معلومة

6.9: الريبوزيمات - إنزيمات الحمض النووي الريبي - علم الأحياء

6.9: الريبوزيمات - إنزيمات الحمض النووي الريبي - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ريبوزيمات

يمكن أن يكون أي جزيء يعرض أيًا من الأشكال الحفازة التي شوهدت في الفصول السابقة (الحفز العام / القاعدي ، التحفيز الكهروستاتيكي ، التحفيز النووي المحب للنووية ، التحفيز داخل الجزيء ، استقرار الحالة الانتقالية) محفزًا. يمكن أن يتم طيها لتشكيل هياكل ثلاثية الأبعاد فريدة يمكن أن يكون لها مواقع نشطة مع مجموعات وظيفية مناسبة أو "عوامل مساعدة" غير بروتينية (أيونات معدنية ، مشتقات الفيتامينات) التي تشارك في التحفيز. من المعروف الآن أن الحمض النووي الريبي ، الذي يمكن أن يشكل هياكل ثانوية وثالثية معقدة كما هو موضح في الصورة ثلاثية الأبعاد للريبوزيم من رباعي الغشاء الحراري ، يمكنه أيضًا.

الشكل: الريبوزيم من Tetrahymena thermophila ،

تسمى جزيئات الحمض النووي الريبي التي تعمل كأنزيمات ريبوزيمات. تم اكتشاف هذه الخاصية لبعض الحمض النووي الريبي من قبل سيدني ألتمان وتوماس تشيك ، الحاصلين على جائزة نوبل في الكيمياء عام 1989. على عكس إنزيمات البروتين التي تعتبر محفزات حقيقية حيث يتم استخدامها مرة أخرى ، هذا مثال على استخدام واحد الريبوزيم. الريبوزيمات الأخرى هي محفزات حقيقية ويمكن أن تقوم بتقطيع الحمض النووي الريبي عن طريق استرة (استرة) ونقل الببتيدل (في الريبوسومات). تتضمن آليات تحفيز ريبوزيم فيروس التهاب الكبد الوبائي تحفيزًا عامًا للحمض / القاعدي.

الشكل: آليات التحفيز

يبلغ طول ريبوزيم دبوس الشعر من الحمض النووي الريبي الساتلي لفيروسات النبات 50 نيوكليوتيدًا ، ويمكن أن يشق نفسه داخليًا ، أو في شكل مبتور ، يمكن أن يشق خيوط الحمض النووي الريبي الأخرى في تفاعل استرة. يتكون الهيكل من مجالين ، الجذع أ المطلوب للربط (الذاتي أو جزيئات الحمض النووي الريبي الأخرى) والجذع ب ، المطلوب للحفز. يحدث الانقسام الذاتي في ريبوزيم دبوس الشعر في الجذع A بين قاعدتي A و G (التي تنفصل عن بعضها) عندما يهاجم 2 'OH على A الفوسفور في رابطة phosphodiester التي تربط A و G لتشكيل وسيط خماسي التكافؤ.

الشكل: الانقسام الذاتي في ريبوزيم دبوس الشعر

قام Rupert & Ferr�-D'Amar� (2001) بحل التركيب البلوري لريبوزيم دبوس الشعر مع نظير ركيزة غير قابل للكسر يحتوي على a 2'-OCH3 تم استبداله بمجموعة nucleophilic 2'-OH. انظر الصغير أدناه.

دراسة حديثة أجراها روبرت وآخرون. (2002) يظهر أن A38 في Stem B يبدو أنه قادر على التفاعل مع المنتجات (المشقوق A الآن في شكل فوسفوديستر دوري مع نفسه) والمغادرة G ، وأيضًا مع حالة انتقالية تناظرية خماسية التكافؤ من AG لاطئة الرابطة التي يتم فيها استبدال الفوسفوديستر الذي يربط A و G في الركيزة بجسر فانادات خماسي التكافؤ بين A و G. ومع ذلك ، لا يبدو أن A 38 يتفاعل مع مجموعات A -G اللاطئة في الركيزة العادية ، مما يشير إلى أن الآلية الرئيسية يستخدمه هذا الريبوزيم هو ارتباط الحالة الانتقالية. نظرًا لأن جزيئات الحمض النووي الريبي تحتوي على عدد أقل من المجموعات المتاحة لتحفيز الحمض / القاعدة والكهرباء الساكنة (مقارنة بإنزيمات البروتين) ، فمن المحتمل أن تستخدم الريبوزيمات ، التي يُفترض أنها أقدم نوع من المحفز البيولوجي ، بشكل أكبر ارتباط الحالة الانتقالية كطريقة سائدة للنشاط التحفيزي.

الشكل: الموقع النشط لـ Hairpin Ribozyme: ارتباط الحالة الانتقالية

في الآونة الأخيرة ، تم تحديد التركيب البلوري لمجموعة البكتريا الأرجوانية I ذات التضفير الذاتي (التي تحفز إزالة نفسها) التي تتفاعل مع كلا الإكسونات في حالة قبل ربطها (Adams ، P. et al.). يظهر الهيكل كلا exons على مقربة. هجوم محب للنيوكليوفيلي لـ 3'OH لـ 5 'exon على فوسفات مشوه عند تقاطع intron-3'-exon. يوجد اثنان من الأيونات المعدنية على جانبي رابطة الفوسفوديستر القابلة للتغير عند تقاطع intron-3'exon ، ويتم تثبيتها في مكانها بواسطة 6 فوسفات.

تم الإبلاغ مؤخرًا عن استخدام جديد للريبوزيمات بواسطة Winkler et. آل. اكتشفوا أن الطرف 3 'من mRNA للجين glmS (من البكتيريا موجبة الجرام) الذي يشفر ميدوترانسفيراز (يحفز تكوين الجلوكوزامين 6-فوسفات من الجلوتامين والفركتوز 6-فوسفات) هو ريبوزيم. يربط موقع ارتباط الجلوكوزامين -6-فوسفات في الريبوزيم (3 'نهاية الرنا المرسال) هذا السكر ، مما يؤدي إلى التحلل الذاتي للريبوزيم. هذا يمنع ، من خلال آلية غير مؤكدة ، تشكيل الوسط الناقل من الجزء المتبقي من الرنا المرسال. قد تكون آلية تنظيم التعبير الجيني من خلال نشاط الريبوزيم شائعة.

لكي تعمل جزيئات الحمض النووي الريبي كمحفزات وناقلة للمعلومات الجينية في عالم الحمض النووي الريبي الأصلي ، يجب أن يكون للحمض النووي الريبي القدرة على التكاثر الذاتي. شيشنر وآخرون. نظر في البنية الأساسية لريبوزيم من الدرجة الأولى من ligase قادر على بلمرة الحمض النووي الريبي. تم تصنيع هذا الليجاز وتحسينه من خلال هيكل ثلاثي الأرجل يسمح بمزيد من تفاعل مذيب RNA ثم غالبًا ما يوجد في الريبوزيمات. تم العثور أيضًا على العديد من الزخارف الهيكلية الشائعة بما في ذلك GNRA-triloop و uridine-turn وزخارف pseudoknot المتغيرة للإطار. أشكال GNRA-triloop و uridine-turn هي مقاطع قصيرة مستقرة ديناميكيًا حراريًا تغطي نهاية المناطق الحلزونية. تم العثور على أنواع مختلفة من هذه في العديد من هياكل الحمض النووي الريبي على الرغم من أنها لا تبدو ضرورية للنشاط. إن شكل العقدة الكاذبة المتغيرة للإطار متطابق تقريبًا في هيكله مع العقدة الكاذبة الريبوزومية الصغيرة لتغيير الإطارات الريبوزومية ومجاورًا لعنصر جديد يسمى "ثالوث أ-ثانوي". يعتبر ثالوث A- ثانويًا مسؤولاً عن التنسيق مع Mg2 + ، على الرغم من أنه يتم إدراجه فقط بين متواليات معينة. يعمل Triphosphoguanosine (المسمى G1) عند الطرف الخامس من الريبوزيم كملف كهربائي لتفاعل ربط الحمض النووي الريبي. تحتوي الأجزاء الأخرى من الريبوزيم ، مثل J1 / 2 ، على جهات اتصال محددة للغاية توجه G1 وتسمح للحمض النووي الريبي بالثني بكفاءة أكبر. اثنين من البقايا ، السيتوزين 12 (C12) واليوراسيل 48 (U48) يرتبطان بـ Mg2 +. كما تعزز أقسام أخرى من الحمض النووي الريبي الخصوصية للمساعدة في عملية النسخ المتماثل. يشبه نموذج التحفيز والحالة الانتقالية لبوليميراز الريبوزيم نموذج بوليميراز البروتين RNA ، كما هو موضح في الشكل أدناه

الشكل: مقارنة بين نماذج الحالة الانتقالية لـ Ribozyme و Protein RNA Polymerases (بعد Schechner et al)

يعزز ثنائي التكافؤ Mg2 + في الموقع النشط من الريبوزيم ألفة النواة لـ 3-OH على التمهيدي ، والذي يربط الفوسفات الطرفي للركيزة G (1) TP لتشكيل وسيط خماسي التكافؤ. يتم تثبيت الكاتيون Mg بواسطة الأكسجين في P 29 و 30 من الريبوزيم. يعمل أيون المغنيسيوم أيضًا على تثبيت الشحنة النامية في حالة الانتقال والشحنة في الوسط. يحدث استقرار الكاتيونات ثنائية التكافؤ المماثلة في بروتين بوليميراز من خلال تغييرات الجانب Asp في البروتين.

  • دبوس الشعر Ribozyme إضافة 1HP6.pdb

Jmol: مجموعة الربط الذاتي المحدثة I intron مع كلا exons Jmol14 (Java) | JSMol (HTML5)

جمول: تحديث L1 Ligase Ribozyme Jmol14 (جافا) | JSMol (HTML5) لم يتم ؛ يصلح

  • هيكل ثلاثي الأبعاد للريبوزيم مع الموقع النشط - من معهد هوارد هيوز الطبي.

أكبر ريبوزيم - الريبوسوم

يحدث تخليق البروتين من قالب الرنا المرسال على الريبوسوم ، وهو آلة نانوية تتكون من البروتينات و RNAs الريبوسوم (الرنا الريباسي). يتكون الريبوسوم من وحدتين هيكليتين كبيرتين للغاية. تقوم الوحدة الأصغر (المسماة 30S و 40S في البكتيريا وحقيقيات النوى ، على التوالي) بتنسيق الاقتران الأساسي الصحيح للكودون الثلاثي على الرنا المرسال مع محول RNA صغير آخر ، أو النقل أو الحمض الريبي النووي النقال ، الذي يجلب حمض أميني متصل تساهميًا إلى الموقع. يحدث تكوين رابطة الببتيد عندما يرتبط جزيء حمض أميني آخر tRNA بكودون مجاور على mRNA. يحتوي الحمض الريبي النووي النقال (tRNA) على بنية ثالثة من أوراق البرسيم مع بعض الهياكل الثانوية المرتبطة بـ H-bonded intrastranded. النوكليوتيدات الثلاثة الأخيرة في نهاية 3 'من الحمض الريبي النووي النقال هي CpCpA. يتم أسترة الحمض الأميني إلى الطرف 3'OH للمحطة A بواسطة إنزيم بروتين ، aminoacyl-tRNA synthetase.

يحدث تكوين رابطة الأميد التساهمية بين الحمض الأميني الثاني إلى الأول ، مكونًا ثنائي الببتيد ، في مركز ترانسفيراز الببتيدل ، الموجود على الوحدة الفرعية الريبوسومية الأكبر (50S و 60S في البكتيريا وحقيقيات النوى ، على التوالي). يتصاعد الريبوسوم إلى أسفل mRNA لذا فإن dipeptide-tRNA موجود الآن في موقع P أو Peptide ، في انتظار حمض tRNA-amino جديد في موقع A أو Amino. يوضح الشكل أدناه مخططًا للريبوسوم مع mRNA المرتبط على الوحدة الفرعية 30S و tRNAs المرتبطة تساهميًا بالحمض الأميني (أو الببتيد المتنامي) في موقع A و P.

الشكل: مواقع Ribosme بدائية النواة - P و A.

تظهر أدناه آلية محتملة (مشتقة من الهياكل البلورية ذات الركائز المقيدة ونظائر الحالة الانتقالية) لتشكيل رابطة الأميد بين الببتيد المتنامي على الحمض الريبي النووي النقال في موقع P والحمض الأميني على الحمض الريبي النووي النقال في موقع A. لا يتضمن التحفيز أيًا من البروتينات الريبوزومية (غير موضحة) نظرًا لأنه لا يوجد أي منها قريب بما يكفي من مركز ترانسفيراز الببتيدل لتوفير الأحماض الأمينية التي يمكن أن تشارك في الحفز العام الحمضي / الأساسي ، على سبيل المثال. ومن ثم يجب أن يعمل الرنا الريباسي كإنزيم (أي أنه ريبوزيم). في البداية ، كان يُعتقد أن الأدينوزين القريب مع pKa المضطرب يمكن ، عند درجة الحموضة الفسيولوجية ، أن يُنْتَقِل / يُنَفَّس ، وبالتالي يكون بمثابة حمض / قاعدة عامة في التفاعل. ومع ذلك ، لم يتم العثور على أي منها. الآلية الأكثر احتمالية لتحقيق الاستقرار في حالة انتقال الأكسجة في موقع هجوم الكربون المحب للكهرباء هي المياه الموجودة بدقة ، والتي يتم وضعها في فتحة الأكسيان بواسطة روابط H إلى uracil 2584 على الرنا الريباسي. تتضمن آلية الانقسام طريقة خلط البروتونات المنسقة الموضحة أدناه. في هذه الآلية ، تساعد الركيزة (Peptide-tRNA) في الانقسام الخاص بها حيث أن 2'OH في وضع يسمح لها ببدء آلية مكوك البروتين. (قد تحدث آلية مماثلة لتسهيل التحلل المائي للبروتين الممدود بالكامل من الحمض الريبي النووي النقال في الموقع P). بالطبع كل هذا يتطلب تحديد موضع مثالي للركائز ، أليس هذا ما تفعله الإنزيمات بشكل أفضل؟ الآليات الرئيسية لتحفيز تكوين رابطة الببتيد بواسطة الريبوسوم (مثل الريبوزيم) هي التحفيز داخل الجزيء وتثبيت الحالة الانتقالية بواسطة جزيء الماء الموضوع بشكل مناسب.

الشكل: آلية تشكيل رابطة الببتيد بواسطة الريبوسوم

تم مؤخرًا نشر التركيب البلوري للريبوسوم حقيقي النواة (Ben-Shem et al). إنه أكبر بكثير (40٪) بكتلة حوالي 3x106 دالتون. تحتوي الوحدة الفرعية 40S على سلسلة rRNA واحدة (18) و 33 بروتينًا مرتبطًا ، بينما تحتوي الوحدة الفرعية 60S الأكبر على 3 سلاسل من الرنا الريباسي (25S و 5.8S و 5S) و 46 بروتينًا مرتبطًا. يسهل الحجم الأكبر للريبوسوم حقيقيات النوى مزيدًا من التفاعلات مع البروتينات الخلوية وتنظيمًا أكبر للأحداث الخلوية. يظهر أدناه هيكل Jmol للريبوسوم 70S البكتيري الذي يظهر تفاعلات mRNA و tRNA.


الهياكل التحفيزية الجديدة من الريبوزيم الموجود

على الرغم من أن إنزيمات البروتين ذات الأنشطة التحفيزية الجديدة يمكن أن تنشأ من السقالات الموجودة ، إلا أنه لا يُعرف الكثير عن أصل الريبوزيمات ذات الأنشطة الجديدة. علاوة على ذلك ، فإن الآليات التي تنشأ بواسطتها طيات جزيئية جديدة لا تتميز جيدًا بالبروتين أو الحمض النووي الريبي. نحن هنا نتحرى كيف يمكن أن تنشأ بسهولة الريبوزيمات ذات الأنشطة والطيات التحفيزية الجديدة من سقالة ريبوزيم موجودة. استخدام في المختبر بالاختيار ، قمنا بعزل 23 ريبوزيمات كيناز متميزة من مجموعة من المتغيرات التسلسلية لريبوزيم أصل aminoacylase. أظهر تحليل هذه الكينازات الجديدة أن الريبوزيمات ذات الطيات الجديدة والأنشطة الكيميائية الحيوية يمكن العثور عليها ضمن مسافة طفرة قصيرة من ريبوزيم معين. ومع ذلك ، فإن احتمال العثور على مثل هذه الريبوزيمات يزداد بشكل كبير مع زيادة المسافة الطفرية من الريبوزيم الأبوي ، مما يشير إلى الحاجة إلى الهروب من حظيرة الوالد.


تحدي الريبوسوم لعالم RNA

يعد عالم الحمض النووي الريبي الذي سبق العالم الحديث من عديد الببتيد وعديد النوكليوتيد أحد أكثر النماذج المقبولة على نطاق واسع في أبحاث أصل الحياة. في هذا النموذج ، قاد نظام الترجمة عالم الحمض النووي الريبي إلى علم الأحياء الموجود للحمض النووي ، والحمض النووي الريبي ، والبروتين. هنا ، ندرس فرضية RNA World في سياق المعلومات التفصيلية المتزايدة المتاحة حول أصول نظام الترجمة وتطوره ووظائفه وآلياته. نستنتج أن نظام الترجمة يمثل تحديات حاسمة لفرضيات RNA World. أولاً ، يمثل الجدول الزمني لعالم الحمض النووي الريبي مشكلة عندما يتم دمج الريبوسوم. تبدو آلية نقل الببتيدل للريبوسوم متميزة عن الإنزيمات المتطورة ، مما يشير إلى الأصول في بيئة كيميائية وليس بيولوجية. ثانيًا ، ليس لدينا دليل على أن مجموعة الأدوات الكيميائية الحيوية الأساسية للحياة تخضع لتغيير جوهري من خلال التطور الدارويني ، كما هو مطلوب للانتقال من عالم الحمض النووي الريبي إلى علم الأحياء الموجود. ثالثًا ، لا نرى أدلة محددة على الاستيلاء البيولوجي على وظيفة الريبوزيم بواسطة إنزيمات البروتين. أخيرًا ، لا يمكننا أن نجد أي أساس للحفاظ على الريبوسوم باعتباره ريبوزيم أو عالمية الترجمة ، إذا كان الأمر كذلك أن المعلومات الأخرى التي تحول الريبوزيمات ، مثل الريبوزيمات البوليمرية ، قد تم استبدالها بنظائر البروتين ومسحها من سجل النشوء والتطور. نقترح أن النموذج المحدث لعالم RNA يجب أن يعالج الحالة الحالية للمعرفة بنظام الترجمة.

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


نتائج

تأكيد الإصابة بفيروس RSV و RBSDV في شتلات الأرز

لتأكيد إصابة نباتات الأرز بالفيروسين النباتيين ، لوحظ تطور المرض. بدأت نباتات الأرز المصابة بـ SBPH والتي تؤوي RBSDV في إظهار تشوهات نمو النبات ، مثل التقزم وتغميق الأوراق. في 20 يومًا بعد الزرع (dpt) ، أظهرت هذه النباتات تشوهات تطورية أكثر خطورة. عند 60 يومًا ، أظهرت نباتات الأرز المصابة بـ SBPH المصابة بفيروس RSV اصفرار الأوراق ، والشريط ، والكلور ، ونمو النبات أبطأ (الشكل 1 أ). تم جمع الأوراق من نباتات الأرز التي تظهر عليها الأعراض من أجل RT-PCR وتحليلات النشاف الغربي للكشف عن الفيروسات المستهدفة (الشكل 1 ب ، ج). يتم عرض الأزواج المحددة من البادئات المقابلة لـ RSV و RBSDV في ملف إضافي 2: الجدول S1. أظهر RT-PCR نطاقًا محددًا بالحجم المتوقع ظهر في نباتات الأرز المصابة بـ RSV و RBSDV مقارنة بالنباتات المعالجة بالصورة ، على التوالي. أكدت هذه النتائج وتلك الخاصة بالبقع الغربية باستخدام مضادات RSV NS3 و RBSDV p10 (الشكل 1 ب ، ج) العدوى المستقلة للنباتات بالفيروسات بعد التلقيح.

مخطط تدفق للتحقيق في m 6 A مثيلة أثناء إصابة الأرز بواسطة RBSDV أو RSV. أ أعراض نباتات الأرز المصابة بـ RBSDV و RSV في دلاء بلاستيكية في 60 يومًا بعد الإصابة (dpt). النبات الأيسر هو نبات معالج ، والنباتان الأوسطان مصابون بـ RBSDV ، والنبات الموجود على اليمين مصاب بفيروس RSV. ب RT-PCR والكشف عن اللطخة الغربية (WB) لـ RSV باستخدام زوج محدد من البادئات المقابلة لـ RdRp ومصل مضاد خاص بـ NS3. تم تلطيخ البروتينات الكلية باستخدام Coomassie brilliant blue (CBB) ، والذي تم التعامل معه كعنصر تحكم في التحميل. ج تم إجراء RT-PCR و WB للكشف عن RBSDV في الأرز باستخدام زوج محدد من البادئات المقابلة لـ CP. تم إجراء مصل مضاد محدد لـ p10 لـ WB. د مخطط تدفق تجريبي لـ m 6 A-IP-seq و RNA-seq باستخدام النباتات المصابة بـ RBSDV و RSV. NGS ، تسلسل الجيل التالي. MeRIP ، الترسيب المناعي للحمض النووي الريبي الميثلي

رسم خرائط على مستوى نسخة m 6 A في الأرز

للحصول على نسخة م 6 خريطة تعديل المثيلة في الأرز ، تم استخدام عينات الأرز المصابة بالمحاكاة ، RSV ، و RBSDV لمزيد من التحليلات. تم وصف إجراءات التحليل m 6 A ، وتم الإشارة بوضوح إلى العينات التي تم استخدامها للإدخال (التحكم غير IP) ، والترسيب المناعي RNA القائم على m 6 A (m 6 A-IP) ، و RNA-seq (الشكل 1 د) ). تم إنشاء سلسلة من مكتبات IP والمدخلات و mRNA وتسلسلها ، على التوالي (ملف إضافي 2: الجدول S2). تم الحصول على عينات من مكتبات السلسلة هذه من أوراق الأرز المصابة بـ RBSDV ، و RSV ، و Mock ، و 60 dpt. تم إجراء كل علاج مع مكررين بيولوجيين. تمت معالجة بيانات التسلسل الخام بشكل أكبر من أجل إزالة قاعدة المحول منخفضة الجودة. تمت محاذاة القراءات الواضحة التي تم الحصول عليها مع الجينوم المرجعي للأرز (أرز أسيوي. IRGSP-1.0). أظهر تحليل التوزيع المقروء أن جميع عينات A-IP في m 6 تم إثرائها بدرجة عالية حول كود الإيقاف وضمن مناطق 3′ غير مترجمة (3′-UTRs) ، والتي تتماشى مع التقارير السابقة في الخلايا التائية والذرة المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية. واقترحوا أن بيانات تسلسل m 6 A-IP موثوقة وذات مصداقية عالية [6 ، 15] (ملف إضافي 1: الشكل S1). اكتشفت تحليلات m 6 A-IP-seq أكثر من 26000 م 6 قمم في كل علاج فردي وتكرار بيولوجي (الشكل 4 أ ، ملف إضافي 1: الشكل S2). تم تحديد قمم عالية الثقة لكل علاج (عدوى فيروس فردية واحدة) (ملف إضافي 2: الجدول S3). باختصار ، تم تعيين المناطق التي تداخلت في واحد على الأقل من النسختين المتماثلتين مناطق ذروة عالية الثقة م 6 أ. تم دمج القمم الواثقة من الظروف التجريبية المختلفة بشكل أكبر في خريطة ذروة فريدة م 6 أ. وبالتالي ، فإن إجمالي 26،390 و 27،038 و 26،675 فريد من نوعه قمم مع ثقة عالية (ص & lt 0.05 ، تغيير الطية & gt 1.5) للعينات المصابة بالمصابة بالعدوى الوهمية و RBSDV- و RSV ، على التوالي (الشكل 4 أ ، ملف إضافي 1: الشكل S2). بعد المقارنة مع العلاج الوهمي ، أظهرت العينات المصابة بـ RBSDV و RSV 8011 و 6603 قممًا منظمة مختلفة ، وهو ما يمثل ما يقرب من 1 م 6 أ ذروة داخل وحدات النسخ من كل جين. من بين هذه القمم التفاضلية m 6 A ، هناك 3897 و 2900 قمة جديدة ظهرت عند الإصابة بـ RBSDV و RSV ، و 4113 ، و 3702 ذروة شائعة في العينة المصابة بـ RBSDV و RSV مقارنة بالأرز المعالج بالصورة ، و 1503 تفاضل م 6 أ ظهر كل من القمم في عينة مصابة بـ RBSDV و RSV (ملف إضافي 2: الجدول S4). تشير هذه النتائج إلى أن قمم التفاضل 48.7٪ و 43.9٪ م 6 أ ظهرت حديثًا عند إصابة RBSDV- و RSV للأرز ، على التوالي ، مما يشير أيضًا إلى أن مثيلة m 6 A كانت مرتبطة ارتباطًا وثيقًا بإصابة الفيروسات بالنبات. على المستوى الجينومي ، تم توزيع هذه القمم الفريدة م 6 أ ميثيل للعلاجات الثلاثة بشكل غير متساو عبر كل كروموسوم أرز. تم أيضًا تعيين كثافة الذروة المشتركة. يتم عرض كثافة الجينات وفقًا للبيانات التي تم الإبلاغ عنها سابقًا في الشكل 2 ، وكانت كثافة توزيع الذروة m 6 A متوافقة بدرجة كبيرة مع كثافة الجينات المقابلة في نفس موضع الكروموسوم في العينة الوهمية.

قطع السيرك للميثيلوم m 6 A في نباتات الأرز المصابة بـ RBSDV أو RSV. تظهر الحلقات الست من الخارج إلى الداخل المواضع الجينومية (الأولى) ، وكثافة الجينات (الثانية) ، وكثافة الذروة لنباتات الأرز المعالجة (الثالثة) ، وكثافة الذروة لنباتات الأرز المعالجة RSV (الرابعة) ، ذروة كثافة نباتات الأرز نباتات الأرز المعالجة بـ RBSDV (الخامس) ، وكثافة الذروة الشائعة لنباتات الأرز المصابة بـ RBSDV و RSV (السادس)

انتشار م 6 مثيلة للجينوم RSV و RBSDV RNA

تم إجراء تجربة m 6 A-IP مرتين. كانت طريقة ذروة الاتصال المستخدمة صارمة (معدل الاكتشاف الخاطئ & lt 0.01). كشفت مكررتا بيانات تسلسل الجيل التالي (NGS) عن ارتباطات عالية مع RNAs المرتبطة (0.990) ، مما يشير إلى قابلية تكرار نتائج التسلسل العالية. تمت محاذاة القراءات الواضحة التي تم الحصول عليها بواسطة NGS أيضًا مع RNAs الجينومي المرجعي RBSDV و RSV ، وتم تعيين قمم m 6 A التي تغطي التسلسلات الكاملة لأجزاء مختلفة من الفيروسات (الشكل 3 ، ملف إضافي 2: الجدول S5). على وجه الخصوص ، لوحظت مجموعات من قمم m 6 A بوضوح في المحطة 5 من الجينوم RBSDV S1 و S2 و S3 و S4 و S5 و S6 و S9 و S10 ، وظهرت بعض القمم المنفصلة في S4 و S7 (الشكل 1 ب). 3 أ ، سهام حمراء). في العينة المصابة بـ RSV ، كانت مجموعات الذروة الرئيسية m 6 A موجودة على الجينوم RNA2 و RNA3 و RNA4 ، وبالمقارنة مع المدخلات ، كانت عدة قمم بوضوح m 6 A في RNA1 إلى RNA4 ، اثنان م 6 قمم تقع إلى الطرف 3 من RNA1 (الشكل 3 ب ، الأسهم الحمراء). عرضنا أيضًا قمم m 6 A الدقيقة التي تم توزيعها على كل RNAs جينومي فيروسي (ملف إضافي 2: الجدول S5) ، وقمم m 6 A الخاصة بالفيروس والتي تم توزيعها على RBSDV S5 و S6 و S9 (الشكل 3C) و RSV RNA1 و RNA2 و RNA3 (الشكل ثلاثي الأبعاد) تم اختيارها وعرضها. تشير نتائجنا إلى أن تعديل m 6 A غالبًا ما يحدث في الطرف 5′ من RNAs الجينومي لـ RBSDV ، بينما تم توزيعها عشوائيًا على جينوم RSV. ربما تكون هذه ناتجة عن خاصية اثنين من فيروسات النبات المختلفة تمامًا (RSV هو فيروس RNA أحادي الشريط ، بينما RBSDV هو فيروس RNA مزدوج الشريطة). مجتمعة ، بالإضافة إلى mRNA للنبات المضيف ، يمكن أيضًا أن تكون mRNA الفيروسية ن 6 - ميثيل أدينوسين ميثيل تحت التفاعلات بين الفيروس والأرز ، وكان نمط توزيع m 6 A على الحمض النووي الريبي الجينومي الفيروسي محددًا وجديدًا.

مؤامرات السيرك لـ m 6 A methylome في RBSDV و RSV الجينوم RNAs. أ يقرأ توزيع m 6 A الميثلي على RNAs الجينومية العشرة لـ RBSDV. ست حلقات من الخارج إلى الداخل تُظهر مواضع الجينوم (الأول) ، وتقرأ توزيع RBSDV_1_Input (الثاني) ، وتقرأ توزيع RBSDV_1_IP (الثالث) ، وتقرأ توزيع RBSDV_2_Input (الرابع) ، وتقرأ توزيع RBSDV_2_IP (الخامس) ، ومحتوى GC لـ الحمض النووي الريبي الجينومي (السادس). ب يقرأ توزيع m 6 A الميثلي على أربعة RNAs الجينومية RSV. تمت الإشارة إلى ست حلقات خارجية بشكل مشابه لـ RBSDV أعلاه. ج م 6 قمم المثيلة في الجزء الكامل من RBSDV 5 (اللوحة العلوية) ، 6 (اللوحة الوسطى) ، و 9 (اللوحة السفلية). يتم عرض مناطق الذروة التفصيلية والتعليق التوضيحي للجينات الفيروسية في الملف الإضافي 2: الجدول S6. تُظهر الأرقام العليا الطول الكامل لمقاطع الحمض النووي الريبي التي تم تحليلها ، و bp هو الاسم المختصر للزوج الأساسي. يُظهر الخط الملون باللون الأزرق منطقة الذروة m 6 A على الجينوم الفيروسي ، ويعني الرقم 1 و 2 التكرار المزدوج لتسلسل m 6 A-IP. د توزيع قمم m 6 A على RNA1 الجينومي RSV (اللوحة العلوية) ، RNA2 (اللوحة الوسطى) ، و RNA4 (اللوحة السفلية). يتم عرض مناطق الذروة التفصيلية والتعليق التوضيحي للجينات الفيروسية في الملف الإضافي 2: الجدول S6. تُظهر الأرقام العليا الطول الكامل للرنا الجينومي الذي تم تحليله ، و nt تعني النيوكليوتيدات. تتشابه العلامات الأخرى مع الشكل 3 ج

تفعيل مستويات مثيلة الأرز m 6 A RNA عند الإصابة بالفيروس

لاستكشاف التغيرات في مستويات مثيلة m 6 A RNA في الأرز المصاب بالفيروس ، تم تحليل بيانات التسلسل. بشكل جماعي ، كان هناك 15،977 و 16،854 و 16،267 م 6 جينات ميثيلية تتوافق مع الأرز المصابة بالمحاكاة ، RBSDV ، و RSV ، على التوالي (ملف إضافي 2: الجدول S6). أشارت النتائج بوضوح إلى أنه تم إثراء مثيلة الأرز m 6 A RNA تحت عدوى RSV و RBSDV. من حيث التفاضل م 6 رقم الذروة ، تمت أيضًا زيادة القمم المخصبة في الأرز المصاب بالفيروسات (الشكل 4 أ ، ملف إضافي 2: الجدول S6). وفي الوقت نفسه ، تم تحديد ثقة دلالات الذروة من خلال حساب الارتباطات بين أرقام الذروة و ص القيمة (الشكل 4 ب). البعد الإحداثي الأفقي (-log10[ف-value]) لمعظم قمم 6 م تراوحت من 4 إلى 10. أشارت النتائج إلى أن معظم القمم كانت عالية الثقة وذات مصداقية. تم اختيار قمم التفاضل m 6 A ومقارنتها مع تلك التي تم الحصول عليها لنباتات الأرز المعالجة بالصور. كان هناك 8010 و 6602 م 6 قمم فريدة ومختلفة 6 م لنباتات الأرز المصابة بـ RBSDV و RSV مقارنة بالعينة المعالجة ، على التوالي (الشكل 4C). بالنسبة للمعرض الرقمي لشدة إشارة m 6 A ، تم استخدام مخطط الكمان لإظهار توزيع إثراء الطي (الشكل 4 د). كان متوسط ​​عدد أضعاف التخصيب حوالي 40 و 76 (ملف إضافي 2: الجدول S7). لاستكشاف ثقة القمم المختلفة المودعة في العينات المصابة بـ RBSDV و RSV ، تم تحليل التوزيع المعنوي لقمم m 6 A المختلفة من خلال الارتباط مع ص- قيمة كل ذروة وعدد ذروة (الشكل 4E). ترسبت القمم التفاضلية الرئيسية المنظمة m 6 A في 3 على المحور الأفقي. أشارت النتائج إلى أن القمم المختلفة m 6 A لأرز الرنا المرسال تحت العدوى الفيروسية كانت واثقة وموثوقة. مجتمعة ، تم إثراء مستويات تعديل m 6 A للأرز mRNAs تحت الإصابة بفيروسات النبات.

تفعيل الأرز م 6 أ مثيلة عن طريق الإصابة بالفيروس. أ تُظهر الرسوم البيانية عدد الذروة الفريدة في نباتات الأرز المُعالجة بالمحاكاة و RBSDV و RSV المصابة. يمثل المحور الصادي رقم الذروة ، ويمثل المحور السيني المعالجات. ب تحليل توزيع كبير للقمم المختلفة في عينات الأرز المصابة بالمحاكاة و RBSDV و RSV. يمثل المحور الصادي رقم الذروة ، ويمثل المحور السيني القيمة السالبة للوغاريتم ص- القيمة الأساسية 10. ج رسم بياني يوضح الأعداد المختلفة المنظمة لجينات m6 A الميثيلية في الأرز المصاب بـ RBSDV و RSV مقارنةً بعينات الأرز المعالجة. د مقارنات التغيير الطي للقمم المختلفة المنظمة في نباتات الأرز المصابة بـ RBSDV و RSV. يمثل المحور Y اللوغاريتمي لقاعدة الإثراء المطوية القصوى -2. ه تحليل توزيع كبير للقمم المختلفة في عينات الأرز المصابة بـ RBSDV و RSV. يمثل المحور Y عدد القمم المنظمة المختلفة ، ويمثل المحور X القيمة السالبة للقيمة اللوغاريتمية لـ ص- القيمة الأساسية 10

رابطة m 6 A مع الجينات التي لم يتم التعبير عنها بنشاط في نباتات الأرز المصابة بالفيروس

تم إجراء التسلسل العميق للحمض النووي الريبي (عينات الإدخال) لنباتات الأرز 60 dpt من العينات المصابة بالمصادفة Mock- و RBSDV- و RSV مع مكررين بيولوجيين ، وتم استخدام كل تكرار لفحص الارتباط بين تعديل m 6 A والتعبير الجيني في أرز. كانت المسافة الإقليدية (ED) لقراءتي النسختين صغيرة ، وكان اللون المربع لهما قريبًا (الشكل 5 أ). أشارت النتائج إلى أن التجارب كانت قابلة للتكرار بين النسختين. بناءً على نتائج التسلسل الواثقة ، تم شرح قمم m 6 A لكل علاج للجينات. سميت جينات الأرز التي يمكن التعليق عليها بواسطة قمم m 6 A جين m 6 A ، والتي لا يمكن شرحها ، كانت تسمى جين non-m 6 A في التحليلات التالية. وفقًا لشظايا لكل كيلو قاعدة لنموذج exon لكل مليون جزء معين (FPKM) (ملف إضافي 2: الجدول S6) ، تم تقسيم هذه الجينات إلى ثلاث مجموعات (FPKM & lt 1 ، 1 & lt FPKM & lt 5 ، و FPKM & gt 5) ، و تم حساب نسبة عدد الجينات لكل فئة وعرضها بواسطة خريطة الحرارة (الشكل 5 ب). إما في العينة المعالجة بالصورة أو في الأرز المصاب بالفيروسات ، تم توزيع معظم الجينات التي تم تحليلها (جينات m 6 A أو non-m 6 A) بشكل أساسي في فئة التعبير المنخفض (FRKM & lt 1) (الشكل 5 ب). بالمقارنة مع العينة المعالجة بالصورة ، تمت زيادة نسبة m 6 A من الجينات الميثيلية في الفئة المنخفضة المعبر عنها من العينات المصابة بفيروس RSV و RBSDV (الشكل 5 ب). عندما تم تقسيم هذه الجينات (m 6 A و non-m 6 A) إلى جينات عالية التعبير (FRKM ≥ 1) والجينات التي لم يتم التعبير عنها بشكل كبير (FRKM & lt 1) ، ظهر التعبير عن الجينات التي كانت مرتفعة أو منخفضة في العينات المصابة بالعدوى بالمحاكاة ، RBSDV ، و RSV (الشكل 5C) ، ووجدنا أن معظم الجينات كانت غير ميثلة وموزعة في فئة التعبير المنخفض في عينات الأرز المصابة بالعدوى ، و RBSDV ، و RSV (الشكل 5C) ). تم إثراء الجينات الميثيلية m 6 A بشكل طفيف في فئة التعبير المنخفض عند إصابة الفيروسات بالأرز مقارنة بالعينة المعالجة (الشكل 5C). إما في العينات المعالجة أو في العينات المصابة بـ RSV والمصابة بـ RBSDV ، تم التعبير عن الجينات m 6 A-methylated بشكل ضعيف على مستوى أعلى من تلك الموجودة في الجينات غير الميثيلية غير m 6 A (الشكل 5 د) ، والجينات المعبر عنها بشدة عرض الجينات إشغال أقل م 6 أ (الشكل 5 ب). ومن ثم ، حدث مثيلة m 6 A بشكل رئيسي في الجينات المعبر عنها منخفضة إما في عينات الأرز المصابة بـ RSV و RBSDV وتم إثراء رقم الجين المعدل m 6 A بشكل طفيف في الفئة المنخفضة المعبر عنها عند الإصابة بالفيروسات.

تحليلات للعلاقة بين م 6 أ مثيلة مع مستويات التعبير للجين المستهدف في الأرز تحت عدوى فيروس النبات. أ معاملات المسافة الإقليدية (ED) بين ملفات تعريف التعبير الجيني الناتجة عن تحليل RNA-seq للمضاعفات البيولوجية للعلاجات الثلاثة. تم إجراء RNA-seq في وقت واحد مع m 6 A-IP-seq مع إجمالي الحمض النووي الريبي المستخرج عند 60 ديسيبلت. تعني القيمة الأقل وجود ED أقرب للكائنين المقارنين ، مع إمكانية استنساخ أعلى للنسختين المتكررتين. ب النسبة المئوية للأرز م 6 أ جينات ميثلة وغير ميثلة عند مستويات محددة من FPKM (& lt 1، 1–5، & gt 5). تشير كثافات الألوان المختلفة إلى نسب مختلفة من الجين المقابل. ج مقارنات بين عدد الجينات غير الميثيلية التي لا تحتوي على م 6 أ وعدد الجينات الميثلة في أجسامها الجينية ذات المستويات العالية (FPKM & gt 1) والمنخفضة (FPKM & gt 1) في العلاجات الثلاثة. تم اختبار العلاقات بين التعبير الجيني والرقم باستخدام اختبار خي مربع. "*" يشير ص- القيمة & lt 0.05 ، وتعني "**" ص- القيمة & لتر 0.01. د مخطط الصندوق الذي يقارن مستويات التعبير FPKM بين الجينات غير المميثل m 6 A والجينات المميثل m 6 A في العلاجات الثلاثة. طالب ثنائي الذيل غير مقيد ر - تم إجراء اختبار لحساب ص- قيم هذه العلاجات الثلاثة

جينات مختلفة منظمة م 6 أ ميثيل في نباتات الأرز المصابة بالفيروس

للتحقيق في أي الجينات المرتبطة بالمسار تمت ميثيلها m 6 A ، تم تعيين قمم مختلفة m 6 A التي تم الحصول عليها إلى الجينوم المرجعي للأرز. تم تقسيم الجين إلى 5′-UTR و 3′-UTR ومنطقة exon الأولى وإكسون باستثناء 5′-UTR و 3′-UTR في منطقة ترميز البروتين. تمت محاذاة البيانات المتسلسلة الواضحة m 6 A مع هذه العناصر الوظيفية. وجدنا أن 38 ٪ و 42 ٪ و 47 ٪ من مواقع تعديل m 6 A كانت موجودة على 3′-UTR من الجينات في القمم المصابة بـ RBSDV ، المصابة بـ RSV ، و RBSDV و RSV الشائعة ، على التوالي (الشكل. 6 أ). علاوة على ذلك ، تم إيداع 23 ٪ و 23 ٪ و 24 ٪ من مواقع تعديل m 6 A في مناطق 5′-UTR من الجينات المذكورة أعلاه (الشكل 6 أ). أشارت هذه النتائج إلى أن معظم مواقع m 6 A كانت موجودة في منطقة الجينات غير المشفرة. تم إجراء تحليلات الأنطولوجيا الجينية (GO) لتوفير نظرة ثاقبة للوظائف البيولوجية لتعديلات مختلفة في m 6 A في الأرز. كانت الجينات الميثيلية متورطة في وظائف جزيئية متعددة ، لا سيما في نشاط الارتباط والتحفيز (الشكل 6 ب). وبالتالي ، قد تعمل تعديلات m 6 A كواسمات فوق جينية تتوسط التفاعلات الجزيئية بين فيروسات الأرز والفيروسات النباتية. علاوة على ذلك ، تم إجراء تحليلات موسوعة كيوتو للجينات والجينومات (KEGG) للجينات المختلفة المرتبطة بتعديل m 6 A. كانت المسارات الخمسة المخصبة هي التمثيل الغذائي للكربوهيدرات ، والترجمة ، وطي البروتين / الفرز / التدهور ، واستقلاب الأحماض الأمينية ، ونقل الإشارة (الشكل 6 ج). these results suggested that m 6 A modification was widely involved in and closely related to the intracellular carbohydrate metabolism, amino acid metabolism, and protein translation/folding/sorting/degradation in RSV- and RBSDV- infected rice sample.

GO and KEGG analyses of different m 6 A methylated genes in RBSDV- and RSV-infected rice plants. أ Percentages of the different gene bodies (5′-UTR, 3′-UTR, 1st exon, and other exons) in different m 6 A methylated genes in rice infected with RBSDV alone, RSV alone, or with both. ب GO analysis of the different m 6 A methylated genes in rice infected with RBSDV alone, RSV alone, or with both compared with mock-treated rice plant. ج KEGG analysis of the different m 6 A methylated genes in rice infected with RBSDV alone, RSV alone, or with both

Analysis of consensus motifs related to m 6 A modifications

To investigate whether there are conserved motifs in clear sequencing reads of mock-, RBSDV-, and RSV-infected rice samples, the MEME suite software was used for من جديد scanning of the enriched motifs. In total, 172,801, 152,136, and 168,666 raw m 6 A peaks appeared in the sequencing data corresponding to the mock-, RBSDV-, and RSV-infected rice samples (Additional file 2: Table S8). When the parameter was set as the fold enrichment (FC) > 1.5 (ص < 0.05), 26,389, 27,038, and 26,675 significantly enriched m 6 A peaks were identified in mock-, RBSDV-, and RSV-infected rice samples, respectively. These significantly enriched peaks were performed to do من جديد searching of the common consensus by software. The “CGBCGKC” (B = C, G, or T K = G or T), “CGRCGVC” (R = A or G V = A, G or C), and “CGHCGDCG” (H = A, C or T D = A, G or T) motifs were enriched in mock-, RBSDV-, and RSV-infected rice m 6 A methylated reads, respectively, using the DREME suite (Fig. 7A, C, and E). MEME suite scanning revealed the enrichment of the longer conserved motifs “CSYCBCCGCCSYCGCCGCSSY”, “GCGGCGGCGRCGGCG”, and “YCGCCGCCGBCGCCG” in m 6 A methylated reads of mock-, RBSDV-, and RSV-infected rice (Fig. 7B, D, and F). Besides, the enriched top five consensus in mock-, RBSDV-, and RSV-infected rice were selected and exhibited (Additional file 2: Table S9), and results showed the dynamic of the ranking with viruses’ infection. The top four widely studied motifs in other species were selected and analyses using the DREME and MEME suites in the mock-, RBSDV-, and RSV-infected rice samples (Additional file 2: Table S10), and the results showed that the most common motifs still were “RRACH” (68%), and “URUAY” (28%). Taken together, these results implied that the common recognition mechanism of the m 6 A methylated sites during the plant-virus interaction, and viruses’ infection caused the dynamics of the top five consensus ranking.

Identification of predominant consensus motifs containing m 6 A methylation sites in mock-treated and RBSDV- and RSV-infected rice plant using DREME and MEME suites. أ Sequences logo representations of the consensus motifs containing m 6 A sites in mock-treated rice samples. ب The most enriched consensus motif in RBSDV-infected samples. ج The most enriched consensus motif in RSV-infected samples

Rice m 6 A methylation modifications display sensitive and dynamic responses to infection of rice plants by viruses

Abiotic and biotic stress, such as heat, cold, salt, and drought, and a variety of fungal, bacterial, viral, and nematode plant pathogens often affect the growth and development of rice plants, which poses a significant threat to the yield and restricts the global distribution of rice plants. In addition to the visual phenotype changes to these stresses, there are sophisticated and fine gene expression and regulation networks behind. Hence, we wondered whether mRNA m 6 A modification was involved in the interactions between rice and plant viruses. LC-MS/MS was used to track the m 6 A methylation dynamics of rice mRNA in plants infected with RBSDV or RSV. The difference in the potential epigenetic basis of the virus infection on rice plants was also investigated. Compared to the mock treatment, the ن 6 -methyladenosine level was significantly increased in RBSDV- and RSV-infected rice compared to the mock-treated sample just at the one-day-post-infection (dpi), and the FC of the m 6 A content was further increased with the infection time extended from 2 days to 16 days (Fig. 8A). These results demonstrated that the m 6 A methylation was sensitive and dynamic upon viruses’ infection. The FC of the m 6 A content in the RBSDV-infected samples was approximately 5 times higher than that in the mock-treated sample at 16 days, and 3 times higher in the RSV-infected sample (Fig. 8A). Total RNAs were extracted, then the mRNAs were isolated. Nucleic acid-based dot-blot analyses were performed. The blotting results showed that with the increase in mRNA loading, the colour reaction of virus-infected rice plants became stronger compared with the mock-treated samples (Fig. 8B). These findings indicated that the infection of plants with viruses markedly increased the ن 6 -methyladenosine level of plant mRNAs, and the ن 6 -methyladenosine level was tightly correlated with virus infection of rice plants.

Rice m 6 A methylation levels are positively associated with the expression of key genes involved in antiviral RNA silencing pathways and plant hormone signals. أ Comparisons of m 6 A methylation levels of the respect mock-treated and RBSDV- and RSV-infected rice plants at 0, 1, 2, 4, 8, and 16 dpi by LC-MS/MS. Error bars indicate mean ± SD, with three biological replicates. ب Dot-blot analysis of m 6 A levels in extracted total RNA from samples at 16 dpi using the specific anti-m 6 A antibodies. The left side of the membrane depicts the amount of loaded mRNA from mock-treated and RBSDV- and RSV-infected rice plants, respectively. ج qRT-PCR analysis of the relative expression of OsAGO18 in mock-treated and RBSDV- and RSV-infected rice plants at 0, 1, 2, 4, 8, and 16 dpi. د Relative expression of the OsSLRL1 in the three treatments at 0, 1, 2, 4, 8, and 16 dpi. ه Analysis of m 6 A methylation levels on different fragments of OsAGO18 by m 6 A-IP-qPCR. The upper panel indicates the gene structures of OsAGO18 labelled with fragments amplified in the m 6 A-IP-qPCR assay. The results of positions 1 and 12 were chosen for figure exhibition. F m 6 A-IP-qPCR assay of the m 6 A methylation levels of different fragments on OsSLRL1. Similarly, the upper panel represents the gene structures labelled with fragments amplified in the m 6 A-IP-qPCR analyses. Results of positions 2, 3, and 4 were selected for the display in the figure. Error bars denote mean ± SD, n = 3 biological replicates in all qRT-PCR assays

Correlation of m 6 A levels with expression of key genes involved in plant antiviral RNA silencing pathway and hormone metabolism

The m 6 A methylation level of rice total mRNAs was strongly correlated with virus infection of the plants (Fig. 8B). This prompted us to explore the potential molecular mechanisms. We focused on the virus infection of rice and explored whether m 6 A modifications were involved in the regulation of the key genes’ expression that related to virus infection. Based on the m 6 A-IP sequencing results (Additional file 2: Table S11), the m 6 A methylated candidate genes, ARGONAUTE 18 (OsAGO18)، و SLENDER RICE LIKE 1 (OsSLRL1), were selected. OsAGO18 was reported to participate in anti-virus RNA silencing pathways in rice by binding small interfering RNAs (siRNAs) [39]. The expression of OsAGO18 can be activated by jasmonate (JA) signalling [40]. OsSLRL1 is a DELLA family protein that regulates plant hormone metabolism and mediates the growth and development of plants [41,42,43]. qRT-PCR was performed and the relative expression levels of the selected candidate genes were determined in plants infected by the virus from 0 to 16 days. OsAGO18 was upregulated by 14-fold and 4-fold in RBSDV- and RSV-infected rice plants, respectively, compared with mock-treated plants, while the OsSLRL1 was respectively downregulated by 12-fold and 25-fold in RBSDV- and RSV-infected rice plants, respectively (Fig. 8C, D). Based on these results, we concluded that the antiviral RNA silencing pathway was activated, and the synthesis and degradation of plant hormones controlling the growth, development, and basal resistance to pathogens were regulated in virus-infected rice plants.

To validate whether the m 6 A modifications were correlated with the expression of key genes, m 6 A methylation-based RNA immunoprecipitation and qRT-PCR technology (m 6 A-IP-qPCR) was performed. The m 6 A levels in position 12 of OsAGO18, not position 1 or other regions, was increased by approximately 13-fold and 11-fold in RBSDV- and RSV-infected samples, respectively, compared with mock-infected rice plants (Fig. 8E). The m 6 A levels in positions 2 and 4 of OsSLRL1 were increased by 16-fold and 12-fold in RBSDV-infected rice plants, respectively, but not in position 3 (approximately 6-fold and not responsive to virus infection) (Fig. 8F). For RSV-infected samples, m 6 A levels in positions 2 and 4 of OsSLRL1 were not significantly changed (approximately 6- and 4-fold, respectively) under virus infection, whereas the m 6 A level was markedly up-regulated at position 3 (Fig. 8F). The collective findings indicated that changes in the relative expression of OsAGO18 و OsSLRL1 tightly correlated with the changes in their m 6 A modification level and that the m 6 A methylation of different gene regions may have different effects on its expression. These findings could contribute to a deeper understanding of the molecular basis of interactions between rice and viruses.

Involvement of rice m 6 A modification in the regulation of the expression of the main m 6 A modification machinery components in virus-infected plants

RNA m 6 A modifications occur in many eukaryotes, and it was done by the m 6 A methylation machinery. The WRITER, READER, ERASER, and methyl synthetases that produce the DONOR (methyl) are the four main components of the m 6 A methylation machinery. To investigate whether the gene expression of the main components of m 6 A methylation machinery can be affected by m 6 A modifications, qRT-PCR was performed. The relative gene expression levels of five WRITER genes (OsMAT1, OsMAT2, OsMAT3, OsMAT4، و OsFIP), five ERASER genes (OsALKBH10B, OsALKBH9B-1, Os05g0401500, OsALKBH9B-2، و Os03g0238800), 12 READER genes (OsYTH1–12), and five S-adenosyl-I-methionine synthetases (OsSAM1, OsSAM1L, OsSAM2, OsSAM2L، و OsSAM3) were determined in mock and virus-infected rice samples. The relationship between the relative expression level of target genes and m 6 A modification sites was counted by combination analyses (Additional file 2: Table S12), and no any fixed regular pattern has been found.

Compared with mock-treated samples, the OsMAT3 و OsMAT4 WRITER genes were significantly increased in RSV-infected samples, whereas they did not change in RBSDV-infected samples (Fig. 9A). For ERASER genes, the expression of OsALKBH10 was significantly suppressed in both the RBSDV- and RSV-infected samples, both Os05g0401500 و OsALKBH9B-2 were up-regulated in RSV-infected samples, whereas the expression of OsALKBH9B-2 was increased in RRSDV-infected samples (Fig. 9B). For READER genes, the expression levels of OsYTH1, OsYTH3, OsYTH5، و OsYTH7 were up-regulated in RSV-infected samples, whereas OsYTH8 was significantly decreased. Only the expression level of OsYTH6 was increased in RBSDV-infected samples (Fig. 9C). For the methyl donor producer, the OsSAM1 و OsSAM2 expression levels were significantly down-regulated in both RBSDV- and RSV-infected samples, whereas the expression of OsSAM2L و OsSAM3 in RSV-infected samples were up-regulated, and the expression of OsSAM3 was also markedly increased in RBSDV-infected samples (Fig. 9D). Based on the relative expression results, we integrated the m 6 A-IP sequencing data with the m 6 A methylation machinery in rice (Additional file 2: Table S12). Modification of m 6 A occurs in genes of m 6 A methylation machinery under plant viruses’ infection. For the donor producer, OsSAM2 was m 6 A methylated in both RBSDV- and RSV-infected samples. For the WRITER genes, OsMTA3 و OsMTA4 were m 6 A methylated in RBSDV- and RSV-infected samples, respectively. For ERASER genes, the m 6 A modification occurred on OsALKBH10B و OsALKBH9B in RSV-infected samples, whereas no ERASER genes were m 6 A methylated in RBSDV-infected samples. For READER genes, OsYTH01, OsYTH10, OsYTH11، و OsYTH12 in RBSDV-infected samples, and OsYTH05 و OsYTH08 in RSV-infected samples were m 6 A methylated (Fig. 9E). In summary, the m 6 A modifications occurred in the genes that encoding the plant m 6 A methylation machinery, and probably regulated the dynamics of the target gene expression, which may act as a main post-translational gene expression regulation strategy under plant virus infection.

Integrated analyses of the main components of m 6 A methylation machinery in rice with m 6 A methylation modifications and gene expression in plants infected with viruses. أ Relative expression levels of five “WRITER” components in rice plants by qRT-PCR analyses. ب qRT-PCR analysis of the relative expression of five “ERASER” components in rice plants. ج Relative expression levels of twelve “READER” component genes were determined by qRT-PCR. د Relative expression levels of five methyl “DONER” synthesis genes were analysed by qRT-PCR. ه Rice m 6 A methylation pathways and related m 6 A methylated genes under plant virus infections. Blue coloured letters indicate the m 6 A methylated genes of certain treatments. For instance, RBSDV: OsMTA3, means the OsMTA3 gene was methylated in RBSDV-infected sample. All qRT-PCR assays were performed with three biological replicates, and the error bars denote the mean ± SD

Involvement of rice m 6 A modification in regulating the expression of the main antiviral RNA silencing components in virus-infected rice plants

To investigate whether m 6 A methylation modification was involved in the regulation of the main host antiviral RNA silencing pathways genes and the reported resistance genes corresponding to these two viruses. Genes, which included nine DCLs, five RNA-dependent RNA polymerases (RDR), 17 ARGONAUTE genes (OsAGOs), seven RBSDV resistance genes (OsGDI homologous), and two RSV resistance genes (OsSOT1 و OsStvb-i), were selected for relative expression analyses. Integrated analyses of the antiviral genes with m 6 A modification sites on the gene body and relative expression level were determined in virus-infected rice plants.

qRT-PCR revealed that both the OsDCL2b-1 و OsDCL2b-2 were significantly up-regulated in RBSDV- and RSV-infected samples than in mock-treated samples (Fig. 10A). In addition, the expression of OsDCL1b was greatly suppressed in RBSDV-infected samples, whereas it was increased in RSV-infected samples (Fig. 10A). Compared to the mock-treated samples, the expression of OsRDR1 و OsRDR3 in both RBSDV- and RSV-infected samples was markedly increased, and OsRDR2 was upregulated only in RSV-infected samples (Fig. 10B). In RBSDV-infected samples, only the expression of OsAGO18 was up-regulated significantly (Fig. 8C), whereas in the RSV-infected samples, OsAGO5c, OsAGO12, OsAGO13, OsAGO14, و OsAGO18 were markedly increased (Figs. 8C and 10C). Concerning resistance genes, seven ZmRabGDI (Rab GTPase dissociation inhibiter) homologous genes in rice, which were defined as RBSDV resistance genes on maize [44], were screened out. The RSV resistance genes OsSOT1 (Sulfotransferase 1) [45] and OsStvb-i (Stripe disease resistance i) [46], were also chosen. A total of nine genes were selected for further gene expression analyses. OsGDI-1-1, OsGDI-1-2, OsGDI-2، و OsSOT1 were significantly decreased both in RBSDV- and RSV-infected rice plants compared to that in the mock-treated sample (Fig. 10D). فى المقابل، OsGDIα was markedly upregulated in RBSDV- and RSV-infected rice plants (Fig. 10D). The collective findings indicated that OsDCL2b-1, OsDCL2b-2, OsRDR1, OsRDR3, OsAGO12, OsAGO13، و OsAGO18 were the main antiviral genes in the innate immune RNA silencing pathways, and that OsGDIα, OsGDI-1-1, OsGDI-1-2, OsGDI-2، و OsSOT1 may act as resistance genes for both RBSDV and RSV.

Integrated analyses of main antiviral RNA silencing pathway-related genes with m 6 A methylation modifications and gene expression levels in rice infected with viruses. أ Relative expression levels of nine OsDCL genes in mock-treated and RBSDV- and RSV-infected samples. ب Relative expression levels of five OsRDR genes in mock-treated and RBSDV- and RSV-infected samples using qRT-PCR analyses. ج Relative expression levels of 17 OsAGO genes were determined with respect to mock-treated and RBSDV- and RSV-infected samples using qRT-PCR analyses. د Relative expression levels of nine resistance genes, including seven OsGDI genes, one OsSOT1 gene, and one OsStvb-i were determined in mock-treated and RBSDV- and RSV-infected samples using qRT-PCR analyses. ه Rice antiviral RNA silencing pathways and the related m 6 A methylated genes in virus-infected plants. Blue coloured letters depict the m 6 A methylated genes of a certain treatment, as detailed in Fig. 9E. All qRT-PCR assays were performed with three biological replicates. The error bars denote the mean ± SD

To analyse the potential roles of m 6 A methylation in the expression of 57 selected genes in RNA silencing pathways and viral resistance genes, we systematically analysed their m 6 A modification status according to the results of m 6 A-IP-seq (Additional file 2: Table S13). For the main RNA silencing pathway genes, OsAGO1c, OsAGO2, OsAGO18، و OsRDR1 were m 6 A methylated in RBSDV-infected rice. In RSV-infected samples, OsDCL1a, OsDCL3b, OsDCL4, OsAGO2, OsAGO12, OsAGO5c, OsAGO17, OsAGO18, OsRDR1، و OsRDR3 were significantly methylated (Fig. 10E). In contrast, no viral resistance genes were m 6 A methylated (Fig. 10E). These results indicated the possible involvement of m 6 A methylation in the main antiviral RNA silencing pathways. The methylation may act as a fine regulator to mediate the spatial and temporal expression of target genes in arm race of plant-virus interaction.

Integrated analyses of relative expression profile and m 6 A modification of seven phytohormone metabolism-related genes

Viruses have various strategies to reprogram the host’s cellular status to one that is prone to viral replication and spread. In plants, the specific environment created by viruses usually refers to phytohormone regulations of nearly all aspects of plant physiology, including development, growth, defence, and reproduction [47]. These phytohormones, which include jasmine acid (JA), salicylic acid (SA), abscisic acid (ABA), auxin, cytokinin (CTK), ethylene (ET), and brassinosteroids (BR), have significant roles in plant development and physiological regulations and are also involved in defence against pathogens [48, 49]. Previous findings suggest that phytohormones are strongly associated with virus infection and symptom development. We investigated whether these phytohormones are regulated by m 6 A modification and whether the expression profiles of their metabolic genes are altered by virus infection of rice plants. qRT-PCR was performed to determine the relative expression of the seven main phytohormone metabolism-related genes (Additional file 1: Fig. S3–S9). Further, integrated analyses of their relative expression and m 6 A modification sites were performed (Additional file 1: Fig. S10, Additional file 2: Table S14).

For the JA pathway, the biosynthesis genes OsLOX8 و OsLOX9 were markedly up-regulated in both RSV- and RBSDV-infected plants. OsJMT1-1, OsAOS2، و OsLOX2 were markedly decreased, whereas OsAOS1 و OsLOX5 were not changed (Additional file 1: Fig. S3A). بالإضافة الى، OsJMT1, OsLOX1، و OsHPL3 were decreased in RSV-infected samples, whereas OsJMT1 was increased in RBSDV-infected plants (Additional file 1: Fig. S3A). The expression profiles of 21 JA responsive genes were further investigated. OsPR1a, OsWRKY28, OsPR2، و OsPR5-4 were significantly increased in both RSV- and RBSDV-infected plants, OsPR5-3, OsMYB2, OsMYB55/56-1, OsWRKY10, OsRbohA, OsRbohB، و OsRbohC were markedly decreased, and OsPR1b, OsPR5-2, OsbZIP52، و OsRbohE were not changed. OsPR5-1 و OsPR1 were increased in RBSDV- and RSV-infected rice, respectively (Additional file 1: Fig. S3B and S3C). These results indicated that the activated JA pathways mainly depend on the markedly increased expression of biosynthesis-related OsLOX8 و OsLOX9, and the up-regulated OsPR1a, OsWRKY28, OsPR2، و OsPR5-4 responsive genes.

For the SA pathway, we investigated the biosynthesis-related genes OsICS1, OsPAL, OsPAL1, OsAIM1, OsCM، و OsEDS1) and the response genes (OsPR1-101, OsWRKY45-1, OsWRKY45-2, OsSGT1, OsPR1b, OsPR1a, OsPR1-12, OsPR1-21, OsPR1-22, OsPR1-51، و OsPR1-121). OsICS1, OsPAL، و OsPAL1 were significantly suppressed in both the RBSDV- and RSV-infected plants, OsCM و OsEDS1 were not altered, and only OsAIM was slightly up-regulated in RSV-infected plants (Additional file 1: Fig. S4A). These results indicated that SA biosynthesis was suppressed upon virus infection. OsWRKY45-1, OsWRKY45-2، و OsRR1-51 were significantly increased in both the RBSDV- and RSV-infected plants, whereas the OsSGT1, OsPR1-21, OsPR1-22، و OsPR1-121 were dramatically decreased. OsPR1-101 و OsPR1a were markedly up-regulated in RSV-infected plants but significantly down-regulated in RBSDV-infected plants (Additional file 1: Fig. S4B and S4C). These results suggested that the SA pathway was suppressed by virus infection through down-regulation of the main biosynthesis genes.

For the ABA pathway, qRT-PCR revealed that OsNCED3 was significantly up-regulated in RBSDV-infected samples, whereas in RSV-infected plants, OsNCED1-1 was up-regulated. OsABA was suppressed in both RBSDV- and RSV-infected plants. Other biosynthesis-related genes, including OsABA1, OsbZIP72، و OsbZIP23, were unchanged in RBSDV- and RSV-infected plants (Additional file 1: Fig. S5A). ABA deactivation genes OsABA8OX1, OsABA8OX2، و OsABA8OX3 were significantly up-regulated in RBSDV-infected plants. In RSV-infected plants, OsABA8OX2 و OsABA8OX3 were slightly decreased (Additional file 1: Fig. S5B). The collective results indicated that the ABA pathway was activated by RBSDV infection, but was suppressed in RSV-infected plants.

For the Auxin pathway, the relative expression levels of auxin-related metabolic genes were affected differently by virus infection. Of the analysed biosynthesis genes, OsYUCCA1, OsYUCCA5, OsYUCCA6, OsYUCCA9, OsAO-2, OsAO3-L، و OsAOO3-2 were significantly down-regulated upon RBSDV and RSV infection, whereas OsYUCCA8, OsAO-1, OsAAO، و OsAAO3-1 were up-regulated (Additional file 1: Fig. S6A). ال OsGH3.8 و OsGH3.2 auxin transformation genes were markedly increased in both RBSDV- and RSV-infected plants (Additional file 1: Fig. S6B). ال OsPIN1A, OsPIN1B, OsPIN2, OsPILS7a، و OsPILS7b auxin transportation genes were markedly down-regulated in RBSDV- and RSV-infected plants (Additional file 1: Fig. S6C), while only OsPIN3A was increased (Additional file 1: Fig. S6D). ال OsIAA3 and OsIAA7 signalling genes were markedly decreased in both RBSDV- and RSV-infected plants (Additional file 1: Fig. S6E). The other signalling gene (OsIAA20) was significantly up-regulated in RBSDV-infected samples, whereas it was severely suppressed in RSV-infected plants (Additional file 1: Fig. S6E). These results showed that the auxin pathway was suppressed in both RBSDV- and RSV-infected plants.

For the CTK pathway, genes responsible for CTK biosynthesis, including OsIPT3 و OsIPT7, were dramatically decreased in both RBSDV- and RSV-infected plants (Additional file 1: Fig. S7A). In contrast, the CTK transformation genes or oxidase genes (OsCKX4 و OscZOGT1) were significantly up-regulated in both RBSDV- and RSV-infected plants (Additional file 1: Fig. S7B). ال OsPR8, OsPR10a-1, OsPR1a-1, OsPR1b، و OsPR10a-2 CTK responsive genes were markedly increased in both RBSDV- and RSV-infected plants (Additional file 1: Fig. S7C & S7D). Most of the analysed genes (OsPR2-1, OsPR2-2, OsPR3, OsPR4, OsPR5-1، و OsPR6) were suppressed (Additional file 1: Fig. S7D). Other responsive genes, which included OsPR1a-2, were dramatically upregulated in RBSDV-infected samples, but not in RSV-infected samples. The expression profile of OsPR9 was completely opposite (Additional file 1: Fig. S7D). These results showed that the CTK pathway in rice was suppressed by viral infection.

For the ET pathway, the OsACS2 biosynthesis gene was significantly up-regulated in both RBSDV- and RSV-infected plants, as was OsACS1 in RBSDV-infected plants (Additional file 1: Fig. S8). Most of the oxidase genes (OsACO7, OsACO1، و OsACO2) were dramatically decreased in both the RBSDV- and RSV-infected plants (Additional file 1: Fig. S8). The collective results indicated that the ET pathway was activated in rice upon virus infection.

For the BR pathway, 24 genes, including 14 biosynthesis-related genes and 10 signalling genes, were analysed. Most of the biosynthesis genes (OsD11, OsDS11-L, OsCPD1, OsGSK2, OsRAV1, OsRAV2, OsRAVL1، و OsBZR1) were markedly suppressed in both RBSDV- and RSV-infected plants, whereas OsDWARF4 was significantly up-regulated (Additional file 1: Fig. S9A). The four signalling genes (OsBRI1-1, OsBRI1-2, OsBAK1-4، و OsBAK1-10) were dramatically decreased in RBSDV- and RSV-infected plants. The other four genes (OsI-BAK1, OsBAK1-2, OsBAK1-3، و OsBAK1-8) were severely downregulated, and two genes (OsBAK1-6 و OsBAK1-9) did not change (Additional file 1: Fig. S9B). The expression profiles of these genes were synchronously changed in the RBSDV- and RSV-infected plants. These results suggested that the BR pathway was suppressed in rice plants upon virus infection.

Seven phytohormone metabolism-related genes, including 154 genes, were analysed by qRT-PCR (Additional file 1: Fig. S10A). Of these genes, m 6 A modification was detected in 37 and 19 genes in RBSDV- and RSV-infected samples, respectively. m 6 A methylation was detected in nine genes in RBSDV- and RSV-infected plants (Additional file 1: Fig. S10B, Additional file 2: Table S14). m 6 A-IP-sequencing data mapped these m 6 A methylation sites to different regions of target genes. Most of the peaks were located in the coding sequence (CDS) region (Additional file 1: Fig. S10C). Furthermore, we analysed the relationship between m 6 A methylation sites on gene bodies and the relative gene expression levels. In most cases, the target gene was downregulated if the m 6 A site was located in the 5′-UTR, CDS, and CDS/3′-UTR, with the location in the 3′-UTR often being associated with up-regulation of the target gene (Additional file 1: Fig. S10D). Hence, a viral infection could regulate the expression of target genes, and the regulation mode was varied in different manners for the same genes under the two different viral infection conditions.

Widely integrated analyses of the relationship between m 6 A methylation regions and expression levels using RNA-seq and m 6 A-IP-seq

To investigate the relationship between the location sites of m 6 A methylation and the relative expression profiles, we analysed the common regulated peaks that appeared in both the RBSDV- and RSV-infected plants. We classified the reads that extended 5′-UTR to the start codon (5′-UTR/CDS), reads that extended the stop codon to the 3′-UTR (CDS/3′-UTR), and other reads that did not go beyond two obviously distinct regions to the corresponding 5′-UTR, CDS, or 3′-UTR (Additional file 2: Table S15).

In total, 3,734 and 3,336 peaks were analysed in RBSDV- and RSV-infected plants, respectively (Additional file 1: Fig. S10E and S10F). In RBSDV-infected plants, the relative expression level of 44.45% m 6 A modified genes was not changed, 29.73% were downregulated, and 25.82% were up-regulated. Most m 6 A sites were located in the CDS and 3′-UTR regions (Additional file 1: Fig. S10E). The number of genes that were upregulated, downregulated, and unchanged were increased gradually when the m 6 A methylation occurred in the 5′-UTR/CDS and CDS/3′-UTR region (Additional file 1: Fig. S10E). In RSV-infected plants, the majority of m 6 A modified genes (69.04%) were downregulated. Most m 6 A sites (49.34%) were located in the CDS region and 3′-UTR. CDS and 3′-UTR location of the m 6 A modified sites often indicated that the target genes were downregulated (Additional file 1: Fig. S10F), and the m 6 A methylation was mostly occurred in CDS and 3′-UTR region in both RSV- and RBSDV-infected samples. Taken together, these results indicated that the regulatory roles of post-transcriptional m 6 A modification differed upon RBSDV or RSV infection of rice plants and that certain m 6 A sites on specific genes may have specific functions. The common regular pattern between expression level and m 6 A methylation region, which are suitable for all m 6 A methylated genes, have not been found so far. This may be due to the fact that different viruses cause plant disease through hijacking different host’s signal pathways, and different genes own different sequences characteristics.


An RNA World?

  • DNA encodes the genetic information of proteins but
  • DNA replication and transcription requires proteins.

But if RNA can serve both as a

  • repository of information (in its sequence of nucleotides) and as a
  • catalyst,
  • involve RNA acting on RNA (not protein)
  • and (except for Ribonuclease P) are self-limited.

Yes, the ribosome turns out to be a ribozyme.

The Ribosome is a Ribozyme

Ribosomes are huge aggregates containing 3 (4 in eukaryotes) الرنا الريباسي molecules and scores of protein molecules.

The three-dimensional structure of the large (50S) subunit of a bacterial ribosome was published in August 2000. It clearly shows that formation of the peptide bond that links each amino acid to the growing polypeptide chain is catalyzed by the 23S RNA molecule in the large subunit. The 31 proteins in the subunit probably provide the scaffolding needed to maintain the three-dimensional structure of the RNA.

Link to discussion of ribosome structure and function.

RNA polymerization by RNA

In today's world, RNA polymerases &mdash made of protein &mdash make the RNA molecules (using the antisense strand of DNA as a template [View]). Could RNA alone have done it?

It can be done in the laboratory. Wochner, A. et al. report in Science, 332:209, 8 April 2011, their creation of a synthetic RNA molecule that when presented with single-stranded RNA templates, polymerizes ribonucleotide triphosphates into strands of RNA complementary to the template. Their synthetic RNA polymerase was able to faithfully incorporate up to 95 nucleotides into complementary strands of RNA. One product was a functional endonuclease ribozyme. (By the autumn of 2013, they were able to copy a template of 206 nucleotides.)


More on RNA Catalysis

With the discovery nearly thirty years ago that RNA can catalyze reactions with proficiencies that approach those of protein enzymes, the central dogma of biology with RNA as a simple carrier molecule between DNA and proteins was overturned. Today RNA is recognized as an active catalyst in biology, in self-splicing of group I and group II introns, in various small ribozymes, and also as the catalytic center of the ribosome and spliceosome. These findings, and the fundamental ability of RNA to act both as an efficient information carrier and functional macromolecule led to proposal of an RNA World early in evolution.

We explore RNA catalysis to learn about the catalytic potential of RNA and to decipher what is fundamental to all biological catalysts through comparison with protein enzyme catalysis.

These studies also define the unique properties of RNA and proteins lead to catalytic and behavioral distinctions.

The fundamental properties and behaviors of RNA molecules that we uncover teach us about how the potential function of RNA early in evolution and about the function of RNA molecules in modern-day biology. This knowledge may also be applied as RNA is co-opted for medical, technological and industrial applications.

Energy from binding interactions can be used to facilitate reactions of bond substrates, a fundamental precept of enzymology posited by Jencks for protein enzymes and demonstrated in our studies of RNA enzymes.

We currently focus on the group I ribozyme, the most well-studied catalytic RNA in both structure and function. We harness previous studies, including multiple crystal structures, a robust phylogeny model, and a defined kinetic and thermodynamic framework for the Tetrahymena group I ribozyme, to delve more deeply into questions about catalytic RNA and, in particular, how an RNA scaffold can be used to sculpt an active site and how RNA achieves specific and strong molecular recognition.

We are also very interested in RNA conformational changes, as these transitions are key elements in nearly all RNA-mediated events.

Nearly all RNA-mediated events incolve conformational changes. We can learn about these transitions from studying catalysis and folding in model systems.

To answer these and additional questions, we use techniques including site-directed mutagenesis and site-specific chemical modifications to alter both the ribozyme itself and its substrates. The replacement of single functional groups within a complex RNA structure with multiple related functionalities is straightforward, whereas the corresponding replacements in proteins remain challenging. Function is probed via pre-steady state kinetics, and structure is probed using a battery of chemical footprinting approaches. Recent advances allow us to incorporate probes of local dynamics and single molecule fluorescence assays of functional conformational transitions as well as carry out high-throughput structure-function studies.

Finally, our collaboration with the Greenleaf lab allows us to now simultaneously probe thousands of mutants, allowing for the first time the depth and breadth of information needed to understand how an RNA scaffold established a functional active site.


شاهد الفيديو: ثالث ثانويأحياء الحمض النووي RNA (قد 2022).