معلومة

بروتينات كارهة للماء في الجسم؟

بروتينات كارهة للماء في الجسم؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أعلم أنه يمكننا الحصول على أحماض أمينية كارهة للماء ، لكن هل هناك بروتينات في الجسم يكون سطحها كارهًا للماء؟ إذا كان الأمر كذلك ، فما هي وظيفتها النموذجية وأين يمكن العثور عليها عادةً ، وإذا لم يكن الأمر كذلك ، فلماذا لا؟


هل توجد بروتينات في الجسم يكون سطحها كارهًا للماء؟

بالتأكيد. على الرغم من أنك محق في الاعتقاد بأن معظم البروتينات لها أسطح محبة للماء ، إلا أن بعضها كاره للماء. المثال المفضل لدي هو الإيلاستين ، فهو المكون الرئيسي للبشرة الذي يمنحها المرونة. في الواقع ، الطبيعة الكارهة للماء للإيلاستين هي ما يمنحها وظيفتها. الفكرة ، باختصار ، هي أن البنية غير القابلة للذوبان / الكارهة للماء سوف تميل إلى تقليل مساحة سطحها بالماء ، لذلك إذا قمت بتمديد مثل هذه المادة (أي زيادة مساحة السطح) ، فسوف تتراجع إلى حالة مساحة السطح الدنيا.

المرجع: Li، Daggett. الأساس الجزيئي لقابلية تمدد الإيلاستين. مجلة أبحاث العضلات وحركة الخلايا (2002).


علامات دهنية لإزالة البروتين

تعتبر معظم البروتينات في جسم الإنسان أهدافًا صعبة للأدوية ذات الجزيئات الصغيرة. ربما تم التغلب على هذه المشكلة باكتشاف الجزيئات التي تحفز تدهور البروتين ، مما يشير إلى مناهج معيارية جديدة لاكتشاف الأدوية.

تم اكتشاف 1،2 مؤخرًا أن البروتينات "الموسومة" تساهميًا بجزيئات صغيرة ، اصطناعية ، كارهة للماء تتحلل بواسطة آلية مراقبة الجودة في الخلية. الكتابة الكيمياء وعلم الأحياء، طويل وآخرون. ذكر 3 الآن أن الارتباط غير التساهمي لهذه الجزيئات يشير أيضًا إلى البروتينات للتحلل. يمكن أن يفتح هذا الاكتشاف مجالًا واسعًا من البروتينات كأهداف لبرامج اكتشاف الأدوية.

تعكس ندرة الأدوية المعتمدة حديثًا في العقد الماضي التحديات التي تواجه صناعة الأدوية. على الرغم من أن التطورات في علم الجينوم قد حددت العديد من البروتينات المتورطة في المرض ، فإن العديد من هذه البروتينات - خاصة تلك التي ليست إنزيمات - ليست أهدافًا دوائية قابلة للتطبيق حاليًا. في الواقع ، تم تقدير أن حوالي 15٪ فقط من البروتينات البشرية "قابلة للعلاج" بجزيئات صغيرة 4.

لذلك تم وصف العديد من أهداف المخدرات الجذابة بأنها "غير قابلة للتدمير". على سبيل المثال ، هناك ما يقرب من 1400 عامل نسخ بشري - بروتينات تنظم تخليق الحمض النووي الريبي المرسال من الحمض النووي ، ولكنها تفتقر إلى النشاط الأنزيمي. تظل هذه البروتينات غير قابلة للتخلص إلى حد كبير ، على الرغم من حقيقة أن التعبير الشاذ عن بعضها معروف بأنه يسبب السرطان. يتمثل أحد الحلول الممكنة لهذا التحدي في تطوير رنا صغيرة متداخلة (siRNAs) ، والتي تتدخل في التعبير الجيني عن طريق الارتباط بـ mRNA. ومع ذلك ، تسليم siRNAs إلى أهدافهم في الجسم الحي كانت عقبة يصعب التغلب عليها ، لذا فإن هناك حاجة إلى جزيئات صغيرة يمكن أن تؤثر على وظيفة البروتينات غير القابلة للتدمير.

هناك طريقة أخرى ناشئة تتمثل في تدمير البروتينات المستهدفة في الخلايا بدلاً من تثبيطها. يتم التوسط في دوران البروتين الطبيعي في الخلايا بشكل أساسي عن طريق نظام يوبيكويتين-بروتيازوم (UPS) ، الذي يميز البروتينات غير المرغوب فيها أو غير المنتظمة بسلاسل بروتين يوبيكويتين. بمجرد أن تتواجد في كل مكان ، يتم التعرف على البروتينات المميزة بواسطة البروتيازوم ، وهو آلة جزيئية كبيرة تشبه البرميل تقوم بشق البروتينات إلى ببتيدات صغيرة. يعد الإزالة الفعالة للبروتينات غير المرغوب فيها مفتاحًا لبقاء الخلية ، كما يتضح من تطوير مثبطات البروتوزوم كعوامل فعالة مضادة للأورام 5.

تم الإبلاغ عن العديد من الاستراتيجيات التي تستخدم UPS لتحطيم البروتين المستهدف. أحد هذه الاستخدامات `` جزيئات خيمرية تستهدف تحلل البروتين '' لجلب البروتين محل الاهتمام بالقرب من ubiquitin ligase (إنزيم يتوسط انتشار البروتين المستهدف) ، مما يؤدي إلى انتشار البروتين في كل مكان والتحلل اللاحق 6.

نهج بديل هو محاكاة حالة البروتين غير المطوية باستخدام جزيئات صغيرة. عادة ، يتم دفن السلاسل الجانبية "الدهنية" (الكارهة للماء) من البولي ببتيدات في الجزء الداخلي من البروتين الكروي ، مع وجود بقايا الأحماض الأمينية المحبة للماء على السطح. حتى الزيادة الطفيفة في نفاذية السطح يمكن أن تجعل البروتين غير مستقر. على سبيل المثال ، حذف حمض أميني واحد من بروتين CFTR هو السبب الرئيسي للتليف الكيسي. ينتج عن الحذف تعرض البقع الكارهة للماء على سطح CFTR ، مما يؤدي إلى اختلال في تشكيل البروتين وتلفه اللاحق (الشكل 1).

أ، تساعد بروتينات Chaperone الخلوية البروتينات الأخرى التي تكشفت جزئيًا لتتحول إلى بنيتها الثلاثية الصحيحة. إذا فشل إعادة الطي ، فإن المرافقين تؤدي إلى تدهور البروتين غير المطوي بواسطة البروتيازوم ، وهو مركب بروتيني كبير. ب، يمكن للمجموعات الاصطناعية الكارهة للماء المرتبطة بسطح البروتين أن تحاكي الحالة غير المطوية جزئيًا. نظرًا لأن المرافقين غير قادرين على إعادة طي هذه البروتينات ، فإن البروتينات الموسومة تتحلل بواسطة البروتيازوم. طويل وآخرون. ذكر 3 أن العلامات الكارهة للماء لا تحتاج إلى ربط تساهميًا ببروتين للحث على التدهور.

لقد أظهرنا مؤخرًا 1،2 أن الارتباط التساهمي لمجموعة اصطناعية كارهة للماء (مثل الأدمانتان ، هيدروكربون ضخم) على سطح البروتينات يجذب البروتينات المرافقة التي تتمثل مهمتها في المساعدة في إعادة طي البروتينات غير المطوية ، أو ، إذا لم يكن من الممكن إعادة طيها ، لاستهدافهم للتحلل بواسطة البروتيازوم. لكن معظم الأدوية ترتبط بالبروتينات من خلال التفاعلات غير التساهمية ، ولم يكن واضحًا ما إذا كانت الجزيئات غير المرتبطة تساهميًا يمكنها أيضًا إطلاق هذا التسلسل من الأحداث.

طويل وآخرون. 3 قد حسم هذا القلق. قاموا بالتحقيق في التأثير البيولوجي لربط مجموعة كارهة للماء (Boc3Arg ، وهو حمض أميني معدل من الأرجينين) إلى ثلاثي ميثوبريم (TMP) ، وهو جزيء يجند يرتبط بشكل غير تساهمي بإنزيم اختزال ثنائي هيدروفولات (DHFR) من البكتيريا الإشريكية القولونية. لاحظ المؤلفون أن TMP-Boc3Arg يسبب تدهور 30-80٪ DHFR في خلايا الثدييات ، اعتمادًا على معدل تخليق DHFR. يمكن حظر هذا التأثير إما عن طريق TMP ، الذي يتنافس مع TMP – Boc3Arg للارتباط بـ DHFR ، أو عن طريق مثبطات نشاط البروتياز.

أظهر المؤلفون أيضًا أن إنزيم الجلوتاثيون S-ترانسفيراز (GST) يتحلل عند معالجته بمركب3Arg مرتبط بحمض إيثاكرينيك (EA) ، وهو مثبط GST الذي يرتبط تساهميًا بالموقع النشط للإنزيم. هذا يدل على أن تأثير تدهور Boc3يحدث Arg لأنزيمين على الأقل. طويل وآخرون. ذهب إلى صنع بروتين اندماج يتم فيه ربط DHFR بـ GST ، ثم عالج الخلايا المنتجة للبروتين باستخدام TMP-Boc3Arg أو EA – Boc3أرج. لاحظوا أن DHFR-GST تدهورت بكفاءة أكبر بواسطة EA-Boc3Arg ، الذي يرتبط تساهميًا بالبروتين ، أكثر من TMP-Boc3Arg الذي يربط غير تساهمي. يشير هذا إلى أن الارتباط التساهمي للعلامات الكارهة للماء بالإنزيمات هو الإستراتيجية الأكثر فعالية لتدهور البروتين.

حيث أن TMP هو مثبط عالي التقارب لـ بكتريا قولونية DHFR ، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتحديد ما إذا كان الجزيء الصغير الذي يمثل مثبطًا للبروتين وإشارة تحلل أكثر فعالية في إلغاء وظيفة البروتين من المثبط البسيط. كما أشار المؤلفون ، توضح حالة توكسين البوتولينوم ميزة نهج التحلل. أقوى أشكال هذا السم ، الذي يسبب شلل العضلات ، له عمر نصف في الجسم حوالي 3 أشهر. على الرغم من أن مثبط السم سيكون قادرًا على قمع السمية على المدى القصير ، فمن الواضح أن التخلص من السم هو نهج علاجي مفضل.

ومع ذلك ، فإن Boc3جزء Arg كبير (ما يقرب من 500 دالتون في الكتلة) ، وغالبًا ما تحتوي الجزيئات الكبيرة على خصائص حركية دوائية ضعيفة تحد من استخدامها كأدوية. لذلك ، فإن إلحاقه بمثبط موجود قد يؤدي إلى تفاقم خصائص الحرائك الدوائية للمثبط. من الغريب ، على الرغم من أن TMP لديه تقارب كبير لـ بكتريا قولونية DHFR ويعتقد أن نفاذية الخلايا ممتازة ، طويلة وآخرون. هناك حاجة لاستخدام تركيز عالي من TMP – Boc3ارج لمراقبة تدهور البروتين. هذا يشير إلى أن TMP – Boc3Arg لديه صعوبة في اختراق الخلايا.

هناك حاجة إلى اختبار أنظمة الترابط البروتيني غير التساهمية الأخرى لتحديد الحد الأدنى من تقارب البروتين الرابط بين الترابط الضروري لبدء تحلل البروتين. وفي الوقت نفسه ، من المثير للاهتمام التكهن حول كيفية استخدام نمطية استراتيجية تحلل البروتين هذه لاكتشاف الأدوية. يمكن للمرء أن يتصور عملية مبسطة يتم فيها تحديد روابط البروتين غير القابل للتهريب ، وإلحاقها بأجزاء كارهة للماء (مثل adamantane أو Boc3Arg) واختبارها لقدرتها على تحطيم البروتين المستهدف. سيكون العثور على روابط عالية التقارب للبروتينات غير القابلة للتخلص تحديًا بالتأكيد ، لكن الأساليب أصبحت متاحة لتسهيل ذلك.

على سبيل المثال ، يمكن اختبار المكتبات الكيميائية التي يتم فيها إرفاق كل مركب بـ "رمز شريطي" فريد للحمض النووي من أجل ربط البروتين ، ويتم تحديد الكيانات الكيميائية التي لها أعلى ارتباطات ربط لاحقًا باستخدام الرموز الشريطية 7. ستسمح هذه الطريقة بالفحص السريع لما يصل إلى 10 9 مركبات ، بينما تستخدم أكبر الشاشات حاليًا الفحص فقط حوالي 10 6 مركبات 8. إن الجمع بين طرق الفحص عالية الإنتاجية مع نهج العلامات الكارهة للماء يمكن أن يجعل البروتينات غير القابلة للتهريب اليوم أهدافًا بيولوجية جذابة في البحث عن المركبات التي تخفف من مرض الإنسان.


مقدمة

فهم مفصل للأصول الجزيئية للتأثير الكارهة للماء 1،2،3،4،5،6،7،8،9،10 في البروتينات ودورها كقوة دافعة في طي البروتين وتجميعه 10،11،12 ، 13،14 لا تزال مشكلة مفتوحة. ينشأ هذا الموقف لأن تسلسل البروتين يشمل مزيجًا معقدًا من المناطق الكارهة للماء (غير القطبية) والمناطق المحبة للماء (القطبية). الأنماط الناتجة للمناطق غير القطبية لها أبعاد نموذجية تتوافق مع قيمة حرجة للتأثير الكارهة للماء 1،2،3،4،5،6،7،8. هذه القيمة ، التي تبلغ حوالي 1 نانومتر ، تتوافق مع التمييز بين المذابات الصغيرة والكبيرة غير القطبية 1،2،3،4،5،6،7،8،9. لفهم الأصل الجزيئي لهذا الطول المميز ، يجب أن يبدأ المرء من ملاحظة أن جزيئات الماء تميل إلى تكوين شبكات من الروابط الهيدروجينية على حساب إنتروبياها الدورانية. تحتل المواد المذابة غير القطبية الأصغر من 1 نانومتر حجمًا صغيرًا جدًا بحيث لا يزعج بشكل كبير تكوين شبكات الروابط الهيدروجينية. على النقيض من ذلك ، لا يمكن لجزيئات الماء القريبة من أسطح المواد المذابة غير القطبية التي يزيد حجمها عن 1 نانومتر أن تشكل جميع الروابط الهيدروجينية التي يمكن أن تفعلها بكميات كبيرة. تتوافق هاتان الحالتان مع مقياس مختلف للقوى الكارهة للماء ، مع الحجم أو السطح ، للمذابات الصغيرة أو الكبيرة الكارهة للماء ، على التوالي 1.

هدفنا هنا هو توضيح أولاً ما إذا كانت البروتينات ، التي تتميز أسطحها كما هو مذكور أعلاه بوجود أنماط معقدة قطبية وغير قطبية ، تتصرف بشكل فعال مثل المواد المذابة الصغيرة أو الكبيرة غير القطبية ، ثم التحقيق في عواقب هذه الحقيقة على سلوكهم للطي 11،12،13. تتطلب معالجة هذا السؤال توصيفًا دقيقًا للمساحة التوافقية للبروتين في الماء لدراسة عدد الروابط الهيدروجينية التي تشكلها جزيئات الماء بالقرب من سطحه فيما يتعلق بالجزء الأكبر.

لمهاجمة هذه المشكلة ، استغلنا الفرص التي تتيحها حالة خميرة الفراتاكسين (الشكل 1 أ). الفراتاكسين ، وهو بروتين يشارك في تجميع مجموعات الحديد والكبريت ، يرتبط أيضًا بترنح فريدريك ، وهو حالة تنكسية عصبية قاتلة 15. لقد أخذنا في الاعتبار خميرة فراتاكسين لأن هذا البروتين يمثل أحد الأمثلة القليلة التي لوحظت فيها كل من الحالات الباردة والساخنة المشوهة عند درجة الحموضة المحايدة وبدون إضافة عوامل مزعزعة للاستقرار (عند 272 كلفن و 323 كلفن ، على التوالي) ، وتتميز بالرنين المغناطيسي النووي (NMR) التحولات الكيميائية وازدواج اللون الدائري (CD) 15،16،17،18. كما يتضح من العمل الرائد لبريفالوف ، فإن التحليل الديناميكي الحراري للتمسخ البارد ، مقارنةً بالتحليل الحراري ، يوفر مزايا فريدة لفهم المحددات الجزيئية للكارهة للماء 19،20. في الواقع ، من المعترف به عمومًا أنه في حين أن التمسخ الحراري هو نتيجة للزيادة الناتجة عن درجة الحرارة في التقلبات التوافقية ، فإن التمسخ البارد هو نتيجة لاكتساب المحتوى الحراري للمذيب 19،20. لا يُعرف الكثير من التفاصيل الذرية ، مع ذلك ، حول العواقب الهيكلية لهذا الكسب من الانتروبيا أو المحتوى الحراري في حالات التحريف الصفات الساخنة والباردة ، على التوالي. وبالتالي ، فإن نمذجة الحالات الباردة والساخنة المشوهة لخميرة فراتاكسين في غياب أي عامل إضافي يجب أن يسلط الضوء على الأدوار المختلفة التي يلعبها البروتين والمذيب في درجات حرارة مختلفة.

(أ) هيكل الحالة الأصلية لفراتاكسين. (ب) تم تحديد سطح الطاقة الحرة للحالة المشوهة الباردة (CDS) عند 272 كلفن كدالة لخريطة الرسم 63 المتغيرات الجماعية التي تصف السمات التوافقية للمجموعات (انظر الطرق). تظهر تسع دول صغيرة تمثل الحدود الدنيا المحلية والعالمية. تشكل هذه الدول الصغيرة 90٪ من إجمالي عدد السكان. (ج) سطح الطاقة الحرة للحالة الساخنة المشوهة (HDS) المحددة عند 323 كلفن كدالة لنفس المتغيرين الجمعيين. تظهر ستة عشر دولة صغيرة تمثل الحدود الدنيا المحلية والعالمية. تشكل هذه الدول الصغيرة & gt90 ٪ من إجمالي السكان (انظر الطرق). (د ، ه) مجموعات البنية الثانوية لـ CDS (د) و HDS (ه). يتم تمثيل α-Helices باللون الأزرق ، ويتم تمثيل خيوط باللون الأحمر والبولي برولين II في الطاقات الحرة الخضراء بالكيلوجول / مول.

في ما يلي ، نستخدم التحولات الكيميائية المقاسة في ظروف التمسخ الباردة والساخنة 15،16،17 جنبًا إلى جنب مع محاكاة ميتاديناميك متماثلة (RAM) 21،22 (انظر المواد والطرق) لتوضيح الدقة الذرية بنية وديناميات الحالة الباردة المشوهة (CDS) والحالة الساخنة المشوهة (HDS). في محاكاة ذاكرة الوصول العشوائي (RAM) ، تم دمج المعلومات التجريبية التي توفرها التحولات الكيميائية بالرنين المغناطيسي النووي من حيث القيود الهيكلية 22 وفي نفس الوقت يتم تحسين أخذ عينات من الفضاء المطابق بواسطة metadynamics 23. هذا النهج الشامل يجعل من الممكن في وقت واحد تغيير مجال القوة المستخدم في محاكاة الديناميات الجزيئية لتحسين اتفاقهم مع البيانات التجريبية بروح مبدأ الانتروبيا القصوى 24 ولتقليل الموارد الحسابية المطلوبة بشكل كبير للحصول على التقارب في أخذ العينات. بعد ذلك ، باستخدام تحليل قيم Φ 25،26،27 و-المحاكاة الجزيئية المقيدة 26 ، حددنا حالة الانتقال الباردة (CTS) وحالة الانتقال الساخنة (HTS) لوصف الاختلافات في عمليات التمسخ الباردة والساخنة المقابلة. للاختلافات بين الدول المشوهة بالباردة والساخنة.


هرمونات الستيرويد

هرمونات الستيرويد ، كونها جزيئات كارهة للماء ، تنتشر بحرية في جميع الخلايا. ومع ذلك ، فإن خلاياها & quottarget & quot تحتوي على بروتينات حشوية و / أو نووية تعمل كمستقبلات للهرمون. يرتبط الهرمون بالمستقبل ويرتبط المركب به عناصر الاستجابة الهرمونية و [مدش] من الحمض النووي داخل محفزات الجينات المستجيبة للهرمون. يعمل مجمع الهرمون / المستقبلات كمركب عنصر الاستنساخ تحويل الجينات المستهدفة & quoton & quot (أو & quotoff & quot).


قصة نوعين

سوف تتعرف على نوعين من بروتينات الغشاء: هامشي البروتينات و أساسي البروتينات. البروتينات المحيطية لها وصلات أضعف ومؤقتة بالغشاء. يجلس البعض على السطح ، مثبتًا ببعض الروابط الأيونية بينما قد يحتوي البعض الآخر على أقسام صغيرة تنغمس في القسم الكارهة للماء من الطبقة الثنائية. عندما تنظر إلى الغشاء بأكمله ، هناك المزيد من البروتينات المحيطية عند مقارنتها بعدد البروتينات المتكاملة.

كما يمكنك التخمين من الاسم ، ترتبط البروتينات المتكاملة بشكل دائم بغشاء الخلية. إنهم يعملون بجد ولديهم أقسام كبيرة مضمنة في نافرة من الماء (وسط) طبقة من الغشاء.

ترانسيمبرين البروتينات هي بروتينات متكاملة تعبر الغشاء ويمكن أن تعمل كمسارات للأيونات والجزيئات. بوليتوبيك تعبر بروتينات الغشاء الغشاء عدة مرات. بعضها عبارة عن بروتينات مستقبلية بينما يشكل البعض الآخر قنوات. تسمى حركة الأيونات التي لا تتطلب عملاً النقل السلبي بينما تستخدم أنظمة النقل النشطة العمل لتحريك الجزيئات. يستخدم النقل النشط بانتظام عندما تضخ البروتينات الغشائية الأيونات ضد تدرج التركيز.


الاستنتاجات

يشير التحليل الحالي إلى أن استراتيجية التكيف المشترك للبروتينات في وجود تركيز الملح المولي ، ولكن ليس في وجود الأسمولات ، تستلزم إضعاف التفاعلات الكارهة للماء بشكل عام ، وبشكل خاص على مستوى الاتصالات الأساسية والكارهة للماء. يوازن إضعاف هذه التفاعلات تقويتها من خلال وجود الأملاح في المحلول وقد يساعد الهيكل على منع التجميع و / أو فقدان الوظيفة في البيئات شديدة الملوحة. في الواقع ، يؤدي تقليل كره الماء إلى جعل البروتينات المحبة للملح غير مستقرة في المحاليل الملحية منخفضة التركيز وقد يفسر جزئيًا طلب البروتينات المحبة للملوحة لتركيزات عالية من الملح. لإكمال الصورة ، ينبغي النظر في زعزعة استقرار البروتينات المحبة للملح بتركيز منخفض الملح بسبب التنافر الإلكتروستاتيكي القوي [18 ، 33]. يجب أن يكون تقلص الملامسات الكارهة للماء أكثر أهمية في المراحل المبكرة من الطي عندما يجب أن تتشكل النوى داخل الجزيئية بشكل صحيح لتوجيه البولي ببتيد عبر قمع الطي إلى الحالة الأصلية.

بالنظر أيضًا إلى الزيادة الكبيرة في تطبيقات التكنولوجيا الحيوية لعشاق الملوحة ، يمكن أن يوفر فهم المسببات متعددة الأوجه للألفة للملوحة (بما في ذلك العوامل الكهروستاتيكية) الأساس النظري لهندسة البروتينات ذات الأهمية الكبيرة لأنها مستقرة عند تركيزات الأملاح التي تسبب تمسخ أو تراكم من غالبية الجزيئات الكبيرة.


نتائج

إطار لوصف التفاعلات التي تعمل على استقرار حالة القطرة.

فرضية هذا العمل هو أن حالة القطيرات تتميز بتفاعلات منخفضة الخصوصية وانتروبيا توافقية شبيهة بالسائل. وبالتالي ، افترضنا أن البروتينات غير المتجانسة من حيث التوافق في حالاتها الأصلية وتحافظ على هذه الخاصية عند الارتباط ستكون عرضة بشكل خاص لتشكيل حالة القطيرات. عند تقدير درجة عدم التجانس التوافقي في كل من الحالتين الأصلية والمرتبطة ، نلاحظ أن البروتينات تمتد عبر سلسلة متصلة بين الترتيب الهيكلي والاضطراب (23 ، 24) ، والتي سوف نعبر عنها باحتمالات صد (دولة حرة) و صDD (دولة منضمة). نلاحظ أيضًا أن التفاعلات مع الانتروبيا التوافقية العالية تتحقق من خلال العديد من تكوينات الربط المختلفة ، والتي يمكن تحقيقها من خلال المجالات المرتبة والمضطربة (25). على النقيض من ذلك ، يتم التوسط في أوضاع الربط المرتبة ذات الانتروبيا التوافقية المنخفضة بواسطة واجهات محددة جيدًا ، كما يتضح من الإرساء الصلب أو الطي النموذجي (26).

تعرض أوضاع الربط المرتبة والمضطربة توقيعات تسلسل مميزة. الزخارف التي تتوسط في أوضاع الربط المرتبة لها تحيز تركيبي قوي مقارنة بمناطق بروتين التضمين الخاصة بها. في المقابل ، تتشابه الزخارف الوسيطة في أنماط الربط المضطرب مع المناطق المحيطة بها ، والتي يمكن إدراكها من خلال مجموعة متنوعة من أنماط التسلسل وأنواع الاتصال ، حيث تنبع خصوصيتها من طابعها المميز مقارنة بالمناطق المحيطة بها (23). لقد أوضحنا سابقًا (27) أنه من خلال تحديد عناصر التفاعل هذه بناءً على التحيز التركيبي ، من الممكن تقدير الترتيب الهيكلي أو الاضطراب في ظل الظروف الخلوية باتفاق ممتاز مع الدراسات البروتينية في الجسم الحي (28).

خصائص البروتينات التي يمكن أن تشكل حالة القطرة.

مجموعات البيانات من البروتينات التي تمثل حالة القطيرات.

لقد قمنا بتحليل ثلاث مجموعات بيانات عامة من البروتينات التي تم الإبلاغ عن خضوعها لفصل الطور السائل عن السائل (المواد والأساليب). الأول هو مجموعة بيانات PhaSepDB (http://db.phasep.pro/) (29) ، والتي تجمع البيانات من ثلاثة مصادر (المواد والأساليب و Dataset S1): 1) بروتينات من الأدبيات مع بيانات تجريبية في الجسم الحي وفي المختبر حول فصل الطور السائل عن السائل (REV ، 351 بروتينًا المواد والأساليب و Dataset S1) ، 2) بروتينات من UniProt مرتبطة بالعضويات المعروفة (UNI ، 378 بروتينًا المواد والأساليب و Dataset S1) ، و 3) البروتينات التي تم تحديدها من خلال تجارب عالية الإنتاجية لفصل الطور السائل عن السائل (HTS ، 2572 بروتينًا المواد والأساليب ومجموعة البيانات S1). مجموعة البيانات الثانية هي PhaSePro (https://phasepro.elte.hu) (30) ، والتي تحدد مناطق البروتين المرتبطة بفصل الطور السائل عن السائل (PSP ، 121 بروتينًا المواد والأساليب ومجموعة البيانات S1). مجموعة البيانات الثالثة هي LLPSDB (http://bio-comp.org.cn/llpsdb) (31) ، والتي تجمع البروتينات التي لوحظ أنها تخضع لفصل الطور السائل عن السائل في المختبر مع ظروف تجريبية محددة جيدًا ومخططات المرحلة (المواد والأساليب ومجموعة البيانات S1). يميز LLPSDB ما إذا كان يمكن للبروتينات أن تنفصل تلقائيًا كمكون واحد (بروتينات قيادة القطيرات ، LPS-D ، 133 بروتينًا المواد والأساليب و Dataset S1) أو تتطلب شريكًا للخضوع لفصل الطور السائل عن السائل (بروتينات عميل القطيرات ، LPS-C ، 41 بروتينًا المواد والأساليب ومجموعة البيانات S1). في مجموعة البيانات هذه ، يُظهر 77 بروتينًا كلاً من سلوكيات القيادة بالقطيرات وسلوكيات العميل.

لإنشاء مجموعة بيانات لفصل الطور السائل عن السائل ، قمنا بدمج البروتينات في مجموعات بيانات REV و PSP و LPS-D ، والتي نعتبرها محركات لتشكيل القطيرات (453 بروتينًا فريدًا ، ومجموعة بيانات LLPS المواد والأساليب ومجموعة البيانات S1). لقد أنشأنا مجموعتي بيانات تحكم سلبيين ، إحداهما تحتوي على بروتينات بشرية فقط والأخرى بمزيج من الكائنات الحية (Dataset S2). بالنسبة للمجموعة السلبية البشرية (مجموعة بيانات hsnLLPS ، 18108 بروتينات المواد والأساليب) ، استبعدنا من البروتين البشري Swiss-Prot جميع البروتينات التي ظهرت في أي من مجموعات بيانات فصل الطور السائل عن السائل (REV ، UNI ، HTS ، PSP ، LPS-D ، LPS-C) (29 –31) (مجموعة البيانات S2). للمجموعة السلبية المقابلة للعديد من الكائنات الحية (nsLLPS المواد والأساليب) ، استنتجنا توزيع الكائن الحي من مجموعة بيانات LLPS. لبناء مجموعة بيانات تحكم ، اعتبرنا الكائنات الحية المأهولة بأكثر من 1٪ في مجموعة بيانات LLPS واستخدمنا البروتينات الخاصة بها من UniProt (أنواع معينة انيقة, كلاميدوموناس رينهاردتي, ذبابة الفاكهة سوداء البطن, الانسان العاقل, موس العضلات, الجرذ النرويجي, خميرة الخميرة, Schizosaccharomyces pombe ، Xenopus laevis المواد والأساليب) وإزالة جميع البروتينات الموجودة في مجموعات البيانات LLPS أو HTS. ثم اخترنا بشكل عشوائي التسلسلات وفقًا لترددات هذه الكائنات في مجموعة بيانات LLPS بتخصيب 10 مرات (nsLLPS المواد والأساليب ومجموعة البيانات S2).

تحليل تركيبات الأحماض الأمينية لبروتينات الزبون الدافعة للقطيرات والقطيرات.

يتم إثراء البروتينات الدافعة للقطرات في المخلفات المعززة للاضطراب (P ، G ، S) ويتم استنفادها في بقايا تعزيز النظام (F ، I ، V ، C ، W) مقارنة بالبروتينات غير الفاصلة (الشكل 2).أ). N و Q ، اللذان يتميزان في المجالات الشبيهة بالبريون (32) ، أكثر وفرة في البروتينات التي تقود القطيرات من تلك التي لم يتم الإبلاغ عن خضوعها لـ LLPS. ومع ذلك ، لا يتم إثراء البروتينات الدافعة للقطيرات بشكل كبير في البقايا التي تتوسط تفاعلات - π وكاتيون - π (Y ، R) ، مقارنة بالبروتينات غير الفاصلة (nsLLPS) (الشكل 2).أ ومجموعة البيانات S3). تشير هذه النتائج إلى أن تكوين القطيرات لا يعتمد على نوع اتصال معين ولكن يمكن تحقيقه بعدة طرق من خلال تفاعلات منخفضة الخصوصية. يقع تكوين البروتينات التي تقود القطيرات بين البروتينات الكروية (33) والبروتينات المضطربة في قاعدة بيانات DisProt (33) ، وهي أكثر وفرة في المخلفات المعززة للترتيب (W ، C ، Y ، F ، I ، V) مقارنة مع البروتينات المضطربة (الملحق SI، التين. S1ب) ، ومخصب في المخلفات المعززة للاضطراب (P ، D ، E) مقارنة بالبروتينات الكروية (34) (الملحق SI، التين. S1أ). البقايا العطرية التي لوحظت في المناطق المضطربة ، على سبيل المثال في النيوكليوبورينات ، غالبًا ما تتوسط تفاعلات منخفضة التقارب (35). تعكس هذه الخصائص التركيبية تفضيل البروتينات الدافعة للقطيرات للحالة المضطربة في الشكل المرتبط ، والتي يمكن مقارنتها بمجمعات البروتين ذات أوضاع الربط غير المنتظمة (23).

تركيبات الأحماض الأمينية التفاضلية لبروتينات الزبون ومحرك القطيرات. (أ) الاختلافات في تركيبات الأحماض الأمينية (ΔAA) لبروتينات محرك القطيرات في مجموعة بيانات LLPS والبروتينات التي لم يتم الإبلاغ عنها في مرحلة منفصلة (nsLLPS). (ب) الاختلافات في تركيبات الأحماض الأمينية لبروتينات عميل القطيرات التي تتطلب مكونات إضافية لفصل الطور (مجموعة بيانات LPS-C) والبروتينات التي لم يتم الإبلاغ عنها لفصل الطور (nsLLPS). (ج) الاختلافات في تركيبات الأحماض الأمينية لبروتينات العميل القطيرات (LPS-C) والبروتينات المحركة للقطيرات (LLPS). الأحماض الأمينية مجمعة على أنها كارهة للماء (أخضر فاتح) ، عطري (أخضر) ، ماء (فيروزي) ، مشحون (أزرق صلب) ، ومحفز للاضطراب (أزرق غامق) (34). يتم عرض SEs وأهمية الاختلافات بواسطة اختبار Kolmogorov-Smirnov في Dataset S3.

بالمقارنة مع البروتينات غير الفاصلة بين الطور ، يتم إثراء بروتينات عميل القطيرات في المخلفات المشحونة (D ، K ، E) والبرولينات المعززة للاضطراب (الشكل 2).ب ومجموعة البيانات S3). تُظهر بروتينات عميل القطرة اختلافات مميزة عن البروتينات الدافعة للقطرات ، حيث يتم إثرائها في المخلفات المشحونة (K ، E) والزخارف الكارهة للماء (L ، V ، I) ، بينما يتم استنفادها في تعزيز الأميلويد (N ، Q) ، الفسفرة -تعزيز (S) ، والمخلفات المعززة للاضطراب (G) (الشكل 2ج ومجموعة البيانات S3). وبالتالي ، فإن تركيبة الأحماض الأمينية لعملاء القطيرات تشبه إلى حد كبير التركيب أكثر من البروتينات المضطربة (الملحق SI، التين. S1ب).

تحليل الانتروبيا المطابقة لبروتينات الزبون والقيادة بالقطيرات.

لاحظنا أن مجموعات بيانات البروتين المختلفة التي تمثل حالة القطرات لها خصائص مختلفة بشكل ملحوظ في الانتروبيا التوافقية في الحالة الحرة وتغيرها عند الارتباط. دوافع تكوين القطيرات (LPS-D) لديهم مستويات عالية من الاضطراب مجانًا (صد) والدول المقيدة (صDD) ، بينما يتم ترتيب عملاء القطرات (LPS-C) في الغالب في كلا الشكلين (الشكل 3 أ و ب). تُظهر البروتينات في مجموعات بيانات REV و PSP أوضاع ربط غير منتظمة ، والتي يمكن مقارنتها ببروتينات محرك القطيرات ، لذلك من المحتمل أن تنفصل طورًا تلقائيًا. البروتينات المرتبطة بالعضيات عديمة الغشاء المعروفة (UNI) أو التي تم تحديدها من خلال التجارب عالية الإنتاجية (HTS) (29) لها إنتروبيا توافقية أقل بكثير في كل من الحالات الحرة والمرتبطة ، وبالتالي من المحتمل أن تحتوي على مكونات تشكل قطرات عبر تفاعلات الشريك. مقارنة بين البروتينات التي تفصل الطور تلقائيًا وغير التي تفصل الطور (الشكل 3 ج و د) يشير إلى أن الانتروبيا عالية التوافق هي سمة من سمات حالة القطيرات.

الخصائص التوافقية في مجموعات البيانات المختلفة لبروتينات LLPS في الحالات الحرة والمقيدة. تمت مراجعة أدبيات PhaSepDB (أزرق فاتح) ، والبروتينات المرتبطة بالعضيات البشرية PhaSepDB من UniProt (الأزرق الصلب) ، وبروتينات PhaSepDB التي تم تحديدها من خلال تجارب عالية الإنتاجية (أزرق غامق) ، و PhaSePro (برتقالي) ، و LLPSDB البروتينات أحادية المكون (محركات القطيرات القمح) ، وبروتينات فصل الطور المكونة من عنصرين (عملاء القطيرات الرمادية). (أ) احتمالية الحالة المضطربة (صد) في الشكل الحر بجزء من المخلفات المضطربة ، كما تم حسابها بواسطة برنامج ESpritz NMR (36). يتم تصنيف المخلفات على أنها مضطربة إذا كان لديها درجة معرف ≥0.3089. تم حساب جزء المخلفات المضطربة لكل بروتين نهوية شخصية/نAA وتم حساب متوسط ​​هذه القيم لكل مجموعة بيانات. (ب) احتمالية الارتباط المضطرب (صDD) بواسطة برنامج FuzPred (23). المتوسط صDD تم تحديد القيمة لكل بروتين وتم حساب متوسط ​​هذه القيم لكل مجموعة بيانات. (ج و د) مقارنة بين صد و صDD في القيادة بالقطيرات (أزرق فاتح LLPS) والبروتينات غير الفاصلة للطور (nsLLPS الأزرق الداكن). تم حساب الدلالات الإحصائية بواسطة مان ويتني يو اختبار باستخدام برنامج R (**ص & lt 10 −3 ، ***ص & lt 10 −5 ، ****ص & lt 10 −10).

التنبؤ القائم على التسلسل لمحات ميل القطرات للبروتينات.

بناءً على التحليل المذكور أعلاه ، في هذا القسم ، نقدم طريقة للتنبؤ بالملف الشخصي القائم على التسلسل لميل البروتينات لتشكيل حالة القطيرات تلقائيًا (صموانئ دبي). لتحقيق هذه النتيجة ، نحدد احتمال البقايا أأنا للمشاركة في فصل الطور العفوي بواسطة صموانئ دبي (أأنا) باستخدام نموذج لوجستي ثنائي مثل p DP (A i) = exp FS (A i) 1 + exp FS (A i) ، [1] حيث FS (A i) هي وظيفة التسجيل لبقايا FS (A i) = λ 1 p D (A i) + 2 p DD (A i) + γ، [2] حيث p D (A i) هو احتمال حدوث اضطراب في الحالة الحرة و p DD (A i) هو الاحتمال للربط المضطرب (23). يحتوي p D (A i) على تقدير للإنتروبيا المطابقة في شكل غير منضم ، بينما يحتوي p D D (A i) على تقدير للإنتروبيا الملزمة. λ1 و λ2 هي المعاملات الخطية لمتغيرات التوقع و هو ثابت عددي (تقاطع) ، والتي تم تحديدها باستخدام النموذج اللوجستي الثنائي (المواد والأساليب و Dataset S4). صد مشتق من درجة الاضطراب كما تم حسابها باستخدام خوارزمية ESpritz NMR (36) ، مع أفضل أداء على مجمعات البروتين المضطربة (23). ال صDD تم التنبؤ بالقيم بواسطة طريقة FuzPred ، التي تصف أوضاع الربط في ظل الظروف الخلوية (27). ال صد و صDD تلتقط القيم التوازن بين المحتوى الحراري والإنتروبيا التي تعمل على استقرار حالة القطرة ، والتي ترتبط بالطبيعة غير المحددة لمجموعة متنوعة من تفاعلات السلسلة الجانبية.

لتدريب نموذجنا ، استخدمنا مجموعة بيانات لمناطق تعزيز القطيرات ، مع أدلة للتوسط في فصل الطور تلقائيًا (المواد والأساليب ومجموعة البيانات S1). كمجموعة سلبية ، حددنا مناطق في بروتينات غير فصل الطور بنفس توزيع الطول كما في المجموعة الإيجابية (المواد والأساليب). كان حجم المجموعة السلبية 10 أضعاف حجم المجموعة الإيجابية وقمنا بتطبيق أخذ العينات الطبقية في التدريب. وجدنا أن المعاملات الخطية كانت قوية على العديد من التحديدات العشوائية للمجموعات الإيجابية والسلبية ، بالإضافة إلى حجم مجموعة التدريب (Dataset S4). في المعلمة النهائية ، كانت المعاملات الخطية لكل من أنماط الاضطراب والربط موجبة ، مما يعكس تفضيل حالة الربط غير المنتظمة في القطرات. تم اشتقاق عتبة التوسط لتكوين القطيرات من النموذج اللوجستي الثنائي (صموانئ دبي ≥ 0.60).

لتقدير أداء الطريقة ، قمنا بحساب منطقة تحت المنحنى (AUC) بقيمة 87.0٪ على مجموعة التدريب وقيمة AUC 85.9٪ على مجموعة الاختبار (المواد والأساليب و Dataset S4). طبقنا هذه المعاملات على جميع مناطق القطرات وحصلنا على قيمة AUC تبلغ 84.4٪. توضح هذه النتائج أن المعلمات قوية عبر مناطق القطيرات من كائنات مختلفة. نلاحظ أيضًا أن ملفات تعريف الميل المعززة للقطرات للبروتينات التي لوحظ أنها تشكل قطرات في ظل الظروف الخلوية وتلك التي تم اكتشافها فقط من خلال التجارب المختبرية لا تختلف اختلافًا كبيرًا (الملحق SI، الشكل S3).

لذلك قمنا بتطوير طريقة FuzDrop للتنبؤ بميول تعزيز القطرات للمخلفات من التسلسل الأولي بناءً على الانتروبيا المطابقة لأنماط الربط غير المنتظمة في القطرات.

ملامح نزعة تعزيز القطرات لـ TDP-43 و α-Synuclein.

طبقنا طريقة FuzDrop للتنبؤ بميول تعزيز القطرات لبروتينين تم الإبلاغ عن خضوعهما لفصل الطور السائل عن السائل ، TDP-43 (37) و α-synuclein (38 ، 39). Our results indicate that the low-complexity region of TDP-43 (residues 262 to 414) mediates spontaneous phase separation. We note that the α-helical segment (residues 320 to 331), which constitutes the amyloid core in TDP-43 fibrils (40) (Fig. 4أ) and is predicted to undergo disorder-to-order transition upon binding, also has a high droplet-promoting propensity (Fig. 4أ).

Droplet-promoting propensity profiles (صDP) of the TDP-43 low-complexity (LC) domain and of α-synuclein. (أ) The TDP-43 LC domain has overall high droplet-promoting propensities. The depletion in the droplet profile corresponds to the α-helical segment (orange), which is involved in the amyloid core. The N- (lime) and C- (blue) flanking regions are disordered in the NMR structure of the G335D mutant (PDB ID code 2n4g). (ب) The disordered C-terminal region of α-synuclein (blue) is predicted to drive droplet formation. The N-terminal region (lime), which folds into an α-helix, has intermediate صDP values. The ensemble is derived from the Protein Ensemble Database (PED9AAC). ال صLLPS threshold is indicated by a bold gray line.

In the case of α-synuclein, the highly disordered C-terminal region (residues 98 to 140), which also remains disordered upon binding to lipid vesicles (41), is predicted to drive the formation of the droplet state (Fig. 4ب). The central non-amyloid beta component (NAC) region has lower صDP propensity to spontaneously phase separate, but may be involved in droplets via hydrophobic protein interactions, which are absent from β-synuclein and γ-synuclein (38).

Sequence-Based Prediction of Droplet-Driving Proteins.

In this section, we present a method of ranking proteins according to their propensity to form the droplet state. In order to achieve this result, we estimate the probability of liquid–liquid phase separation (صLLPS) using a binary logistic model (المواد والأساليب) with a scoring function (FLLPS) derived from residue droplet-promoting propensities and a term for hydrophobic interactions F L L P S = λ 1 ∗ m e d i a n < p D P ( A i ) >+ λ 2 ∗ n D P R + λ 3 ∗ H + γ , [3] where m e d i a n < p D P ( A i ) >is the median of the residue droplet-promoting propensities, n D P R is the number of long droplet-promoting regions (DPRs ≥25 consecutive residues with صDP ≥ 0.6), and ح is a hydrophobic term (≥6-residue hydrophobic motifs within disordered regions) (المواد والأساليب). λ1, λ2, and λ3 are the linear coefficients of the predictor variables and γ is a scalar constant (intercept), which we determined on the LLPSيدرب and nsLLPSيدرب datasets (المواد والأساليب and Dataset S5). We found that the linear coefficients were robust over many random selections of the positive and negative sets, as well as the training set size (Dataset S5). The threshold to mediate spontaneous liquid–liquid phase separation was derived from the binary logistic model (صLLPS ≥ 0.61). We propose that the صLLPS value expresses the droplet-driving potential under physiological conditions, as droplet-promoting propensities of proteins that form droplets under physiological conditions and those that were detected to phase separate only in vitro do not deviate significantly (SI Appendix, Fig. S2). We also note that using nonphysiological conditions, such as high concentrations of protein and crowding agents, can induce liquid–liquid phase separation at صLLPS values below the threshold, especially if droplet-promoting regions are present.

To estimate the performance of the method, we calculated an AUC value of 88.3% on the training set (0.75 of the LLPS dataset) and an AUC value of 90.7% on the test set, using stratified sampling (المواد والأساليب and Dataset S5). As an attempt to further improve performance, we incorporated a π–π term (19) into the scoring function of the logistic model (المواد والأساليب). Adding this term slightly increased the performance of the model (AUC 92.2% Dataset S5) with a moderate contribution to the scoring function. These results are in accord with the presence of π–π interactions in many droplet proteins, but also show that these interactions are not prerequisites for droplet formation.

The performance and robustness of the model (Eq. 3 and Dataset S5) demonstrate that the droplet state can be predicted from sequence based on the estimated conformational entropy of binding and a nonspecific enthalpy term. We also note that our model by Eq. 3 serves as a general framework for predicting droplet-driver proteins. Accumulating data collected using more systematic and uniform experimental approaches (8) will enable further refinement of the parameters in our model and to predict the minimum concentration for phase separation, although this property can be expected to be highly dependent on the cellular conditions.

Region Specificity of the FuzDrop Method and Experimental Validation of the Predictions.

We note that estimates of the overall propensity of a protein to form the droplet state cannot be readily obtained by a simple average of the values of the profiles of Eq. 2. This overall propensity is also determined by specific regions, rather than only by the general properties of the entire sequence, including in particular droplet-promoting regions and short motifs within disordered regions, which are prone to establish hydrophobic interactions (Eq. 3). This point can be illustrated by distinct behaviors of α-synuclein and β-synuclein (38). The C-terminal region of both proteins possesses a droplet-promoting region, with a preference for disordered binding modes (Fig. 4 and SI Appendix, Fig. S3). In addition, the NAC region of α-synuclein contains eight hydrophobic residues, biased for disordered binding, which can exert a nonspecific driving force (resembling hydrophobic collapse) for droplet formation. Notably, however, β-synuclein and γ-synuclein, which lack these residues (SI Appendix, Fig. S3), were not observed to undergo liquid–liquid phase separation under physiological conditions (38).

The predicted صLLPS values by the FuzDrop method (0.62 for α-synuclein, 0.54 for β-synuclein, and 0.40 for γ-synuclein) suggest that β-synuclein and γ-synuclein have lower propensity to adopt the droplet state as compared with α-synuclein. Indeed, γ-synuclein did not phase separate under any of the experimental conditions tested (38). To validate the predictions close to the prediction threshold, we explored β-synuclein phase behavior in a set of in vitro experiments (Fig. 5). In line with previous observations (38, 39), we did not observe any droplets after incubating high concentrations of fluorescein 5-isothiocyanate (FITC)-labeled β-synuclein on a glass surface, whereas we did observe droplets for FITC-labeled α-synuclein (Fig. 5 أ و ب). As hydrophobic effects are important for α-synuclein droplet formation and considering that β-synuclein lacks the predominantly hydrophobic segment in the NAC region, we reasoned that raising the experimental temperature would increase the strength of residual hydrophobic interactions, allowing the protein to cross the phase barrier. Indeed, β-synuclein formed micrometer-sized droplets when the temperature was raised by 10 °C and at high concentrations (Fig. 5ج). Droplets formed by FITC–β-synuclein were initially liquid-like, as evidenced by fluorescence recovery after photobleaching (FRAP), but showed rapid conversion to a gel-like state (Fig. 5ج). The phase separation behavior of β-synuclein illustrates that protein phase separation is highly dependent on the experimental conditions, that proteins with a predicted صLLPS below the threshold (صLLPS ≥ 0.61) require more extreme conditions to adopt the droplet state, and that the droplet state of these proteins is generally short-lived.

Region-specific phase behavior of α-synuclein and β-synuclein. (أ) FITC-labeled β-synuclein (صLLPS 0.54), which lacks the characteristic NAC region found in α-synuclein, does not phase separate at high concentrations (200 μM) and under crowding conditions (10% [weight/volume] PEG), whereas FITC-labeled α-synuclein (صLLPS 0.62) readily forms droplets under the same conditions. (ب) Increasing the experimental temperature by 10 °C does lead to rapid coalescence of β-synuclein into micrometer-sized droplets. (ج) Rapid FRAP of a small area within a droplet (قمة) 1 min after phase separation FRAP 3 min after phase separation (Bottom) and a nonlinear fit of fractional fluorescence recovery over time (حق). (Scale bars, 10 μm [أ و ب] and 5 μm [ج].)

As an additional test of our predictions, we ranked a set of proteins associated with Alzheimer’s disease (42) based on their predicted FuzDrop scores (Dataset S6) and selected one of the top candidates, complexin-1, to experimentally test our predictions (Fig. 6). To assess whether complexin-1 can form droplets through liquid–liquid phase separation, we incubated Alexa 488-labeled complexin-1 on a glass surface under crowding conditions at physiological pH (المواد والأساليب). After a brief lag phase (<1 min), complexin-1 formed micrometer-sized droplets in suspension (Fig. 6أ). The droplets were characteristic of a liquid phase, as they showed distinct wetting behavior after prolonged incubation (>10 min) (Fig. 6أ) and fused upon making contact (Fig. 6ب). Furthermore, molecules within the droplets showed local rearrangement, as evidenced by rapid FRAP (Fig. 6ج). We also predicted that the disordered N-terminal region of complexin-1 drives its liquid–liquid phase separation (SI Appendix, Fig. S4). This region cooperatively interacts with the SNARE complex and plasma membrane (43) to facilitate synaptic vesicle fusion (44). Phase separation may contribute to activation of complexin-1 by relieving its autoinhibition, which is a common mechanism by the droplet state (21).

Complexin-1 undergoes liquid–liquid phase separation. (أ) Alexa 488-labeled complexin-1 (10 μM) coalesces into micrometer-sized droplets under crowding conditions (اليسار). Droplets exhibit a wetting phenotype when encountering a glass surface (حق). (ب) Complexin-1 droplets readily fuse when in close proximity (<1 μm) and relax into a round structure after fusion, as noted by the arrows. (ج) Rapid FRAP of a small area within a droplet (قمة) nonlinear fit of fractional fluorescence recovery over time (Bottom). (Scale bars, 5 μm [أ] and 1 μm [ب و ج].)

Droplet-Driving and Droplet-Client Proteins in the Human Proteome.

We applied the prediction method to estimate the proteins capable of undergoing spontaneous liquid–liquid phase separation (droplet-driving proteins) in the Swiss-Prot human proteome. We thus ranked the proteins in the human proteome according to their propensity to form the droplet state (Dataset S7), and estimated that about 40% of them are capable of spontaneous droplet formation.

This list contains only about 60% of the human proteins currently associated with membraneless organelles (UNI). This fraction is even lower for proteins identified by high-throughput experiments (HTS), including organelle purification (45, 46), affinity purification (47, 48), immunofluorescence image-based screen (49, 50), and proximity labeling (51, 52) (SI Appendix, Fig. S5). As the FuzDrop approach was developed for proteins that drive droplet formation, our results indicate that membraneless organelles contain also proteins that undergo phase separation by being driven by a partner (droplet-client proteins). We observed that droplet clients have a lower conformational disorder in both free and bound states (Fig. 3), suggesting the involvement of distinguished, local motifs. Thus, the droplet-client mechanism can provide a route for structured proteins to be engaged in condensates via specific droplet-promoting regions.

To investigate the properties underlying the droplet-client mechanism, we analyzed the presence of long and short droplet-promoting regions in the droplet-driver (LLPS) and droplet-client (LPS-C) datasets (Table 1). We found that ∼90% of droplet-client proteins contain a short droplet-promoting region (≥10 residues), while only ∼60% have long ones (≥25 residues). The frequency of short and long droplet-promoting regions in proteins, identified by high-throughput experiments, is comparable to droplet-client proteins (Table 1), indicating that they follow a partner-induced client mechanism. In contrast, the frequency of droplet-promoting regions in proteins associated with human membraneless organelles is comparable to droplet drivers (Table 1). Considering their lower droplet-promoting propensities (Dataset S7), these results indicate that proteins in membraneless organelles likely follow both driver and client mechanisms.

Percentage in different datasets of proteins containing regions predicted to be droplet promoting

Overall, we thus estimate that over 80% of the proteins in the human proteome contain regions that can mediate droplet formation. Half of these proteins can condensate spontaneously, while the other half can do so by interacting with other components (Table 1). We have also observed that the number of droplet-promoting regions is comparable in proteins observed to form droplets under physiological conditions or detected by in vitro experiments (SI Appendix, Fig. S2), corroborating the relevance of the predictions under cellular conditions. We then extended these results to other organisms (Dataset S8), leading to the suggestion that the droplet state is a proteome-wide phenomenon.


Hydrophobic proteins in the body? - مادة الاحياء

Proteins have complex and dynamic shapes. The function of a protein is determined by its structure a change in the protein’s activity involves a change in some portion of the protein’s structure (shape). إذن ، ما الذي يحدد بنية البروتين و # 8217؟

Proteins are assembled as a linear chain of amino acids covalently linked by peptide bonds. As this chain is being assembled (each subsequent amino acid is added onto the free carboxy- terminus of the nascent polypeptide chain), the polypeptide chain begins to fold.

يميز علماء الأحياء 4 مستويات من بنية البروتين. يجب أن يكون الطلاب قادرين على تحديد المستويات الأربعة لبنية البروتين والقوى الجزيئية أو التفاعلات المسؤولة عن تثبيت كل مستوى من مستويات البنية.

أربعة مستويات من بنية البروتين

Primary – the linear sequence of amino acids, held together by covalent peptide bonds.

Secondary – alpha helices and beta sheets, stabilized by hydrogen bonds between peptide backbone amino groups and carboxyl groups of amino acids within the same polypeptide chain, but not immediately next to each other.

Tertiary – overall 3-D shape of the folded polypeptide chain, that can be described as the spatial relationships of the secondary structure elements linked by loops. Stabilized by various types of amino acid side chain interactions, including: hydrophobic and van der Waals interactions, hydrogen bonding, ionic bonds, covalent disulfide bonds between cysteine residues, and interactions with solvent water molecules.

Quaternary – assemblage of two or more folded polypeptides into a functional unit. Stabilized by interchain hydrophobic and van der Waals interactions, hydrogen bonding, ionic bonds, and covalent disulfide bonds between cysteine residues on different polypeptide chains.

1. The classic case exploring protein structure is hemoglobin. Functional hemoglobin is a tetramer, consisting of two alpha-globin and two beta-globin polypeptide chains. Hemoglobin also requires a cofactor, heme (also called a prosthetic group), containing an iron atom that binds oxygen.

a) What levels of protein structure does hemoglobin exhibit?

b) The most common sickle-cell disease mutation changes a glutamic acid (a negatively charged amino acid) in beta-globin to valine (a hydrophobic amino acid). Where would you most commonly expect to find a charged amino acid like glutamic acid, in the interior of the folded protein or on the surface?

c) Which of the following changes do you think might also cause sickle-cell disease?

i) the glutamic acid changes to an aspartic acid, a different negatively charged amino acid

ii) the glutamic acid changes to a lysine, a positively charged amino acid

iii) the glutamic acid changes to a tryptophan, a hydrophobic amino acid

iv) the glutamic acid changes to a serine, an uncharged, hydrophilic amino acid

d) Sickle cell hemoglobin mutations alter what levels of protein structure (when sickling of red blood cells is apparent)?

2. The most common mutation associated with cystic fibrosis causes a single amino acid, a phenylalanine, to be omitted from the protein called CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductor). The CFTR protein functions as a chloride channel in the membrane, formed as the single long CFTR polypeptide chain crosses the membrane back and forth several times. The absence of this phenylalanine, which has a large hydrophobic side chain, causes the protein to be mis-folded. This mis-folded protein is recognized by the cellular quality control system and sent to the cellular recycling center (the proteasome) only about 1 percent makes it to the proper destination, the plasma membrane. My case study is published as a blost post:

3. Microbes that live in extreme environments of temperature, salt and pH have proteins that are adapted for structural stability in these extreme environments.

Edits: 9/30/12 – replaced link to single video with 2 split videos of protein structure and sickle cell hemoglobin


المواد والأساليب

Protein Engineering.

Glu-containing variants of the Δ+PHS variant of SNase were prepared with QuickChange site-directed mutagenesis on a pET24A+ vector as described previously (9, 16). Purification was performed as described previously (33).

Thermodynamic Stability Measurements.

Stability measurements were performed with guanidinium chloride titrations using an Aviv Automated Titration Fluorimeter 105, as described previously (34). Linkage analysis of pH dependence of stability to obtain pكأ values was performed as described previously (9, 10, 12).

Optical Spectroscopy.

pH titrations monitored with CD at 222 nm or with Trp fluorescence were performed with an Aviv Automated Titration Fluorimeter model 105 and with an Aviv circular dichroism spectrometer model 215, respectively. The experiments were performed following protocols published previously (34).


Difference Between Hydrophilic and Hydrophobic

Solvents, mixtures, compounds, and particles are just some of the components of a chemist’s life. Studies involving the observance of molecule behavior in any given state or environment may seem to be one of the most brain-whacking jobs for those with little background in chemistry and related sciences, but these are very helpful in coming up with the latest products and developments in various industries.

Chemists, biologists, and other individuals pursuing a career in the field of science, start their career by attaining the necessary training from universities and colleges. When they decide to have a career related to biochemistry, their education starts with lessons that give them a deeper understanding of molecular activities and behavior.

That being said, it is safe to assume that the basic courses offered during their first year of college include an evaluation of the hydrophobic and hydrophilic nature of molecules and other particles.

The word “hydro-” means “water.” Thus, studying hydrophobic and hydrophilic molecules concerns the solubility and other properties of particles as they interact with water. The term “–phobic,” originating from “phobia,” would translate into “fearful of (water).” Hydrophobic molecules and particles, therefore, can be defined as those that do not mix with water – they repel it. On the other hand, hydrophilic molecules are those that interact well with H2O.

In other words, the distinction between hydrophobic and hydrophilic molecules is drawn by observance of the hydrophobic particles’ repellency of water and hydrophilic molecules’ attraction to water.

In a laboratory experiment, for example, one can observe that there are particular solubles that dissolve in water, and others that do not. Crushed and powdered makeup, for example, may be able to dissolve in a glass full of cooking oil, but not in a glass full of water. Salt, on the other hand, is easily absorbed by water, but it may not dissolve in oil.

Crushed and powdered makeup, therefore, can be seen as hydrophobic particles. Meanwhile, students can arrive at the conclusion that the molecules of salt are hydrophilic. Salt can keep a strong affinity in water، أي can absorb and dissolve it. On the other hand, the oil-based makeup contains molecules that repel and refuse to combine with the molecules of water.

Aside from laboratory experiments, this molecular behavior in reference to the hydrophobic and hydrophilic nature is also observed when biologists look into the permeability of cell membranes. Note that several particles may enter and exit the cell through the membrane, which is made of lipid bilayers and proteins.

When the particles are hydrophobic, a simple passive diffusion occurs, which meanس that the molecule does not need the exertion of energy to enter or exit the cell. This is because the cell membrane comes with hydrophobic components that match the molecules.

On the other hand, hydrophilic particles may need protein carriers for facilitated diffusion. This is because the components of the molecules reject those of the cell membrane.

To get a clearer understanding of this, picture a glass of water and a glass of cooking oil. When water is added to the oil, there is repulsion between the molecules. But when one puts water into water and oil into oil, no reaction will be observed.

Organic chemistry provides an explanation for this phenomenon. Note that water contains polar molecules it therefore follows that polar substances and particles get absorbed or attracted by H2O. Hydrophilic molecules are known to be polar and ionic – they have positive and negative charges, which can attract water molecules. Conversely, hydrophobic particles are known to be non-polar.

ملخص:

1.Hydrophilic means water loving hydrophobic means resistant to water.
2.Hydrophilic molecules get absorbed or dissolved in water, while hydrophobic molecules only dissolve in oil-based substances.
3.Hydrophilic molecules require facilitated diffusion, while hydrophobic molecules are suitable for passive diffusion in cellular activities.
4.Hydrophilic molecules are polar and ionic hydrophobic molecules are non-polar.


شاهد الفيديو: الحداد. 3 سكوب بروتين يعادل 25 بيضه لماذا تستطيع شرب البروتين ولا تستطيع أكل البيض (ديسمبر 2022).