالضربة القاضية Os8N3 (المعروف أيضًا باسم OsSWEET11) التي تعمل كعامل حساسية لـ Xoo سلالات تحمل المستجيب TAL PthXo1. التعديلات المطلوبة في Os8N3بثبات إلى T.0، ت1، ت2 و ت3 أجيال بدون الحمض النووي المنقول (T-DNA) من خلال الفصل الجيني. لم يقتصر الأمر على إظهار الطفرات المتماثلة اللواقح مقاومة معززة بشكل ملحوظ لـ Xoo سلالة ، وتحرير Os8N3 كما لم يؤثر على الصفات الزراعية وحيوية حبوب اللقاح في الخطوط الطافرة. أوليفيا وآخرون (2019) تسلسل 856 حكاية عبر متعددة Xoo من آسيا وأفريقيا تستهدف بشكل مميز مروجي جينات OsSWEET المتعددة (سويت 11, سويت 13 و سويت 14) ووجدت التعقيد الذي ينطوي عليه تطوير خطوط الأرز غير الحساسة لـ TALE. للتغلب على هذه الصعوبة ، يتم استخدام نظام تحرير الجينوم بوساطة CRISPR / Cas9 لإدخال طفرات في مروجي جميع جينات SWEET الثلاثة في EBEs المعترف بها من قبل مختلفXoo حكايات. تكشف تحليلات التسلسل عن متغيرات TALE المتعددة لـ سويت 13 و سويت 14 الأليلات. أدى إدخال ما يصل إلى خمس طفرات محفز SWEET في مدخلات الأرز Kitaake و IR64 و Ciherang-Sub1 إلى مقاومة BLB قوية وواسعة النطاق. في الآونة الأخيرة ، قام Zhang Q W وآخرون (2020) بتسهيل تحسن كبير في استجابة الأرز لمسببات الأمراض BLB من خلال استخدام صندوق أدوات اندماج CAS T5 (T5exo). مقارنةً بـ CRISPR / Cas9 ، ينتج عن T5exo-Cas9 أو -Cas12a طفرات حذف أكبر في الموقع المستهدف لـ UPTPthXo1(تم تنظيمه بواسطة مستجيب يشبه المنشط PthXo1) من مربع OsXa13 المروج الجيني في نباتات الأرز المحررة. كشف تحليل النمط الظاهري أن نباتات الأرز التي تم تحريرها بواسطة T5exo-Cas9 أو -Cas12a لديها انخفاض كبير في طول الآفة وتعزيز مقاومة BLB مقارنة بتلك التي تم تحريرها بواسطة CRISPR / Cas9 أو CRISPR / Cas12a ، والتي قد تكون مرتبطة بعامل T5exo -Cas9 يستحث عمليات حذف أكبر في رابطة الدول المستقلة- العنصر التنظيمي (Zhang Q W et al ، 2020).تشير كل هذه الدراسات بوضوح إلى أن تحرير الجينوم للأرز خاصة مع نظام CRISPR / Cas قد ساهم بشكل كبير في منح مقاومة BLB واسعة النطاق ، ويمكن استخدام هذه الاستراتيجيات بفعالية في برامج تحسين المحاصيل بمساعدة الجينوم غير المعدلة وراثيًا.

أكثر من 30٪ من أمراض النبات ناتجة عن مسببات الأمراض الفطرية (Giraud et al ، 2010 Sharma et al ، 2012). انفجار الأرز الناجم عن الفطريات الخيطية نصفي التغذية Magnaporthe oryzaeهو أكثر أمراض الأرز انتشارًا وتدميرًا. إنها صعوبة متكررة لكل من أرز المرتفعات والمنخفضة المعرضة بشدة لهذا الممرض النباتي الفطري من الشتلات إلى مرحلة البلوغ. أدى التكرار المتكرر لأجناس جديدة من مسببات الانفجار إلى أكثر من 30٪ من الخسائر في إنتاج الأرز العالمي ، وهو ما يكفي لإطعام 60 مليون شخص (Nalley et al ، 2016). يعتبر استخدام الأصناف المقاومة للانفجار الإجراء الأكثر فعالية لإدارة مسببات الانفجار. حتى الآن ، أكثر من 100 انفجار كبير ر تم تحديد الجينات وتم استنساخ 30 منها جزيئيًا (Xiao et al ، 2019). انفجار كبير ربما في ذلك الجينات بي تا/Pi-ta2, Pi-z, بي ب و Pi-k/ح/م/ستم نشرها جنبًا إلى جنب مع برامج التربية بمساعدة الجينوم والبرامج المعدلة وراثيًا لتطوير الأنماط الجينية المقاومة عبر مناطق إنتاج الأرز (Li Y et al ، 2016). على سبيل المثال ، الأرز الذي تم تحديده مؤخرًا الخنزير يتكون الموضع من مجموعة من الجينات التي تشفر مستقبلات التكرار الغنية بالنيوكليوتيدات (NBS-LRR) التي تمنح مقاومة لفطر الانفجار M. oryzae دون المساومة على سمة الغلة. يتميز الموضع بزوج من الزوج المضاد المنظم وراثيًا من مستقبلات NBS-LRR ، PigmR و PigmS. في حين PigmR يسهل مقاومة الطيف الواسع ، PigmS يمنع PigmR التحوير المثلي لقمع المقاومة وبالتالي زيادة إنتاج البذور (Deng et al ، 2017). وبالمثل ، فإن تعديل قاعدة واحدة في المنطقة التنظيمية BSR-D1 يحث على مقاومة الانفجار في الأرز (Li et al ، 2017). ومع ذلك ، فإن التحدي الحالي يكمن في تطوير مجموعة من الجينات المقاومة للانفجار التي يمكن استخدامها ضد السلالات المتغيرة والمتنوعة باستمرار من M. oryzae. لذلك ، فإن أدوات تحرير الجينوم الدقيقة هي الحاجة إلى ساعة لتنفيذ مقاومة النبات الفعالة في الأرز.

تم إثبات مقاومة محسنة لمرض الانفجار في الأرز من خلال استهداف جين عامل نسخ استجابة الإيثيلين أوسيرف 922 عبر الضربة القاضية المستهدفة CRISPR / Cas9 (Wang et al ، 2016). تم الإبلاغ عن طفرات InDel المستحثة بواسطة CRISPR / Cas9 في الجين المستهدف بتردد طفرة يصل إلى 42٪ في T0 توليد. تنتقل الطفرات الأليلية بشكل ثابت إلى الأجيال التالية. فحص مقاومة الانفجار في ستة T.2تكشف السلالات عن آفات أقل بكثير مقارنة بالنباتات البرية في كل من مرحلتي الشتلات والحراثة. علاوة على ذلك ، لم يلاحظ أي اختلاف كبير في الأداء الزراعي للطفرات ، مما يشير إلى أن التحرير الدقيق لا يغير الصفات المهمة الأخرى للنباتات. علاوة على ذلك ، فإن استخدام عدة بنيات CRISPR / Cas9 (Cas9 / multi-target-sgRNA) لاستهداف عدة مواقع داخل أوسيرف 922 ينتج عن الموضع عدد أكبر من المسوخ. تشير هذه النتائج إلى أن الاستهداف بوساطة CRISPR / Cas9 لمواقع متعددة لديه القدرة على زيادة كفاءة الطفرات ، وبالتالي تعزيز مقاومة الانفجار في الأرز. تم استخدام CRISPR / Cas9 SSN للتعطيل OsSEC3A، وهو جين يقوم بترميز بروتين الوحدة الخارجية لاستكشاف دوره الوظيفي في مناعة النبات (Ma et al ، 2018). OsSEC3A سبق أن تورط في استطالة شعر الجذور وإنبات حبوب اللقاح والاستجابة الدفاعية في الأنواع النباتية الأخرى (Bloch et al ، 2016). تم تصميم اثنين من sgRNAs لاستهداف exons الثالث والعاشر من OsSEC3A الجين. تعرض متحولة CRISPR / Cas9 استجابات مناعية محسنة مقترنة بالتعبير المنظم للبروتينات المرتبطة بالإمراض ، وجينات تخليق حمض الساليسيليك ، ومستويات متزايدة من حمض الساليسيليك ، ومقاومة محسنة لمسببات مرض انفجار الأرز M. oryzae. ومع ذلك ، تُظهر الخطوط الطافرة أيضًا نموًا متغيرًا وسمات زراعية بما في ذلك قامة القزم ، والشتلات الأصغر ، والجذور الرئيسية الأقصر ، وانخفاض أو ضعف ارتفاع النبات ، وطول الدالية ، وعدد الحراثة ، ووزن 1000 حبة ، وخصوبة السنيبلات مقارنة بالنوع البري. يمكن تحقيق نتائج متعددة لمقاومة الانفجار في الأرز من خلال التحرير الدقيق للجين (الجينات) متعددة الوظائف المرتبطة بإشارات الدفاع في الأرز. في الآونة الأخيرة ، تم اعتماد CRISPR / Cas9 أيضًا للحث على حدوث طفرات في الشكل الغني بالبرولين Pi21 لمقاومة الأرز ضد M. oryzae (لي وآخرون ، 2019). تم تصميم ناقل CRISPR / Cas9 لتسهيل الطفرة المستهدفة المتزامنة للذكور العقيم الحساس للحرارة 5 (TMS5) ، انفجار الأرز س الجين بي 21 و BLB س الجين xa13 في صنف الأرز Pinzhan (Li et al ، 2019). ثلاثة من المسوخات المتولدة مع طفرات متماثلة اللواقح في جميع الجينات الثلاثة (tms5 / pi21 / xa13) عرض خصائص عقم الذكور الجيني الحساس للحرارة مع تعزيز المقاومة للعدوى م. جريسي و Xoo سلالة PXO99 (Li et al ، 2019) ، وبالتالي تسريع عملية تربية الأرز الهجين بشكل كبير.

لفحة غمد الأرز الناجمة عن ريزوكتونيا سولانيكوهن [مرحلة Teleomorph ، ثاناتيفورس كوكومريس(فرانك) دونك] ، هو ثاني أهم مرض فطري يصيب الأرز بعد الانفجار ، حيث تبلغ كميات فقدان الغلة في حدود 8٪ -50٪ عبر بلدان زراعة الأرز الاستوائية في العالم (سافاري وآخرون ، 2000). تمت محاولة تعديل CRISPR / Cas9 مؤخرًا Oryza sativa Phytochrome و Flowering Time 1 (OsPFT1) الجين لفهم دوره الوظيفي في مقاومة آفة غمد الأرز (Shah et al ، 2019). أرابيدوبسيس PFT1 متورط بشكل حاسم في إحداث القابلية للإصابة بالأمراض من خلال العمل كمحول عالمي بين RNA polymerase II وعوامل النسخ المرتبطة بالحمض النووي (B & # x000e4 ckstr & # x000f6 m et al ، 2007 لا يمكن العثور عليها في REFERNCE ، يرجى التحقق. المرجع الثاني في قائمة المرجع تاتشر وآخرون ، 2009). تم حشد بنيات CRISPR / Cas9 في إنديكا متنوعة الأرز عبر ASD16 الأجرعية- التحول بوساطة التي سهلت حدوث طفرة في PFT1 المكان. ومع ذلك ، فإن كفاءة الطفرة وتقارب مقاومة الأمراض لخطوط الأرز المعدلة لم يتم التأكد منها بعد.

تعمل الأمراض الفيروسية أيضًا كعائق عالمي رئيسي في الجهود المبذولة لزيادة إنتاجية الأرز. من بين الإصابات الفيروسية المختلفة ، يؤثر مرض تنجرو الأرز بشدة على إنتاج الأرز في حوالي 3.5 مليون هكتار في جميع أنحاء الدول الآسيوية المنتجة للأرز (Chancellor et al ، 2006). ينتج هذا المرض أساسًا عن تفاعل فيروسين مختلفين هما فيروس الأرز التونغرو الكروي (RTSV) مع جينوم الحمض النووي الريبي (RNA) الذي تقطعت به السبل ، وفيروس الأرز التونغرو العصوي (RTBV) ، مع جينوم الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل (هال ، 1996). يطور RTBV أعراض المرض الأولية ، وينشر المرض عن طريق المساعدة في انتقال RTBV من خلال أنواع قادوس الأوراق الخضراء مثل Nefhotettix virescensو nigropictus (هيبينو وكابواتان ، 1987). أدت برامج التربية المقاومة للمضيفة من خلال فحص مجموعات ضخمة من الأصول الوراثية للأرز إلى تحديد أصناف أرز متعددة ذات مقاومة محددة لأي من الفيروسين أو كليهما (Khush et al ، 2004). مركز البحوث الجزيئية في إنديكا أظهر أصناف الأرز Utri Merah أن مقاومة RTSV يتم التحكم فيها من خلال وجود تعدد الأشكال أحادي النوكليوتيدات أو الحذف الذي يؤثر على بقايا الأحماض الأمينية YVV في عامل بدء الترجمة أربعة جاما (eIF4G) الجين (Lee et al ، 2010). على هذا النحو ، من الضروري تطوير مجموعة مقاومة RTSV لمنع الانتشار الثانوي لهذا المرض. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام تحرير الجينوم CRISPR / Cas9 بنجاح للتحول eIF4G الجين في مجموعة أرز RTSV الحساسة ، IR64 ، لتطوير مصادر جديدة لمقاومة RTSV (Macovei et al ، 2018). يتم تحقيق تردد طفرة تتراوح من 36٪ إلى 86٪ ، ويتم نقل الطفرات المستحثة إلى الجيل اللاحق بدون تعديلات يمكن اكتشافها في أقرب المواقع خارج الهدف. كشف تحليل التسلسل ومقايسة عدوى الممرض أن الطفرة داخل الإطار في بقايا الأحماض الأمينية المجاورة لبقايا YVV تمنح مقاومة RTSV المحسنة جنبًا إلى جنب مع المعلمات الزراعية المحسنة مثل ارتفاع النبات ومحصول الحبوب. يمكن إطلاق المسوخات المستقرة في المناطق المعرضة لمرض تونغرو الأرز كمصدر بديل لمقاومة RTSV للسيطرة على العدوى وتحسين إنتاجية الأرز.

على الرغم من أن أساليب تحرير الجينوم تعتمد على الطفرة المستهدفة لـ س الجينات نحو إدخال مقاومة الأمراض في النباتات ، فقد يكون ذلك مصحوبًا بتكلفة اللياقة. الضربة القاضية س قد تؤدي الجينات ، التي تشفر البروتينات المسؤولة عن هياكل ما قبل الاختراق ، وآليات قمع الدفاع والتكرار ، إلى تشوهات النمط الظاهري ونقص التغذية التي يمكن أن تؤثر على نمو النبات وتطوره (van Schie and Takken ، 2014). في حين أن طفرات أرز OsSWEET تحفز المقاومة من خلال توافر السكر المحدود لمسببات الأمراض BLB ، فقد يؤدي أيضًا إلى انخفاض مكانة النبات وإجهاض حبوب اللقاح (Chu et al ، 2006). يمكن التخفيف من ذلك من خلال التحرير المستهدف لمناطق المروج المختلفة لـ س تم إثبات الجينات لجينات SWEET في الأرز (Blanvillain-Baufume et al ، 2017). بدلاً من ذلك ، بدلاً من إخراج ملف سالجين ، يمكن أيضًا تطوير مقاومة الأمراض من خلال إدخال متغيرات تركيبية لـ س الجين المطابق للأليل الذي يحدث بشكل طبيعي في الأنماط الجينية المقاومة (Bastet et al ، 2017). يمكن لمثل هذا الأليل الجديد أن يحفز مقاومة النبات وفي نفس الوقت يُظهر وظائف البروتين الطبيعية دون تكلفة تنموية. إلى جانب ذلك ، يمكن أيضًا استخدام أدوات التحرير الأساسية المطورة حديثًا لإدخال دقيق لتحولات القاعدة الفردية في بعضها س الجينات ، والتي تختلف فقط على مستوى تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة. علاوة على ذلك ، يمكن استهداف توافر العديد من المحفزات المسببة للأمراض والعناصر التنظيمية في النباتات باستخدام نظام CRISPR الناجم عن مسببات الأمراض لإيقاف تشغيل س الجين مع عدم التنازل عن أدوار اللياقة البدنية الخاصة بهم. يمكن تصور نظام ناقل CRISPR الذي يمكنه استغلال المروج المحفز للممرض لإثبات فعاليته تجاه مقاومة الأمراض في المحاصيل الحقلية. على العكس من ذلك ، سيكون إدخال تسلسل تصميم مخصص في الجينوم أكثر ملاءمة عندما تشارك متغيرات أليلية محددة في استجابة المقاومة. يمكن لنظام CRISPR مقترنًا بآلية الموارد البشرية أن يوسع إلى أجل غير مسمى إمكانية الدخول ر أليل الجين في الموقع المستهدف المختار لتطوير مقاومة المرض. على الرغم من أن الموارد البشرية لا تزال تمثل تحديًا تقنيًا في النباتات بسبب انخفاض الكفاءة ونقص بروتوكولات تعدد الإرسال ، إلا أنه يلزم تصميم صناديق أدوات كريسبر وتحليلها لتوسيع تطبيقاتها في تربية المقاومة لتحسين الأرز.

تم دعم هذا البحث من قبل برنامج الأولوية الصينية - تربية سبع محاصيل رئيسية (المنحة رقم 2017YFD01100100) ، وبرنامج الابتكار التابع للأكاديمية الصينية للعلوم الزراعية (المنحة رقم 01-ICS) وبرنامج العلماء الشباب الموهوبين في الصين (المنحة رقم الهند - 17-01). نشكر الدكتور موكتيكانتا ميشرا ، رئيس جامعة سنتوريون للتكنولوجيا والإدارة على تشجيعه ودعمه.


Aslanidis C، de Jong PJ (1990) الاستنساخ المستقل للربط لمنتجات PCR (LIC-PCR). الأحماض النووية الدقة 18 (20): 6069-6074

Aslanidis C، de Jong PJ، Schmitz G (1994) الحد الأدنى لمتطلبات الطول للذيول المفردة من أجل الاستنساخ المستقل للربط (LIC) لمنتجات PCR. طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل 4 (3): 172-177

Berger I ، Fitzgerald DJ ، Richmond TJ (2004) نظام تعبير Baculovirus للمجمعات متعددة البروتينات غير المتجانسة. Nat Biotechnol 22 (12): 1583-1587. دوى: 10.1038 / nbt1036

Bieniossek C ، و Nie Y ، و Frey D ، و Olieric N ، و Schaffitzel C ، و Collinson I ، و Romier C ، و Berger P ، و Richmond TJ ، و Steinmetz MO ، و Berger I (2009). طرق نات 6 (6): 447-450. دوى: 10.1038 / نميث 1326

Busso D، Peleg Y، Heidebrecht T، Romier C، Jacobovitch Y، Dantes A، Salim L، Troesch E، Schuetz A، Heinemann U، Folkers GE، Geerlof A، Wilmanns M، Polewacz A، Quedenau C، Bussow K، Adamson R ، Blagova E ، Walton J ، Cartwright JL ، Bird LE ، Owens RJ ، Berrow NS ، Wilson KS ، Sussman JL ، Perrakis A ، Celie PH (2011) التعبير عن مجمعات البروتين باستخدام عدة الإشريكية القولونية أنظمة التعبير المشترك للبروتين: دراسة معيارية. J بنية بيول 175 (2): 159-170. دوى: 10.1016 / j.jsb.2011.03.004

كاريرا جي ، رودريغو جي ، جاراميلو أ (2009) نحو الهندسة الآلية للجينوم الاصطناعي. مول بيوسيست 5 (7): 733-743. دوى: 10.1039 / b904400k

كوهين إس إن ، تشانغ إيه سي ، بوير إتش دبليو ، هيلنج آر بي (1973) بناء بلازميدات بكتيرية وظيفية بيولوجيًا في المختبر. Proc Natl Acad Sci U S A 70 (11): 3240-3244

Cowieson NP ، Kobe B ، Martin JL (2008) نحن متحدون: نجمع بين الأساليب الهيكلية. هيكل العملة بالعملة بيول 18 (5): 617-622. دوى: 10.1016 / j.sbi.2008.07.004

دينيس ك ، سرينك ف ، بايلي جي إي (1985) تأثيرات الأمبيسلين على خمسة مؤتلف الإشريكية القولونية السلالات: الآثار المترتبة على تصميم ضغط الاختيار. Biotechnol Bioeng 27 (10): 1490–1494. دوى: 10.1002 / بت. 260271014

Dymond JS، Richardson SM، Coombes CE، Babatz T، Muller H، Annaluru N، Blake WJ، Schwerzmann JW، Dai J، Lindstrom DL، Boeke AC، Gottschling DE، Chandrasegaran S، Bader JS، Boeke JD (2011) تعمل في الخميرة وتولد تنوعًا ظاهريًا عن طريق التصميم. طبيعة 477 (7365): 471-476. دوى: 10.1038 / nature10403

Fitzgerald DJ، Berger P، Schaffitzel C، Yamada K، Richmond TJ، Berger I (2006) التعبير المركب للبروتين باستخدام نواقل متعددة الجينات baculoviral. طرق نات 3 (12): 1021-1032. دوى: 10.1038 / nmeth983

Gibson DG ، و Benders GA ، و Andrews-Pfannkoch C ، و Denisova EA ، و Baden-Tillson H ، و Zaveri J ، و Stockwell TB ، و Brownley A ، و Thomas DW ، و Algire MA ، و Merryman C ، و Young L ، و Noskov VN ، و Glass JI ، و Venter JC ، و Hutchison CA، Smith HO (2008a) التركيب الكيميائي الكامل والتجميع والاستنساخ لـ a المفطورة التناسلية الجينوم. العلوم 319 (5867): 1215-1220. دوى: 10.1126 / العلوم .1151721

Gibson DG، Benders GA، Axelrod KC، Zaveri J، Algire MA، Moodie M، Montague MG، Venter JC، Smith HO، Hutchison CA (2008b) تجميع بخطوة واحدة في خميرة مكونة من 25 شظية متداخلة من الحمض النووي لتشكيل تركيبة اصطناعية كاملة المفطورة التناسلية الجينوم. Proc Natl Acad Sci U S A 105 (51): 20404-20409. دوى: 10.1073 / pnas.0811011106

Gibson DG ، Young L ، Chuang RY ، Venter JC ، Hutchison CA 3rd ، Smith HO (2009) التجميع الإنزيمي لجزيئات الحمض النووي حتى عدة مئات من الكيلوبات. طرق نات 6 (5): 343-345. دوى: 10.1038 / نميث .1318

Gibson DG ، Glass JI ، Lartigue C ، Noskov VN ، Chuang RY ، Algire MA ، Benders GA ، Montague MG ، Ma L ، Moodie MM ، Merryman C ، Vashee S ، Krishnakumar R ، Lion-Garcia N ، Andrews-Pfannkoch C ، Denisova EA، Young L، Qi ZQ، Segall-Shapiro TH، Calvey CH، Parmar PP، Hutchison CA، Smith HO، Venter JC (2010) إنشاء خلية بكتيرية يتحكم فيها جينوم مركب كيميائيًا. علم 329 (5987): 52-56. دوى: 10.1126 / العلوم .1190719

Gunyuzlu PL ، Hollis GF ، Toyn JH (2001) بناء البلازميد عن طريق إعادة التركيب المتماثل بمساعدة الرابط في الخميرة. التقنيات الحيوية 31 (6): 1246 ، 1248 ، 1250

Kaznessis YN (2007) نماذج للبيولوجيا التركيبية. BMC Syst Biol 1:47. دوى: 10.1186 / 1752-0509-1-47

Kim KJ ، و Kim HE ، و Lee KH ، و Han W ، و Yi MJ ، و Jeong J ، و Oh BH (2004) يعتبر ناقل المعززين ثنائي الفعالية عالي الكفاءة للإفراط في إنتاج مجمعات البروتين. بروتين Sci 13 (6): 1698-1703. دوى: 10.1110 / ps.04644504

Krivoruchko A، Siewers V، Nielsen J (2011) فرص هندسة التمثيل الغذائي للخميرة: دروس من البيولوجيا التركيبية. Biotechnol J 6 (3): 262-276. دوى: 10.1002 / biot.201000308

Lee JW ، Kim TY ، Jang YS ، Choi S ، Lee SY (2011) هندسة التمثيل الغذائي للأنظمة للمواد الكيميائية والمواد. الاتجاهات التكنولوجيا الحيوية 29 (8): 370-378. دوى: 10.1016 / j.tibtech.2011.04.001

Li MZ ، Elledge SJ (2007) تسخير إعادة التركيب المتماثل في المختبر لتوليد DNA المؤتلف عبر SLIC. طرق نات 4 (3): 251-256. دوى: 10.1038 / nmeth1010

Ma H، Kunes S، Schatz PJ، Botstein D (1987) بناء البلازميد عن طريق إعادة التركيب المتماثل في الخميرة. جين 58 (2-3): 201-216

McArthur GHT ، Fong SS (2010) نحو هندسة التمثيل الغذائي الميكروبي الاصطناعي. J Biomed Biotechnol 2010: 459760. دوى: 10.1155 / 2010/459760

Miyazaki K (2011) استنساخ MEGAWHOP: طريقة لإنشاء مكتبات الطفرات العشوائية عبر PCR الضخم للبلازميدات الكاملة. طرق الإنزيم 498: 399-406. دوى: 10.1016 / B978-0-12-385120-8.00017-6

Miyazaki K، Takenouchi M (2002) إنشاء مكتبات طفرات عشوائية باستخدام PCR الضخم للبلازميد الكامل. التقنيات الحيوية 33 (5): 1033-1034 ، 1036-1038

Na D ، Kim TY ، Lee SY (2010) إنشاء وتحسين المسارات التركيبية في هندسة التمثيل الغذائي. ميكروبيول بالعملة 13 (3): 363-370. دوى: 10.1016 / j.mib.2010.02.004

Nandagopal N ، Elowitz MB (2011) البيولوجيا التركيبية: دوائر الجينات المتكاملة. علم 333 (6047): 1244-1248. دوى: 10.1126 / العلوم .1207084

Perrakis A ، Musacchio A ، Cusack S ، Petosa C (2011) التحقيق في مجمع جزيئي ضخم: مجموعة أدوات الطرق. J بنية بيول 175 (2): 106-112. دوى: 10.1016 / j.jsb.2011.05.014

Portnoy VA، Bezdan D، Zengler K (2011) تطور المختبر التكيفي - تسخير قوة علم الأحياء للهندسة الأيضية. التكنولوجيا الحيوية بالعملة 22 (4): 590-594. دوى: 10.1016 / j.copbio.2011.03.007

Purnick PE ، Weiss R (2009) الموجة الثانية من البيولوجيا التركيبية: من الوحدات إلى الأنظمة. بيول ريف مول سيل 10 (6): 410-422. دوى: 10.1038 / nrm2698

Ramon A ، Smith HO (2011) تجميع اندماجي قائم على الرابط أحادي الخطوة لأشرطة المروج والجينات لهندسة المسارات. Biotechnol Lett 33 (3): 549-555. دوى: 10.1007 / s10529-010-0455-x

Raymond CK ، Pownder TA ، Sexson SL (1999) طريقة عامة لبناء البلازميد باستخدام إعادة التركيب المتماثل. التقنيات الحيوية 26 (1): 134-138 ، 140-131.

Scheich C ، Kummel D ، Soumailakakis D ، Heinemann U ، Bussow K (2007) ناقلات للتعبير المشترك عن عدد غير محدود من البروتينات. الأحماض النووية الدقة 35 (6): e43. دوى: 10.1093 / nar / gkm067

Storici F ، Durham CL ، Gordenin DA ، Resnick MA (2003) يتم استهداف الفواصل المزدوجة للكروموسومات الخاصة بالموقع بكفاءة للإصلاح عن طريق قليلات النوكليوتيدات في الخميرة. Proc Natl Acad Sci U S A 100 (25): 14994-14999. دوى: 10.1073 / pnas.2036296100

Tillett D، Neilan BA (1999) الاستنساخ الخالي من الإنزيم: طريقة سريعة لاستنساخ منتجات PCR بشكل مستقل عن مواقع إنزيم تقييد النواقل. الأحماض النووية الدقة 27 (19): e26

Vick JE ، و Johnson ET ، و Choudhary S ، و Bloch SE ، و Lopez-Gallego F ، و Srivastava P ، و Tikh IB ، و Wawrzyn GT ، و Schmidt-Dannert C (2011) مجموعة متوافقة محسّنة من متجهات BioBrick لهندسة المسارات الأيضية. أبيل ميكروبيول Biotechnol 92 (6): 1275-1286. دوى: 10.1007 / s00253-011-3633-4

Wakamori M ، Umehara T ، Yokoyama S (2010) سلسلة من نواقل التعبير المشترك البكتيرية مع تسلسل التعرف على القاطع النادر. بروتين Expr Purif 74 (1): 88-98. دوى: 10.1016 / j.pep.2010.06.016

Wang TW، Zhu H، Ma XY، Zhang T، Ma YS، Wei DZ (2006) بناء مكتبة متحولة في التطور الجزيئي الموجه: صب شبكة أوسع. مول Biotechnol 34 (1): 55-68. دوى: 10.1385 / ميجابايت: 34: 1: 55

Wang HH ، Isaacs FJ ، Carr PA ، Sun ZZ ، Xu G ، Forest CR ، Church GM (2009) خلايا البرمجة عن طريق هندسة الجينوم المتعدد والتطور السريع. طبيعة 460 (7257): 894-898. دوى: 10.1038 / nature08187

Wingler LM ، Cornish VW (2011) إعادة التركيب التكراري للتجميع في الجسم الحي لمكتبات المسارات متعددة الجينات. بروك ناتل أكاد Sci U S A 108 (37): 15135-15140. دوى: 10.1073 / pnas.1100507108

Wladyka B ، Puzia K ، Dubin A (2005) التعبير المشترك الفعال لل staphopain المؤتلف A ومثبطه staphostatin A في الإشريكية القولونية. Biochem J 385 (Pt 1): 181-187. دوى: 10.1042 / BJ20040958

Yang W، Zhang L، Lu Z، Tao W، Zhai Z (2001) طريقة جديدة لتعايش البروتين في الإشريكية القولونية باستخدام اثنين من البلازميدات غير المتوافقة. Expr Protein Expr Purif 22 (3): 472-478. دوى: 10.1006 / الإعدادية .2001.1453

Yokoyama S (2003) أنظمة التعبير البروتيني للجينوميات الهيكلية والبروتيوميات. العملة المفتوحة تشيم بيول 7 (1): 39-43. دوى: S1367593102000194


التقنيات المستخدمة في التجربة و أمبير

تشمل التطبيقات التجريبية:

  1. اكتشاف المخدرات / تحديد الهدف
  2. تحديد العلامات الحيوية
  3. علم الاحياء المجهري
  4. علم الفيروسات
  5. المعلوماتية الحيوية / النظاميات
  6. التكنولوجيا الحيوية
  7. الاستنساخ المؤتلف
  8. علم الجينوم
  9. علم الوراثة
  10. التحاليل الجنائية

تشمل التطبيقات السريرية:

  1. تشخيص طبي
  2. الطب الشخصي / قرارات المريض
  3. علم الجينات الصيدلية
  • عند إضافة نوكليوتيد آخر ، فإن DNA Polymerase سوف يكسر الرابطة بين الفوسفات الأول والثاني من ثلاثي فوسفات deoxynucleoside
  • ثم يتم ضم النوكليوتيدات الواردة إلى الهيدروكسيل 3 الحر لسلسلة الحمض النووي المتنامية

تسلسل الحمض النووي الفلوري الآلي

  • يستخدم 4 ، أصباغ الفلورسنت المختلفة ، واحدة لكل من القواعد الأربع
  • يتم تشغيل جميع التفاعلات الأربعة في ممر واحد من الجل حيث يمكن تمييز القواعد الأربعة بسهولة من خلال ألوانها
  • الملقب التسلسل بواسطة مصفوفة Oligonucleotide
  • يُظهر هذا مجموعة قليلة النوكليوتيد تحتوي على 4 مجموعات أزواج أساسية ممكنة
  • يتم تمييز جزء الحمض النووي غير المعروف بشكل فلوري ، ويسمح له بالتهجين مع كل النكليوتيدات الممكنة على الرقاقة
    • البقعة الأولى التي تم تهجينها إلى الحمض النووي غير المعروف لها التسلسل ، ATCG
    • البقعة الثانية التي تم تهجينها لها التسلسل ، CTGG
    • النقطة الثالثة التي تم تهجينها لها التسلسل ، TGGC

    سيقوم الكمبيوتر بتجميعها بالترتيب المتداخل الصحيح

    ثم يتم تحديد التسلسل بناءً على هذه المعلومات 5. التسلسل الحراري

    • أثناء كل تفاعل تسلسلي ، يتم إطالة الحمض النووي بواسطة نوكليوتيد واحد ويتم تحرير البيروفوسفات
    • يستخدم البيروفوسفات مع فوسفات الأدينوسين (APS) بواسطة سلفوريلاز ATP لتوليد ATP. يستخدم Luciferase ATP + Luciferin ، وينبعث منه الضوء (الفلورة)
    • يزيل Apyrase ثلاثي الفوسفات غير المستخدم
    1. تسلسل الجيل القادم
    • زيادة السرعات في قراءات النتائج وانخفاض التكاليف
    • يمكن أن يكون عدد كبير من العينات جنبًا إلى جنب في نفس الجهاز
    • يمكن استخدام الحمض النووي الجيني النقي كقالب
    • ما هي الطرق الرئيسية؟
    1. 454 التسلسل: يستخدم التسلسل الحراري لتحديد ما هي النوكليوتيدات المضافة بواسطة DNA Polymerase

    هذا يخبر المجرب أن الحمض النووي المجهول قد تم عبوره تمامًا ، وهو الآن متسلسل بالكامل.

    1. تسلسل Illumina / Solexa: يستخدم مواد إنهاء صبغية قابلة للانعكاس لتحديد النيوكليوتيد الذي تمت إضافته بواسطة DNA Polymerase
    1. كشف الحمض النووي نانوبوري
      • يفصل الغشاء النانوي بين جزئين بشحنة مختلفة

    يمكن للجزيئات سالبة الشحنة (أي: DNA) أن تمر عبر المسام في تشكيل ممتد

    يقيس الكاشف مقدار التيار المنخفض ، بسبب تدفق الأيونات الطبيعي - نظرًا لأن كل قاعدة تغير التيار بكميات مختلفة ، يمكن للكاشف تحديد التسلسل أثناء مرور الحمض النووي عبر المسام


    شاهد الفيديو: Bladeren Volkswagen Transporter T5 - stijve eigenaar breekt Transporter T5 (كانون الثاني 2023).